王愷悅，王增勇，范新蕾，張照勇，楊永芳

（1臨沂市人民醫(yī)院；2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000）

腦腫瘤（Brain tumor, BT）在惡性腫瘤發(fā)病中具有高度異質(zhì)性和高死亡率的特點(diǎn)[1], 2016年全球有330,000例中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥和227,000例死亡病例，1990—2016年全球中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率增加了 17.3%[2]，惡性BT大約占30.2%，其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤是最常見的類型，占50%以上[3]?，F(xiàn)有的治療方法，很難在膠質(zhì)瘤中獲益[4]。山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科姜汝明教授等在臟腑辨證的基礎(chǔ)上加蛇枝黃苓湯（Shezhihuangling decoction, SZHL），發(fā)現(xiàn)其具有抑制術(shù)后腫瘤生長(zhǎng)、延緩病情發(fā)展、改善放化療所產(chǎn)生的不良反應(yīng)等作用[5]。方中白花蛇舌草和半枝蓮為君藥，土茯苓為臣藥，黃芪、當(dāng)歸、大黃、黃連、白術(shù)為佐藥，葛根為引經(jīng)藥，共奏補(bǔ)腎祛濁、散瘀解毒之效[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草提取物通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路誘導(dǎo)U87細(xì)胞的線粒體凋亡[7]，半枝蓮提取物野黃芩苷通過抑制磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路抑制U251細(xì)胞株的增殖、遷徙和侵襲作用[8]，木犀草素通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路、抑制miR-124-3p的表達(dá)來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)自噬和誘導(dǎo)凋亡[9]，其甲氧基聚乙二醇-聚ε-己內(nèi)酯納米膠束在體內(nèi)和體外均被證實(shí)有良好的生物利用度和細(xì)胞毒性[10]。雖然方劑中的多種中藥提取物和單體成分抗膠質(zhì)瘤的作用已經(jīng)明晰，但是復(fù)方中的多化合物-多靶點(diǎn)-多通路的藥理機(jī)制尚不明確，阻礙了其在臨床中的進(jìn)一步推廣。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，首先篩選了SZHL抗腦腫瘤潛在的分子機(jī)制和靶點(diǎn)，揭示方劑-成分-靶標(biāo)-疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[11]，然后應(yīng)用分子對(duì)接的方法進(jìn)行驗(yàn)證，預(yù)測(cè)藥物的藥理學(xué)潛在機(jī)制，以期揭示中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵、傳承和發(fā)展中醫(yī)藥理論。

1 資料與方法

1.1 篩選SZHL中藥活性成分 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP）中分別以SZHL中9味中藥為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（Oral Bioavailability, OB）≥30%、藥物相似性（Druglike Properties，DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，提取各中藥的活性成分。根據(jù)其透過血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的能力，將BBB≥0.30的活性成分定義為中樞成分，共篩選出31種化合物；將BBB ＜ 0.30 定義為外周成分，共得到75種化合物。

1.2 確定各活性成分的生物學(xué)靶標(biāo) 將上述活性成分導(dǎo)入DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)以獲取其作用的靶點(diǎn)。在中樞成分中共鑒定出633個(gè)靶點(diǎn)，其中HDH 71個(gè)，AMK 22個(gè)，SBH 110個(gè)，RRER 49個(gè)，ASR 69個(gè)，RP 38個(gè)，CR 87個(gè)，HMM 115個(gè)，SGR 72個(gè)；周圍成分中共確定165個(gè)靶點(diǎn)：HDH 185個(gè)，AMK 1個(gè)，SBH 482個(gè)，RRER 60個(gè)，ASR 64個(gè)，RP 59個(gè)，CR 200個(gè)，HMM 347個(gè)，SGR 253個(gè)。去除重復(fù)后，最終篩選出中樞成分中的347個(gè)靶點(diǎn)和外周成分中的996個(gè)靶點(diǎn)。

1.3 篩選腦腫瘤的差異表達(dá)基因 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘BT相關(guān)的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)（Series：GSE50161，Samples：GPL570），樣品分布：室管膜46個(gè)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤34個(gè)，髓母細(xì)胞瘤22個(gè)，毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤15個(gè)，正常樣品13個(gè)。篩選P-value ＜ 0.005和|log 2(fold change)| ＞ 1的基因確定為顯著差異的基因用于后續(xù)的分析。

