王顥潛，高鴻飛，王夢(mèng)雨，王晨堯，劉鵬程，張秀杰*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京，100176；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢，430062；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京，100081）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化勢(shì)頭迅猛，根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）2020 年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019 年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積為1.904 億公頃，比1996 年增長(zhǎng)了112 倍，占全球耕地面積的12%，轉(zhuǎn)基因種植國(guó)家達(dá)到29 個(gè)，轉(zhuǎn)基因進(jìn)口國(guó)家有42 個(gè)[1]。2019 年，我國(guó)進(jìn)口大豆10032.82 萬噸，基本上為轉(zhuǎn)基因大豆，主要來自巴西、美國(guó)、阿根廷和加拿大。我國(guó)也是轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)和應(yīng)用大國(guó)，目前我國(guó)依托轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)的實(shí)施，建立了集重要功能基因發(fā)掘、轉(zhuǎn)基因新品種培育及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等上中下游技術(shù)于一體的研發(fā)平臺(tái)，成為全球僅有的幾個(gè)擁有轉(zhuǎn)基因核心技術(shù)的國(guó)家之一。截止2020 年12 月，我國(guó)新批準(zhǔn)4 個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米和3 個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書。隨著全球轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模種植和全球一體化下頻繁的貿(mào)易流通，加之我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的任務(wù)將越來越重。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)作為監(jiān)管工作的技術(shù)支撐和保障，對(duì)其要求也將越來越高。PCR 等常規(guī)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用廣泛、準(zhǔn)確可靠，但無法滿足轉(zhuǎn)基因大規(guī)模快速篩查的監(jiān)管需求。2021 年中央一號(hào)文件指出“尊重科學(xué)，加強(qiáng)監(jiān)管，有序推進(jìn)生物育種產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用”。為落實(shí)文件要求，做好轉(zhuǎn)基因監(jiān)管工作，提升轉(zhuǎn)基因監(jiān)管能力，建立簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

目前，常見的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)主要是基于核酸水平和蛋白水平?；诤怂崴降臋z測(cè)技術(shù)主要包括定性PCR 技術(shù)、定量PCR 技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和基因芯片技術(shù)等，基于蛋白水平的檢測(cè)技術(shù)主要包括ELISA 技術(shù)、Western blot 檢測(cè)技術(shù)和免疫層析試紙條技術(shù)等[2]?；诤怂崴降臋z測(cè)技術(shù)主要針對(duì)整合進(jìn)受體植物基因組上的外源基因進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)靶序列的不同，按特異性由低到高依次為篩選特異性檢測(cè)、外源基因特異性檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因構(gòu)建特異性檢測(cè)和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)[3]?；诤怂岬目焖贆z測(cè)方法一般都是以核酸擴(kuò)增技術(shù)為核心，包括核酸提取、核酸擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)3 個(gè)步驟。這3個(gè)步驟缺一不可，且操作較為繁瑣，對(duì)儀器設(shè)備要求較高?；诘鞍姿降臋z測(cè)技術(shù)主要依據(jù)免疫分析的原理針對(duì)外源表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，操作較為簡(jiǎn)便，外源蛋白較為穩(wěn)定，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。本文就轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)的研究與應(yīng)用進(jìn)展做一簡(jiǎn)要概述，旨在明確轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向及應(yīng)用策略，為轉(zhuǎn)基因監(jiān)管提供技術(shù)支撐，做好技術(shù)儲(chǔ)備。

1 基于核酸水平的快速檢測(cè)技術(shù)

1.1 核酸提取技術(shù)

核酸提取是核酸擴(kuò)增前不可或缺的一個(gè)步驟，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度有重要影響。核酸提取的方法有很多，如CTAB 法、改良CTAB 法、SDS 法、SDSPVP 法及試劑盒法等[4]。但是這些方法都需要組織裂解破碎、核酸提取、純化等步驟，非常耗時(shí)，且提取成本較高，依賴許多大型儀器。因此，傳統(tǒng)的核酸提取方法難以滿足大規(guī)模現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

