李夢婷，萬紹貴

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子病理中心，江西 贛州 341000）

DNA 分為染色體DNA 和染色體外DNA，染色體外DNA 又分為細(xì)胞器染色體外DNA（如線粒體DNA）和非細(xì)胞器染色體外DNA（如eccDNA）。染色體DNA 和線粒體DNA 早已被大家所熟知，但eccDNA 卻不被大眾所熟知，直至1965 年科學(xué)家首次在野豬精子［1］、兒童胚胎腫瘤樣本和成人支氣管癌癥患者樣本［2］中發(fā)現(xiàn)了eccDNA，才證實了它的存在。隨著學(xué)者們進一步研究發(fā)現(xiàn)，eccDNA 廣泛存在于酵母、健康人體、腫瘤樣本和癌癥細(xì)胞系中［3-7］。目前研究發(fā)現(xiàn)，eccDNA 小到幾十bp 大到幾百Mb，根據(jù)eccDNA 大小對其進行分類，分子量在0.2～0.4 kb 的稱為microDNA［8］；分子量在10～100 kb 的稱為spcDNA［9］；分子量在100 kb 至幾十Mb 大小的eccDNA 稱為ecDNA，例如雙微體（Double minutes，DMs）；分子量 在100 Mb 以上的eccDNA 稱 為 新 染色體［8，10-12］。

最初研究eccDNA 的方法局限于在電子顯微鏡下觀察有無環(huán)狀DNA 分子位于染色體外［2］，僅可觀察到如雙微體等較大的eccDNA；核型制備或氯化物密度梯度鑒定eccDNA 的存在［13-14］；熒光原位雜交技術(shù)（簡稱FISH）觀察有無環(huán)形擴增子且位于染色體外［15］；這些方法均能證明eccDNA 的存在但無法進一步探索eccDNA 的功能。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，基于基因測序技術(shù)開發(fā)的針對eccDNA 測序數(shù)據(jù)的分析算法有助于學(xué)者們進一步挖掘eccDNA潛在的生物學(xué)功能?；谀[瘤組織樣本和細(xì)胞系樣本，WU S H 等［15］發(fā)現(xiàn)位于eccDNA 上的致癌基因呈高表達，且與位于線性DNA 上的致癌基因相比，具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，其自身具有更高的染色質(zhì)開放度；VERHAAK R G W 等［16］和MORTON A R 等［17］發(fā)現(xiàn)eccDNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有遠(yuǎn)距離調(diào)控的功能，環(huán)狀結(jié)構(gòu)有利于將線性DNA上距離較遠(yuǎn)的基因和調(diào)控序列整合在一起，促進致癌基因的表達；HUNG K L等［18］在多種癌癥細(xì)胞系樣本中發(fā)現(xiàn)eccDNA 可以“抱團行動”，驅(qū)動分子間增強子信號，進一步促使癌基因的表達；WANG Y G等［19］揭示了eccDNA與固有免疫活性的關(guān)系。除此之外，有學(xué)者還揭示了eccDNA 與腫瘤異質(zhì)性、腫瘤藥物治療產(chǎn)生的腫瘤耐藥性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老息息相關(guān)［10，20-22］。一系列的研究成果都表明了基因測序技術(shù)在探索eccDNA功能中占據(jù)了重要地位。本文針對不同高通量基因測序技術(shù)在探索eccDNA 功能中的應(yīng)用及目前研究者利用外周血樣本或血漿樣本挖掘出的eccDNA相關(guān)研究成果進行簡要闡述。

1 eccDNA 的二代基因測序（Next-generation sequencing，NGS）檢測技術(shù)

二代基因測序（Next-generation sequencing，NGS）檢測技術(shù)又稱高通量測序技術(shù)，是基于PCR的基因測序技術(shù)，目前的NGS 測序平臺主要包括羅氏的454 FLX 和Illumina 的Miseq/Hiseq。有學(xué)者利用Illunima 測序平臺對DNA 樣本進行測序，開發(fā)出一系列數(shù)據(jù)分析算法，挖掘樣本中檢測到的eccDNA包含的遺傳信息。目前基于NGS 測序的eccDNA 檢測方法主要分為兩大類。第一類不進行eccDNA 富集，提取DNA 樣本，直接進行全基因組測序（Whole genome sequencing，WGS），運用Amplicon Architect算法進行數(shù)據(jù)進行分析［23］；第二類進行eccDNA 富集，利用恒溫擴增酶phi29 的生物學(xué)特性，即進行滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA），根據(jù)Illunima 測序平臺文庫制備要求處理富集后的樣本并測序，運用Circle-seq/Circle-map 分析流程進行數(shù)據(jù)分析［24-25］。WGS能夠檢測出較大的eccDNA分子，如ecDNA，但樣本中含有大量線性DNA，eccDNA 分子也未富集，故背景干擾過大，測序數(shù)據(jù)中eccDNA豐度較低，大量測序數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)；樣本去除線粒體DNA 和線性DNA 后，進行RCA，富集eccDNA，提高了eccDNA 豐度，降低了背景噪音的干擾，有利于提高eccDNA 分子的檢出率，小分子量的eccDNA較大分子量的ecDNA 更容易富集，故RCA 后的樣本ecDNA檢出率較低。