1.4 構(gòu)建SZHL-腦腫瘤靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò) 將SZHL活性成分及其靶標(biāo)、BT差異表達(dá)的基因輸入Cytoscape 3.8.0軟件，分別構(gòu)建了中樞成分-BT、周圍成分-BT的網(wǎng)絡(luò)并可視化。分別將中樞成分-BT靶點(diǎn)和周圍成分-BT靶點(diǎn)投入到String數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選符合最高信度0.90的節(jié)點(diǎn)，創(chuàng)建初始PPI網(wǎng)絡(luò)；使用Cytoscape 3.8.0應(yīng)用CytoNCA程序分析網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)，將度中心性（Degree, DC）、間接中心性（Betweenness,BC）、緊密中心性（Closeness, CC）、特征向量中心性（Eigenvector，EC）作為關(guān)鍵因素，提取網(wǎng)絡(luò)中最有效的節(jié)點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析 運(yùn)用Strawberry Perl(*64 3.6.2)程序，進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 ，篩選符合P＜0.05，P＜0.05條件的前20個(gè)GO功能類別和信號(hào)通路進(jìn)行后續(xù)分析；使用 Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建和可視化關(guān)鍵基因-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對(duì)接 將PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫降挠行Ч?jié)點(diǎn)設(shè)定為大分子受體，使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)查找其3D結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件刪除水分子及小分子配體；將有效節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分為小分子配體，應(yīng)用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)查找其2D結(jié)構(gòu)，使用Chem3D 19.0軟件構(gòu)建其3D結(jié)構(gòu)；使用Autodock 4.2.6軟件書寫受體和配體的PDBQT文件并確定大分子蛋白的活性口袋；使用Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，選取對(duì)接結(jié)合能最低的結(jié)果為最佳對(duì)接模型；使用Pymol軟件可視化對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SZHL-BT靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)BT組和正常組差異基因表達(dá)的情況，構(gòu)建了熱圖和火山圖（圖 1）。表1顯示根據(jù)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中成分的度數(shù)篩選的Top10中樞成分和外周成分。中樞成分-BT靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2A）由 30 個(gè)節(jié)點(diǎn)和58個(gè)邊組成：β-谷甾醇和豆甾醇均為膳食植物甾醇成分，是影響腦腫瘤靶標(biāo)數(shù)量最多的化合物，且存在于多種中藥（HDH、SBH、RRER、ASR、RP和SGR）中；此外，常春藤皂苷元、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇均為 HMM 中的活性成分，作用于較多的靶標(biāo)；靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)中前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（PTGS2）、膽堿能受體3（CHRM3）、膽堿能受體1（CHRM1）、鹽皮質(zhì)激素受體（NR3C2）和胱天蛋白酶8（CASP8）的度數(shù)最高（圖2A）；以上結(jié)果顯示上述活性成分及靶標(biāo)處于網(wǎng)絡(luò)中的樞紐位置。外周成分-BT靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)包括 68個(gè)節(jié)點(diǎn)和174個(gè)邊（圖 2B）：多種中藥（HDH、SBH、CR、HMM和SGR）中的槲皮素、SBH中的木犀草素和HMM中的山奈酚、為復(fù)方中的核心藥效成分；PTGS2、周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（CHEK1）、周期蛋白依賴性激酶（CDK2）、γ 氨基丁酸A 受體（GABRA1）、p65基因（RELA）和細(xì)胞周期蛋白A2（CCNA2）的度數(shù)最高，為核心成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖2B）。2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?將中樞成分-BT靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，蛋白激酶Cα（PRKCA）、PTGS2、CDK2、CASP8處于 網(wǎng)絡(luò)的 核心（圖3A）；如圖3B所示，周圍成分-BT靶標(biāo)構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)由66個(gè)節(jié)點(diǎn)和471條邊組成，經(jīng)過篩選得到的終網(wǎng)絡(luò)中，VEGFA、PTGS2、IL1B、CCND1、MMP9為度數(shù)最高的節(jié)點(diǎn)，提示處于網(wǎng)絡(luò)的核心。

圖1 腦腫瘤差異表達(dá)基因熱圖和火山圖

圖2A SZHL中樞成分-腦腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可視化圖

圖2B SZHL周圍成分-腦腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化圖

圖3A SZHL治療腦腫瘤中樞靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3B SZHL治療周圍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 SZHL的中樞活性成分和外周成分（Top 10）