為了滿足轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，一些新型快速高效的核酸提取方法得到開發(fā)和應(yīng)用。堿裂解法是一種有效的DNA 快速提取方法，通過設(shè)置合適的堿性環(huán)境，使細(xì)胞裂解，染色體DNA變性分離，從而獲得DNA[5]。該方法無需水浴和離心，操作簡(jiǎn)便、快速，已廣泛用于玉米、大豆、水稻等的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、SSR 鑒定等領(lǐng)域[6,7]。磁性微球DNA 提取方法是在磁場(chǎng)作用下對(duì)DNA 進(jìn)行特異性吸附和脫附，無需離心分離和使用有機(jī)溶劑即可獲得純度較高的DNA[8]。王柳[9]通過水熱法和TEOS水解法合成了磁性微球，并將其用于大米基因組DNA的提取，比傳統(tǒng)方法節(jié)約時(shí)間近70%。趙曉麗等[10]制備了納米磁性微球用于提取轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA ，結(jié)果證明DNA 濃度明顯高于植物基因組提取試劑盒（Plant genomic DNA kit，北京天根）。氣壓法提取DNA 是利用正壓代替離心，達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、現(xiàn)場(chǎng)提取植物基因組DNA 的一種方法。陳麗麗[11]利用注射器搭配過濾器和硅膠膜柱研制了DNA 提取裝置，完成單個(gè)樣品的DNA 純化僅需15 min，且減少了對(duì)離心機(jī)的依賴?；蚪MDNA 直接提取法是利用EDTA、表面活性劑等物質(zhì)混合成裂解液，高溫孵育10 min 即可完成DNA 提取，并可直接作為PCR 模板進(jìn)行擴(kuò)增[12]。纖維素濾紙?zhí)崛〖兓椒ㄊ腔诶w維素的濾紙可快速結(jié)合核酸，經(jīng)快速洗滌去除污染物并將其保留，然后將其直接洗脫到擴(kuò)增反應(yīng)中。Zou 等[13]研制了一種纖維素過濾器，可在不到30秒的時(shí)間內(nèi)從多種植物，動(dòng)物和微生物樣品中純化核酸，而無需任何專用設(shè)備。Wang 等[14]采用PVC 塑料板做支撐，研制了EZ-D 核酸提取試紙條，提取更加高效和穩(wěn)定。

1.2 核酸擴(kuò)增技術(shù)

PCR 是最常用的核酸擴(kuò)增方法，通過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，結(jié)合凝膠電泳或熒光檢測(cè)等方法進(jìn)行分析。但PCR 方法對(duì)溫控設(shè)備、檢測(cè)設(shè)備和操作人員有較高的要求，且非常耗時(shí)，限制了該技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用。

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近年來新興的分子診斷技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)恒溫下核酸快速擴(kuò)增，無需依賴溫控設(shè)備，能夠在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)核酸的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。目前，應(yīng)用較為廣泛的是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），并已經(jīng)發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。其基本原理是依賴鏈置換DNA 聚合酶和4 條不同的引物，通過自動(dòng)循環(huán)的鏈置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。王嘉鈺等[15]基于LAMP 技術(shù)，以中性紅染料作為比色試劑，建立了玉米內(nèi)標(biāo)基因和cry1Ab基因的可視化快速檢測(cè)方法，既快速又簡(jiǎn)便且尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Chen[16]等基于LAMP 反應(yīng)，使用終點(diǎn)檢測(cè)法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種轉(zhuǎn)基因大米樣品的鑒定，靈敏度可達(dá)到0.005%。Cheng等[17]將LAMP 與橫向流動(dòng)檢測(cè)試紙條技術(shù)結(jié)合，用于檢測(cè)DP305423×GTS 40-3-2 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆。Wu 等[18]開發(fā)了一種實(shí)時(shí)熒光LAMP 方法，利用便攜式儀器檢測(cè)熒光信號(hào)，30 min 內(nèi)可以現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)出含有0.1%的轉(zhuǎn)基因大豆制品。與傳統(tǒng)PCR 相比，雖然LAMP 技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)擴(kuò)增方法對(duì)精密溫控設(shè)備的要求，但反應(yīng)體系配置和擴(kuò)增時(shí)間并沒有明顯的優(yōu)勢(shì)，依然有開蓋操作，也存在非特異性擴(kuò)增。整體來看，還需進(jìn)一步優(yōu)化。

