張 璐，王雅芬，葉亞婷，白 倩，郭長(zhǎng)梅

0引言

視網(wǎng)膜血管疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)和視網(wǎng)膜靜脈阻塞等以異常增生的視網(wǎng)膜新生血管為主要病理表現(xiàn)。在該類病變中，均有不同程度的視網(wǎng)膜血管損害導(dǎo)致的血管閉塞，進(jìn)一步引起視網(wǎng)膜缺血而促進(jìn)異常視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)的增生[1]。RNV異常的細(xì)胞組成損害血視網(wǎng)膜屏障，血管的脆性增加易導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血、滲出、玻璃體腔出血甚至纖維血管增殖牽拉致視網(wǎng)膜脫離，使視力惡化甚至喪失[2]。現(xiàn)多以激光光凝、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物或手術(shù)治療[3]，但均有不同程度的限制性和并發(fā)癥。近年來(lái)有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通過(guò)旁分泌作用釋放的外泌體(exosomes, Exo)可有效降低氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型小鼠(oxygen-induced retinopathy, OIR)視網(wǎng)膜缺血的嚴(yán)重程度。本文闡明了BMSCs及其衍生Exo-miRNA對(duì)RNV形成的作用及機(jī)制。

1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和外泌體及外泌體源性miRNA概述

1.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞概述間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種來(lái)源于骨髓、脂肪、臍帶和胎盤組織，以炎癥分解、傷口愈合和維持具有高異質(zhì)性的內(nèi)穩(wěn)態(tài)而聞名的祖細(xì)胞[4]，具有塑性黏附性和多譜系分化特性，而且還能表達(dá)特定的表面標(biāo)記[5]。被認(rèn)為在疾病治療方面極具潛力，但近來(lái)研究表明，玻璃體腔內(nèi)直接注射MSCs可能誘導(dǎo)正常和病變視網(wǎng)膜的血管擴(kuò)張、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，這表明使用干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜疾病存在一定風(fēng)險(xiǎn)[6]。然而其旁分泌效應(yīng)產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)和免疫抑制因子等，能夠通過(guò)血視網(wǎng)膜屏障而無(wú)明顯免疫、炎癥反應(yīng)，可以作為葡萄膜炎、青光眼、視網(wǎng)膜和眼表疾病細(xì)胞治療的新型治療藥物[7]。因此，在新生血管性視網(wǎng)膜疾病中，BMSCs對(duì)損傷視網(wǎng)膜的旁分泌營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)可能是一種比直接細(xì)胞治療視網(wǎng)膜功能障礙更安全有效的方法[8]。

1.2外泌體概述Exo是細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，以旁分泌等途徑到達(dá)受體細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞表面結(jié)合蛋白或膜融合傳遞物質(zhì)的一類直徑約為30～100nm的膜性囊泡[9-10]。其來(lái)源和分布廣泛，可由多種細(xì)胞所分泌。Exo的內(nèi)容物豐富，含有細(xì)胞因子、蛋白、RNA、miRNA和脂質(zhì)等，參與了如免疫應(yīng)答、細(xì)胞間通訊、蛋白質(zhì)和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理過(guò)程，是一種重要的細(xì)胞間物質(zhì)和信息交流的工具[11-12]。

1.3外泌體源性miRNA概述MicroRNA是一種小分子量單鏈非編碼RNA，可以通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解來(lái)下調(diào)靶基因的表達(dá)，作為負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因而促進(jìn)生理和病理血管生成[13-14]。Exo對(duì)疾病的作用與miRNA有著密切的關(guān)系。心肌缺血等疾病中，BMSCs分泌包含有miR-125b的Exo可通過(guò)靶向SIRT7途徑保護(hù)心肌細(xì)胞以免受缺血再灌注損傷[15]。卵巢疾病中，攜帶有miR-644-5p的BMSCs-Exo通過(guò)靶細(xì)胞的p53來(lái)改善卵泡形態(tài)、抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，對(duì)卵巢功能早衰恢復(fù)卵巢功能具有潛在治療效果[16]。同樣，Exo在眼部疾病中的作用與miRNA的重要關(guān)系也已被證實(shí)。青光眼中，BMSCs衍生的Exo對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell, RGC)及軸突的神經(jīng)保護(hù)作用，正是通過(guò)Exo成功地將多種miRNA遞送到視網(wǎng)膜內(nèi)層，與效應(yīng)分子Argonaute-2相互作用促進(jìn)RGC的存活及其軸突的再生[17]。