2.3 GO富集分析 圖4A為SZHL的中樞成分作用于BT前10位的GO富集結(jié)果，主要涉及的G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、血管調(diào)節(jié)、突觸后膜神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)等功能。圖4B展示了SZHL外周成分-BT靶標(biāo)前10位GO富集結(jié)果，主要涉及的功能有：細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、有絲分裂細(xì)胞周期 G1/S 轉(zhuǎn)換的負(fù)調(diào)控等。

圖4B SZHL周圍靶點(diǎn)的GO富集分析條形圖和圈圖

圖4A SZHL中樞靶點(diǎn)的GO富集分析條形

2.4 核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)分析 如圖5所示，中樞成分核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)共有35個(gè)節(jié)點(diǎn)和65條邊，外周成分靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)由66個(gè)節(jié)點(diǎn)和241條邊組成。中樞網(wǎng)絡(luò)中度數(shù)最高的靶點(diǎn)PRKCA和外周網(wǎng)絡(luò)中的B 細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子（IKBKB）、RELA、CCND1、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）是連接最多信號(hào)通路的靶點(diǎn)。中樞通路中的逆行大麻素受體信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路，周圍通路中的TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-kB等信號(hào)通路，處于網(wǎng)絡(luò)中的核心位置。

圖5 SZHL治療腦腫瘤中樞靶點(diǎn)（5A）及周圍靶點(diǎn)（5B）與信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)可視化圖

2.5 分子對(duì)接 如表2所示，根據(jù)藥效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)選取節(jié)點(diǎn)和度數(shù)最高的藥效成分與PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，共獲得26組配體-受體對(duì)接結(jié)果，中樞成分10組（圖6A），周圍成分16組（圖6B）；所有的藥效成分與基因靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)合能均＜0 kcal·mol-1，提示兩者可以自發(fā)進(jìn)行結(jié)合；24組分子對(duì)接結(jié)合能均小于-7.0kcal·mol-1，提示兩者有強(qiáng)烈的對(duì)接能力。

圖6 SZHL治療腦腫瘤中樞成分（6A）及周圍成分（6B）與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果可視化圖

表2 SZHL藥效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

3 討論

中醫(yī)藥治療腦腫瘤從整體出發(fā)，遵循扶正與驅(qū)邪結(jié)合、辨證與辨病結(jié)合，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，腦腫瘤病位雖在腦，但與肝、脾、腎密切相關(guān)。姜汝明等[6]對(duì)75例膠質(zhì)瘤術(shù)后患者在臟腑辨證的基礎(chǔ)上服用SZHL，發(fā)現(xiàn)治療組影像學(xué)有效率明顯高于對(duì)照組，而影像復(fù)發(fā)率低于對(duì)照組，此外，治療組血清腫瘤標(biāo)志物和炎性指標(biāo)、全身不良反應(yīng)（嘔吐、納差、脫發(fā)等）明顯低于對(duì)照組，由此可見，SZHL的藥效成分同時(shí)從中樞和周圍發(fā)揮作用。在腦腫瘤的化療中，血腦屏障對(duì)化療藥物的反應(yīng)和耐藥性密切相關(guān)，血腦屏障由以緊密連接為特征的內(nèi)皮細(xì)胞組成，超過98%的小分子化合物不能穿過這個(gè)屏障[12]。因此，我們通過常規(guī)的對(duì)藥效成分進(jìn)行篩選（OB≥30%、DL≥0.18）的基礎(chǔ)上，將是否能夠透過血腦屏障（BBB ≥ 30% 和 BBB＜30%）作為重要指標(biāo)，分別從中樞機(jī)制和周圍機(jī)制出發(fā)，分別探討SZHL抗腦腫瘤的機(jī)制。

3.1 SZHL中樞成分的抗腦腫瘤機(jī)制 中樞成分中，β-谷甾醇和豆甾醇是與膽固醇相似的常見的植物甾醇（PS）[13]。體內(nèi)和體外研究顯示PS具有多種抗腫瘤特性，包括抑制凋亡、抗炎、抗血管生成和遷移、阻滯細(xì)胞周期等[14]。臨床試驗(yàn)和薈萃分析證實(shí)，高 PS 攝入量與多種癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[15-16]。PS可以透過血腦屏障，調(diào)節(jié)膽固醇代謝[17]，但其透過血腦屏障的機(jī)制尚不明確，高密度脂蛋白（HDL）、載脂蛋白E和 B 類Ⅰ型清道夫受體可能發(fā)揮重要作用[18]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和大腦內(nèi)皮基底外側(cè)的跨膜蛋白，PS可以通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在顱腦中釋放，隨后被 HDL樣顆粒吸收[19]。