近幾年出現(xiàn)的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）可以在37℃～42℃條件下，通過重組酶和鏈置換聚合酶的作用，實(shí)現(xiàn)模板DNA 的快速擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后可采用電泳、Twist Amp TM exo 探針和核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行可視化檢測(cè)[19,20]。與其它等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比：一是RPA 無需熱變性，反應(yīng)時(shí)間更短，20 min 內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)核酸準(zhǔn)確檢測(cè)，是最快的擴(kuò)增技術(shù)之一；二是可以在相對(duì)較低的溫度下進(jìn)行，如37 ℃反應(yīng)；三是即使樣品中含有某些雜質(zhì)也不會(huì)影響檢測(cè)，可省去DNA 純化過程，因此該技術(shù)更加便捷；四是RPA 體系中的酶呈凍干態(tài)，運(yùn)輸時(shí)不需要冷藏，更加便于運(yùn)輸。目前，RPA 技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。謝石龍等[21]建立了轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的實(shí)時(shí)熒光RPA 技術(shù)，相對(duì)檢測(cè)限為0.05%，檢測(cè)在39℃，10 min 內(nèi)完成；Li等[22]將RPA技術(shù)與測(cè)流層析試紙相結(jié)合構(gòu)建了一種三重轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法，整個(gè)過程僅需要30 min，該方法無需任何大型儀器，即可完成可視化、快速、靈敏的檢測(cè)。Tian等[23]通過磷酸基團(tuán)標(biāo)記的引物進(jìn)行RPA 擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的恒溫可視化檢測(cè)，并且該方法成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米MON810 的檢測(cè)中，在試劑盒開發(fā)方面具有廣泛前景。但該技術(shù)的應(yīng)用研究仍處于起步階段，在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題，如RPA 與試紙條聯(lián)用時(shí)需對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；RPA的引物探針需研發(fā)專業(yè)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)

核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)，如凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光、核酸試紙條和顯色、生物傳感器等。核酸試紙條法是通過對(duì)引物或探針進(jìn)行生物素、地高辛等標(biāo)記，核酸擴(kuò)增結(jié)束后使用帶有相應(yīng)抗體的核酸試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)條帶的顯色情況進(jìn)行分析[24,25]。汪琳等[26]利用核酸試紙條技術(shù)顯示LAMP 擴(kuò)增結(jié)果，建立了一種可視化、快速、靈敏、特異的轉(zhuǎn)EPSPS 基因作物檢測(cè)方法，檢測(cè)限可達(dá)到10 個(gè)拷貝。Huang 等[27]基于CPA 擴(kuò)增開發(fā)了核酸試紙條產(chǎn)品，用于高靈敏度現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)CaMV 35S啟動(dòng)子。Liu等[28]開發(fā)了一種更有效的基于RPA和核酸試紙條的平臺(tái)，可以靈敏、特異且穩(wěn)定地檢測(cè)9 種轉(zhuǎn)基因材料中的P-35S 和T-nos。核酸試紙條可以代替電泳儀等大型儀器，與蛋白試紙條一樣快速、便攜。但是存在引物二聚體和氣溶膠產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象，需要搭配密封裝置。