已有研究表明，腫瘤細(xì)胞的Exo能夠調(diào)控免疫功能、促進(jìn)腫瘤血管新生和侵襲而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18-19]。由于腫瘤形成發(fā)展過(guò)程伴隨著含miRNA的Exo向胞外基質(zhì)的釋放，并且在所有的生物體液中幾乎均可發(fā)現(xiàn)由各類細(xì)胞衍生的Exo，使它們作為微創(chuàng)性液體活檢的一種方式極具吸引力[20]。如體循環(huán)Exo-miR-21升高與膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌有關(guān)，尿源性Exo-miR-21升高與膀胱癌和前列腺癌有關(guān)[21]。因此，對(duì)體液中Exo及Exo-miRNA的檢測(cè)將為腫瘤的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的方式[22]。與腫瘤類似，新生血管性視網(wǎng)膜疾病中，也有血管異常增生的現(xiàn)象，且在眼部疾病中，Exo及Exo-miRNA越來(lái)越被認(rèn)為是調(diào)節(jié)視覺(jué)系統(tǒng)中細(xì)胞間通信的重要因子，并且現(xiàn)在正作為生物標(biāo)志物、治療劑和藥物遞送載體被廣泛探索[23]。

由于目前眼科研究中，視網(wǎng)膜新生血管形成相關(guān)研究大多以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)作為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的替代，故本文通過(guò)介紹BMSCs來(lái)源Exo-miRNA對(duì)HUVECs的作用，說(shuō)明在視網(wǎng)膜血管疾病中可能的作用及機(jī)制。

2 BMSCs調(diào)控新生血管形成的作用及機(jī)制

2.1BMSCs直接調(diào)控新生血管形成既往已有研究證實(shí)BMSCs釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、IL-6等血管生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)新生血管形成[24]。對(duì)比骨髓和人胎盤來(lái)源MSCs條件培養(yǎng)基中的血管生長(zhǎng)因子，可見(jiàn)BMSCs來(lái)源培養(yǎng)基中，VEGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白IGFBP2和IGFBP6的水平明顯較高[25]。Hou等[26]已證明了BMSCs在眼內(nèi)對(duì)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)病變所產(chǎn)生的影響，缺氧誘導(dǎo)miR-188-5p的降低直接上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達(dá)促進(jìn)BMSCs等骨髓來(lái)源干細(xì)胞向CNV病變發(fā)生處遷移，從而促進(jìn)了脈絡(luò)膜中病理性新生血管的形成而增加CNV病變的嚴(yán)重程度。

2.2巨噬細(xì)胞介導(dǎo)BMSCs調(diào)控新生血管形成BMSCs還可在巨噬細(xì)胞的介導(dǎo)下促進(jìn)新生血管形成。BMSCs可在M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)VEGF和趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)等細(xì)胞因子介導(dǎo)下發(fā)生動(dòng)員、遷移并募集至缺氧的視網(wǎng)膜中，進(jìn)一步分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等血管細(xì)胞及結(jié)締組織細(xì)胞促進(jìn)新生血管形成，而參與RNV的形成[27-28]。

去除OIR小鼠模型玻璃體內(nèi)的巨噬細(xì)胞可減緩RNV病變程度，表明缺血缺氧引發(fā)的病理性新生血管與巨噬細(xì)胞的聚集有關(guān)[29]。OIR小鼠模型中，在該過(guò)程中起主要作用的色素上皮衍生因子(PEDF)是一種天然的病理性血管生成抑制劑，通過(guò)調(diào)節(jié)MAPKs的磷酸化來(lái)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化。MAPKs的激活影響M2型巨噬細(xì)胞極化，而Notch1途徑影響M1型巨噬細(xì)胞極化，雖然M1和M2型巨噬細(xì)胞在體內(nèi)外均可促進(jìn)新生血管形成，但與HUVECs的共培養(yǎng)中，M2型巨噬細(xì)胞在促進(jìn)細(xì)胞增殖中更具潛力[30]。對(duì)比M1和M2型巨噬細(xì)胞與人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖程度和管腔形成的提高效果，可見(jiàn)M2型巨噬細(xì)胞增加的程度更為顯著[31]。

除自身促進(jìn)血管生成的效應(yīng)外，M2型巨噬細(xì)胞還可在缺氧條件下促進(jìn)BMSCs的遷移和分化。將BMSCs注射入心肌中，鄰近BMSCs的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M2標(biāo)記物精氨酸酶-1(Arg1)的強(qiáng)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)BMSCs共培養(yǎng)骨髓源性巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等M1標(biāo)志物明顯減少，Arg1等M2標(biāo)志物顯著增加[32]。用M2型巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，可檢測(cè)到SDF-1、CXCR4、VEGF和MMP-9的表達(dá)增高，表明M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在促進(jìn)BMSCs的遷移分化，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3 BMSCs-Exo調(diào)控新生血管形成的作用及機(jī)制