基于Amplicon Architect 分析算法，有學(xué)者通過分析3 212例癌癥患者樣本的WGS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，ecDNA的擴增與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與不含ecDNA 患者相比，含有ecDNA 患者的五年生存率更差，且位于ecDNA 上的原癌基因具有更高的轉(zhuǎn)錄水平，進一步加劇了癌癥的發(fā)生發(fā)展［26-27］。HUNG K L等［18］對多種癌癥細(xì)胞系進行WGS測序，通過分析發(fā)現(xiàn)ecDNA分子不僅可促進致癌基因表達，且細(xì)胞內(nèi)的ecDNA分子之間能進行相互調(diào)控，一個ecDNA 分子上的增強子能夠促進另一ecDNA 分子上致癌基因的表達，致癌基因表達產(chǎn)物又可反作用于增強子所在的ecDNA分子攜帶基因的表達。KOCHE R P等［25］通過DNA和RNA測序發(fā)現(xiàn)，eccDNA是體細(xì)胞重排造成的意外產(chǎn)物，具有重要的功能和臨床免疫缺陷，且進一步證明了樣本經(jīng)RCA 富集后檢測到的eccDNA 分子數(shù)高于樣本直接進行WGS檢測到的eccDNA分子數(shù)。

基于NGS數(shù)據(jù)，研究者還開發(fā)出ATAC-seq方法來鑒定eccDNA 分子，并發(fā)布了Circle_finder 的分析方法。ATAC-seq盡管無對線性DNA或eccDNA進行富集，但該方法能有效識別eccDNA分子中串聯(lián)片段的重復(fù)位點，進一步挖掘eccDNA與腫瘤的關(guān)系［28］。

2 eccDNA 的三代基因測序（Third-generation sequencing，TGS）檢測技術(shù)

三代基因測序（Third-generation sequencing，TGS）檢測技術(shù)又稱長讀長基因測序技術(shù)，相較于NGS 短讀長的不足，TGS 很好地彌補了由于短讀長特點導(dǎo)致的數(shù)據(jù)拼接困難、對拷貝數(shù)變異的識別困難；TGS 無需進行PCR 擴增，彌補了NGS 由于PCR擴增導(dǎo)致對串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和GC 含量較高區(qū)域的測序困難。eccDNA 多來源于染色體串聯(lián)重復(fù)序列［29-30］，這對來源于染色體串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的eccDNA的NGS 測序數(shù)據(jù)組裝和挖掘是一個巨大挑戰(zhàn)，故研究學(xué)者利用TGS 測序平臺檢測eccDNA。目前TGS測序平臺主要有PacBio 公司的SMRT 和Oxford 公司的Nanopore。

MEHTA D 等［31］基 于SMRT 測 序 技 術(shù) 開 發(fā) 出CIDER-Seq 實驗和分析流程，用于檢測樣本中已知或未知的環(huán)狀DNA。除了鑒定eccDNA 的存在，基于PacBio 公司的測序平臺，F(xiàn)AN X Y 等［32］開發(fā)了SMOOTH-Seq 的方法，通過檢測人類癌癥細(xì)胞系和直腸癌樣本區(qū)分了eccDNA 和染色體本身結(jié)構(gòu)變異（Structure variations，SVs），而依靠NGS 平臺很難檢測 此 類SVs 事 件。HUNG K L 等［18］和WANG Y G等［19］同年在Nature 上發(fā)表了基于Nanopore 測序技術(shù)，揭示了eccDNA 未知的生物學(xué)功能，WANG Y G等［19］還開發(fā)了ecc_RCA_nanopore 的數(shù)據(jù)分析流程，用于檢測測序數(shù)據(jù)中含有的eccDNA豐富度。