在核酸擴(kuò)增過程中，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸，可以通過檢測(cè)焦磷酸達(dá)到檢測(cè)的目的，操作簡(jiǎn)單、用時(shí)少，大大降低了成本。鈣黃綠素作為金屬離子指示劑，可與錳離子結(jié)合，導(dǎo)致鈣黃綠素?zé)晒忖?，而核酸擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的焦磷酸根可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合錳離子，使鈣黃綠素恢復(fù)熒光，因而可通過熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)[29]。Mori 等[30]在反應(yīng)體系中加入鎂離子，與焦磷酸產(chǎn)生白色沉淀，設(shè)計(jì)了一種通過濁度定性、定量判斷LAMP 擴(kuò)增結(jié)果的裝置。翟景波等[31]研制了一種試劑盒，其中的試劑與焦磷酸反應(yīng)生成紅色的甲暨，根據(jù)顯色現(xiàn)象進(jìn)行定性判斷或通過測(cè)定吸光度實(shí)現(xiàn)定量分析。然而，該方法也會(huì)因?yàn)橐恍┓翘禺愋詳U(kuò)增顯色，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

2 基于蛋白水平的快速檢測(cè)技術(shù)

基于蛋白的轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)是以免疫分析為基礎(chǔ)的對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源表達(dá)蛋白進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的一種技術(shù)，操作相對(duì)簡(jiǎn)便、快速、成本低，國(guó)內(nèi)外均已研制出相關(guān)的快速檢測(cè)產(chǎn)品，在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中都得到了廣泛應(yīng)用[2]。

2.1 免疫層析試紙條技術(shù)

免疫層析試紙條技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛和成熟的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。在國(guó)家和地方農(nóng)業(yè)主管部門的轉(zhuǎn)基因督查監(jiān)管工作以及海關(guān)部門的口岸轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作中，都使用免疫層析試紙條進(jìn)行初篩檢測(cè)。該技術(shù)基于三明治夾心式技術(shù)原理，將抗體耦合到膠體金試紙條上，當(dāng)抗體和樣品中的抗原結(jié)合后，試紙條上就會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)來顯示檢測(cè)結(jié)果。蛋白試紙條檢測(cè)無需儀器和專業(yè)技術(shù)人員，就可直接進(jìn)行檢測(cè)，用時(shí)短且成本低廉，是目前最常用的快速檢測(cè)方法之一。Zeng等[32]研制了一種膠體金免疫層析試紙條，用于同時(shí)檢測(cè)CP4 EPSPS、Cry1Ab和Cry1Ac三種蛋白，其中CP4 EPSPS蛋白的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了0.1%。

目前，在政府監(jiān)管、企業(yè)進(jìn)口加工、篩查檢測(cè)等方面應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)品是cry1Ab/Ac、bar、Cp4-epsps等轉(zhuǎn)基因檢測(cè)蛋白試紙條，其檢測(cè)范圍可以覆蓋大部分常見轉(zhuǎn)化體。為了更好地滿足監(jiān)管和市場(chǎng)需求，G10 EPSPS、VIP3A、Cry1F 等新蛋白檢測(cè)試紙條以及多重試紙條陸續(xù)被研制出來。但是，免疫層析試紙條技術(shù)存在一定的局限性。它只能檢測(cè)有無外源蛋白存在，僅做定性分析，無法通過檢測(cè)轉(zhuǎn)化體特異性序列確定具體的轉(zhuǎn)基因品種。此外，這種檢測(cè)法靈敏度較低，存在假陰性的情況，只適合田間種植作物的快速篩查，不適于外源蛋白已發(fā)生降解或者經(jīng)深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)。