近年來(lái)研究表明，在心血管疾病中，內(nèi)皮細(xì)胞功能改變?cè)诩膊“l(fā)展不同階段起關(guān)鍵作用[33]。該進(jìn)程由BMSCs通過(guò)旁分泌釋放Exo調(diào)控，BMSCs-Exo在體外促進(jìn)HUVECs的管腔形成，而且在心肌梗死小鼠模型中，也具有增強(qiáng)心臟血管密度和募集心臟祖細(xì)胞能力[34]。另外，BMSCs-Exo可通過(guò)調(diào)控miR-494等miRNA的含量增強(qiáng)血管生成[35]。

Bian等[36]發(fā)現(xiàn)缺氧刺激下BMSCs可釋放細(xì)胞外囊泡，迅速被HUVECs攝取，能夠以劑量依賴性的方式促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移和管腔形成。體外模擬外周動(dòng)脈疾病，MSCs釋放Exo的劑量與新生血管形成之間形成劑量依賴關(guān)系，當(dāng)濃度最高達(dá)到100ng/mL時(shí)促血管生成能力降低[37]。其機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，NF-κB信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和存活發(fā)育，是重要的血管生成調(diào)節(jié)通路[38]。在抑制了NF-κB信號(hào)通路之后Exo誘導(dǎo)管腔形成的能力顯著下降，證明了NF-κB信號(hào)通路在Exo介導(dǎo)的新生血管形成中的重要作用，且該作用具有顯著的劑量依賴效應(yīng)[37]。

4 BMSCs來(lái)源Exo-miRNA調(diào)控新生血管形成的作用及機(jī)制

4.1Exo-miRNA促進(jìn)新生血管形成的作用及機(jī)制Gong等[39]學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo可促進(jìn)HUVECs管腔結(jié)構(gòu)的形成。在抑制Exo中miR-30b的表達(dá)后，血管生成的能力顯著降低。這證明了MSCs通過(guò)釋放Exo將miR-30b、miR-30c、miR-424、let-7f轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)動(dòng)員內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形態(tài)改變而促進(jìn)血管生成。此外，MSCs-Exo所包含的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子也可能參與血管生成。

新生血管性視網(wǎng)膜疾病主要改變是病理性增生的RNV，RNV的形成與缺氧有密不可分的關(guān)系。在缺氧環(huán)境中，會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)來(lái)介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過(guò)內(nèi)源性抗氧化劑的能力時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激[40]。檢測(cè)缺氧刺激后的OIR小鼠視網(wǎng)膜可見(jiàn)ROS的大量積累，組織缺氧和ROS使得VEGF-A和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)表達(dá)明顯增加而介導(dǎo)新生血管的形成[41]。HIF-1α在100多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄控制中起關(guān)鍵作用，這些基因調(diào)控血管生成、葡萄糖和能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞增殖和活力等功能[42]。Sun等[43]將HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs-Exo與缺氧處理的HUVECs共培養(yǎng)，可顯著提高新生血管管腔的長(zhǎng)度和數(shù)量。

Zhu等[34]對(duì)BMSCs缺氧處理誘導(dǎo)細(xì)胞中HIF-1α升高，升高的HIF-1α通過(guò)直接調(diào)控中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)的表達(dá)使其較常氧環(huán)境下顯著增加，增強(qiáng)BMSCs-Exo釋放及囊泡活性，而上調(diào)Exo-miR-210含量，進(jìn)而提高HUVECs中VEGF含量以促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力及心臟保護(hù)作用。這可能是由于HIF-1α調(diào)控異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)的表達(dá)，使得miR-210通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成復(fù)合物呈hnRNPs依賴性途徑運(yùn)輸?shù)紼xo中，以保持穩(wěn)定性并發(fā)揮生物合成及信息交換等關(guān)鍵作用[44-45]。另一方面，HIF-1α通過(guò)結(jié)合鞘磷脂磷酸二酯酶3(SMPD3)基因啟動(dòng)子序列中假定的缺氧反應(yīng)元件(HREs)導(dǎo)致下游靶點(diǎn)nSMase2表達(dá)增加了神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)包含有miR-210的Exo裝載釋放[34]。