中樞成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)表明，PRKCA、PTGS2、CDK2、CASP8等是重要的靶標(biāo)，分子對(duì)接顯示上述靶標(biāo)與相應(yīng)藥效成分有強(qiáng)烈的結(jié)合能力，通過這些分子，篩選出SZHL主要通過逆行大麻素受體信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等發(fā)揮調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管調(diào)節(jié)、突觸后膜神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)等生物功能。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、遷移和血管生成[20]。大麻素受體可以激活GPCR，通過增強(qiáng)CCND和CDK抑制基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖；Gαi和 Gαs亞基調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）水平以激活蛋白激酶A（PKA），而Gαq/11 促進(jìn)PKC激活NF-kB[21]。PRKCA編碼蛋白激酶Cα（PKCα)，它是參與腫瘤形成和進(jìn)展的鈣和磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員[22]；一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示，16例脊索樣膠質(zhì)瘤患者中有14例患者攜帶PRKCA D463H突變，2例患者合并攜帶BRAFV600E突變[23]；突變體 PRKCA的表達(dá)引起磷酸化ERK 增加和錨定非依賴性生長(zhǎng)，導(dǎo)致脊索樣膠質(zhì)瘤異常增殖。

3.2 SZHL外周成分抗腦腫瘤的機(jī)制 在外周機(jī)制中，槲皮素、木犀草素、山奈酚等是重要的藥效成分，通過影響VEGFA、PTGS2、IL1B、CCND1、MMP9等靶點(diǎn)發(fā)揮抗腦腫瘤的作用，分子對(duì)接證實(shí)上述藥效成分和靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合能力。槲皮素通過破壞和減少線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面絲狀偽足樣結(jié)構(gòu)和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)、增加纖連蛋白和層粘連蛋白的表達(dá)水平來影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移[24]。用槲皮素預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞和C6細(xì)胞可通過促進(jìn)IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA的表達(dá)，以及抑制一氧化氮合酶（NOS2）、PTGS2、TGF-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）的mRNA表達(dá)來發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用[25]，與本研究的結(jié)果一致。納米技術(shù)、熱療技術(shù)、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)等創(chuàng)新技術(shù)，可以發(fā)揮增強(qiáng)藥物對(duì)血腦屏障的通透性，增加顱內(nèi)藥物的濃度等作用[26]，是目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。載有山奈酚的黏膜粘附納米乳劑顯著增加了進(jìn)入大鼠大腦的藥物量，并在鼻腔給藥后誘導(dǎo)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[27]，這些研究促進(jìn)了腦腫瘤治療新藥和治療策略的開發(fā)。

GO和KEGG結(jié)果，外周成分-腦腫瘤涉及的靶標(biāo)主要發(fā)揮細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、有絲分裂細(xì)胞周期 G1/S 轉(zhuǎn)換的負(fù)調(diào)控等生物功能，主要通過TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-kB等信號(hào)通路發(fā)揮作用。從G細(xì)菌細(xì)胞壁釋放的脂多糖（LPS）已被證實(shí)是腸道炎癥的重要促進(jìn)因素[28]。LPS 通過與細(xì)胞表面的Toll樣受體（TLR-4）復(fù)合物結(jié)合，觸發(fā)了多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)過程，尤其是NF-kB蛋白酶抑制劑IKK-α的磷酸化[29]。研究表明，腸上皮緊密連接屏障的缺乏與腸道和全身炎癥的發(fā)展顯示相關(guān)[30]。腸道炎癥與癌癥之間有密切的關(guān)系，促炎細(xì)胞因子的分泌可誘導(dǎo)結(jié)腸癌小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)[31]。在果蠅幼蟲中，與正常個(gè)體相比，癌性幼蟲的芽孢桿菌科的相對(duì)豐度顯著降低，這表明腦腫瘤的發(fā)展可能與腸道微生物群落組成的改變有關(guān)[32]，這種分子機(jī)制可能為進(jìn)一步研究腸道炎癥與 BT 腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系提供證據(jù)。

本研究創(chuàng)新性從中樞機(jī)制和外周機(jī)制分別出發(fā)，在前輩臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段，探索了SZHL治療腦腫瘤的分子機(jī)制：SZHL中的植物甾醇、常春藤皂苷元等成分具有透過血腦屏障的能力，發(fā)揮影響膽堿能細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用；槲皮素、山奈酚、木犀草素等周圍成分，通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫等機(jī)制發(fā)揮抗腦腫瘤的作用。