由于TGS 的準(zhǔn)確率低于NGS，故研究者利用NGS 測序數(shù)據(jù)對TGS 測序數(shù)據(jù)進行校正，以獲得更精確的長片段，用于eccDNA生物學(xué)功能的挖掘［25］。

3 eccDNA作為生物標(biāo)志物的臨床意義

研究者不僅在癌癥樣本和癌癥細(xì)胞系中檢測到eccDNA，也在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了eccDNA 的存在，且與組織樣本和細(xì)胞系樣本檢測的eccDNA 具有相同的特性：主要來源于染色體外顯子、5'UTR、3'UTR等區(qū)域［32-33］。KUMAR P等［34］通過收集同一肺癌和卵巢癌患者術(shù)前術(shù)后的血漿或血清樣本進行測序分析發(fā)現(xiàn)，肺癌和卵巢癌患者術(shù)前eccDNA 水平更高且更長，這一發(fā)現(xiàn)為肺癌和卵巢癌患者液體活檢提供了新的研究方向，eccDNA可作為一種肺癌和卵巢癌篩查新的生物標(biāo)志物。SIN S T K 等［35］在孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)來源于母體和胎兒的eccDNA，并對2 種不同來源的eccDNA 進行分析，發(fā)現(xiàn)胎兒來源的eccDNA比母體來源的eccDNA短；由于eccDNA結(jié)構(gòu)特點，與具有黏性末端的線性DNA相比，eccDNA更穩(wěn)定，且外周游離的eccDNA 與游離線性DNA 之間存在10 bp 大小周期間隔。通過對孕婦血漿樣本中鑒定的母體和胎兒eccDNA 甲基化分析發(fā)現(xiàn)，母體來源的eccDNA 較胎兒來源的eccDNA 甲基化密度高，且孕婦分娩后，胎兒來源的eccDNA 和線性DNA 在孕婦血漿檢測DNA 占比迅速降低，胎兒來源的eccDNA 和線性DNA 半衰期相似［36］，這兩個發(fā)現(xiàn)為產(chǎn)前無創(chuàng)檢測提供了一種新型的生物標(biāo)志物?；赟IN S T K 等［35］發(fā)現(xiàn)母體中存在胎兒來源的eccDNA 分子，YANG H 等［37］通過分析胎兒生長受限（Fetal growth restriction，F(xiàn)GR）母體血漿中胎兒來源eccDNA分子特征發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR較正常新生兒eccDNA數(shù)量增多，F(xiàn)GR 中eccDNA 所在宿主基因主要富集在免疫相關(guān)信號通路，為篩選新型的FGR 生物標(biāo)志物和治療靶點提供了新的方向。

4 小結(jié)與展望

從1965 年發(fā)現(xiàn)eccDNA 至今，eccDNA 的研究取得了突破性的進展。不僅基于癌癥細(xì)胞系和癌癥樣本對eccDNA 的潛在生物學(xué)功能進行了研究，還對eccDNA 在液體活檢中的作用進行了探索，并進一步挖掘了eccDNA 作為一種新型的生物標(biāo)志物的可能性。目前研究已證實，eccDNA 與癌癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，不僅可促進致癌基因表達，且位于eccDNA 上的致癌基因具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，此外，在腫瘤藥物治療過程中，eccDNA 與腫瘤耐藥有關(guān)，這些研究進一步揭示了腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學(xué)機制，并為腫瘤的研究與治療提供了新思路和新靶點。目前已知外周血eccDNA 分子特征，可作為肺癌和卵巢癌患者檢測與術(shù)后監(jiān)測、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、無創(chuàng)FGR 診斷的生物標(biāo)志物。然而，目前對于eccDNA 的了解并不充分，還有許多問題有待進一步研究：eccDNA 形成的確切機制有哪些？eccDNA是否能轉(zhuǎn)錄并翻譯出調(diào)控因子用于促進癌基因的表達？eccDNA 分子能否作為信號分子介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞？eccDNA 作為生物標(biāo)志物未知的臨床意義有哪些？

高通量基因測序技術(shù)是研究eccDNA 極為重要的方法，其發(fā)展為eccDNA 研究提供了良好的平臺，通過結(jié)合NGS 高精確度測序優(yōu)勢和TGS 長讀長測序優(yōu)勢，可精確鑒定eccDNA 所攜帶的遺傳信息，為探索eccDNA 未知的生物學(xué)意義提供了有效技術(shù)手段。