其中，Exo隨旁分泌到達(dá)靶細(xì)胞后通過(guò)與特定表面蛋白的受體結(jié)合，觸發(fā)融合作用而直接與質(zhì)膜融合，或由靶細(xì)胞內(nèi)吞作用將其內(nèi)容物釋放到目標(biāo)細(xì)胞質(zhì)中[9]。BMSCs-Exo中所含的Jagged1作為關(guān)鍵參與者介導(dǎo)該過(guò)程。Jagged1是Notch信號(hào)的配體，隨HIF-1α升高而在細(xì)胞與BMSCs-Exo中均有顯著升高，通過(guò)介導(dǎo)HUVECs中Notch信號(hào)靶基因HES1和HEY2的表達(dá)促進(jìn)血管形成[46]。

王雅芬等[47]收集缺氧條件下的BMSCs條件培養(yǎng)基，與視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜組合細(xì)胞(RF/6A)共培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力和管腔形成能力，均可見(jiàn)明顯提升。也就是說(shuō)BMSCs對(duì)RF/6A可起到相同的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成作用，該作用通過(guò)BMSCs的條件培養(yǎng)基產(chǎn)生，說(shuō)明很可能同樣由Exo及其中的miRNA介導(dǎo)，故進(jìn)一步探索Exo-miRNA在RNV和CNV形成中的作用及機(jī)制具有重要意義。

4.2Exo-miRNA抑制新生血管形成的作用及機(jī)制Exo-miRNA不僅可以促進(jìn)RNV形成參與視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，還可以抑制RNV形成對(duì)該類疾病起治療效果。如在DR中，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中ROS增加發(fā)生氧化應(yīng)激，繼之視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷而RNV形成是DR的病理生理學(xué)表現(xiàn)之一[48]。此過(guò)程中可檢測(cè)到視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的VEGF等促進(jìn)新生血管形成相關(guān)因子增加。Li等[49]檢測(cè)DR視網(wǎng)膜細(xì)胞中各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，發(fā)現(xiàn)miR-486-3p的表達(dá)量顯著降低以及TLR4、NF-κB的表達(dá)量顯著上調(diào)。miR-486-3p具有抗氧化應(yīng)激，減少ROS的作用，在腫瘤細(xì)胞、2型糖尿病、PM2.5導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞損傷中均有所降低[50-52]。TLR4、NF-κB則與抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)，TLR4在伴隨微血管并發(fā)癥的糖尿病患者單核細(xì)胞中表達(dá)增高[53]。將BMSCs來(lái)源的Exo-miR-486-3p與Müller細(xì)胞共培養(yǎng)后，VEGF等促血管形成相關(guān)因子的表達(dá)量有所下降，從而抑制了高糖環(huán)境中視網(wǎng)膜新生血管的形成。同時(shí)，miR-486-3p可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路減少氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷[49]。由此可見(jiàn)，BMSCs來(lái)源Exo-miRNA不僅在疾病的發(fā)生中起作用，還可在視網(wǎng)膜血管疾病的治療中發(fā)揮積極效應(yīng)。

5小結(jié)與展望

Exo作為一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的物質(zhì)，其易保存和運(yùn)輸?shù)奶匦詷O大提升了在治療等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。近期Yao等[54]為拓寬Exo在心肌缺血治療方面的應(yīng)用，開(kāi)創(chuàng)了一種內(nèi)含Exo的微創(chuàng)噴霧制劑來(lái)在最大限度保留Exo生物功能的基礎(chǔ)上避免開(kāi)胸手術(shù)等創(chuàng)傷性治療方式，達(dá)到增強(qiáng)心臟功能，減少心肌梗死面積的療效。同樣，在眼科疾病的診斷與治療過(guò)程中，Exo及Exo來(lái)源miRNA與角膜損傷、DR、青光眼和葡萄膜黑色素瘤等疾病存在密切關(guān)系[55-56]。Moisseive等[57]將BMSCs-Exo注射入OIR小鼠玻璃體腔，可顯著減緩視網(wǎng)膜缺血嚴(yán)重程度和視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)展，而無(wú)炎癥及免疫反應(yīng)的發(fā)生。這與部分體外實(shí)驗(yàn)中BMSCs-Exo對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用相反，可能與其所處的微環(huán)境相關(guān)。因此，本文簡(jiǎn)要概述BMSCs來(lái)源Exo-miRNA在RNV形成的發(fā)病機(jī)制中所起的作用及機(jī)制，有利于為全面認(rèn)識(shí)其應(yīng)用方式以及潛在治療效果提供幫助。故進(jìn)一步探索BMSCs-Exo在RNV和CNV等新生血管性眼病中的作用及機(jī)制，以及不同作用效果產(chǎn)生的微環(huán)境及條件對(duì)于BMSCs-Exo以安全、有效的方式運(yùn)用于臨床實(shí)踐具有重要的意義。