2.2 納米增強(qiáng)ELISA技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)是一種通過抗原和抗體的可視免疫反應(yīng)來檢測(cè)和鑒定目標(biāo)蛋白的技術(shù)，也是目前轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)蛋白定量分析的主要技術(shù)手段，具有設(shè)備需求低、易于讀取結(jié)果和應(yīng)用成熟的突出優(yōu)點(diǎn)。但該方法需要多步孵育和清洗步驟以及存在靈敏度不足等缺點(diǎn)，限制了其在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中的應(yīng)用。金納米顆粒具有較高的比表面積和獨(dú)特的理化性質(zhì)，與DNA、抗體、酶和其它生物分子結(jié)合，可以增強(qiáng)反應(yīng)信號(hào)以應(yīng)用于生化檢測(cè)。近年來，基于納米顆粒和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）的高靈敏度蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，即納米增強(qiáng)ELISA 技術(shù)（Nano-ELISA）被開發(fā)出來。Jia 等[33]用目標(biāo)蛋白p53 的單克隆抗體修飾微磁珠，用另一種單克隆檢測(cè)器抗體和辣根過氧化物酶（HRP）修飾金納米顆粒（AuNPs），通過抗體與抗原之間的相互作用形成夾心結(jié)構(gòu)，AuNPs 表面的HRP 催化氧化底物并產(chǎn)生反映目標(biāo)蛋白數(shù)量的光信號(hào)，用這種方法在不到2h的時(shí)間內(nèi)即可檢測(cè)到低至5 pg/mL 的蛋白質(zhì)。高鴻飛[34]開發(fā)了一種簡(jiǎn)易、靈敏的Nano-ELISA 便攜裝置，可以在1.5 h 內(nèi)完成外源蛋白一步式定量分析，以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，未來該技術(shù)可能在轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)中得到應(yīng)用。

3 其它快速檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器是一種新型分析技術(shù)，基于目標(biāo)化合物和識(shí)別元件之間的選擇性相互作用，如堿基互補(bǔ)配對(duì)和抗原抗體識(shí)別等，分析產(chǎn)生電或光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)識(shí)別[35]。生物傳感器主要包括識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件兩部分，識(shí)別元件主要是核酸、蛋白等生物材料，信號(hào)轉(zhuǎn)換元件主要是光、電、磁、熱等[36]。生物傳感器具有靈敏度高、分析速度快、通量高等優(yōu)點(diǎn)，非常適合轉(zhuǎn)基因的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩查，并已在相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品研究中取得了突破性進(jìn)展[25]。Volpe 等[37]使用磁珠作為固定載體研發(fā)了一種免疫磁電化學(xué)傳感器（IMES），用以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米粉中Cry1Ab/Ac蛋白的含量。高鴻飛[34]合成了新型碳納米粒子，將其和轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)抗體結(jié)合修飾在工作電極上，首次構(gòu)建了無需標(biāo)記任何信號(hào)分子的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于轉(zhuǎn)基因作物的快速定量分析，該方法檢測(cè)Cry1Ab 蛋白時(shí)分析靈敏度達(dá)3.0 pg/mL，檢測(cè)PAT/bɑr蛋白分析靈敏度達(dá)0.05 ng/mL，高于絕大多數(shù)已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)蛋白分析方法，目前已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因油菜RF3，轉(zhuǎn)基因水稻BT63和轉(zhuǎn)基因玉米MON810的定量分析。在上述方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研制了微型電極芯片，開發(fā)了手持式檢測(cè)設(shè)備，操作簡(jiǎn)易，可以直接讀取含量數(shù)值而無需進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，非常適合非專業(yè)人員使用，能夠在30 min 以內(nèi)完成定量分析[34]。

表面等離子體共振（SPR）技術(shù)是一種基于物理光學(xué)原理的新型生化分析技術(shù)。近年來，因其具有檢測(cè)用量少、高靈敏度、高特異性、實(shí)時(shí)和快速等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定性及定量檢測(cè)、病毒鑒定、環(huán)境微生物檢測(cè)等[38]。程志強(qiáng)等[39]利用表面等離子共振成像技術(shù)，分析了玉米的6 種轉(zhuǎn)基因序列和6 種調(diào)控元件，將探針與靶序列結(jié)合的信號(hào)放大40倍左右，且省去了復(fù)雜的PCR 擴(kuò)增環(huán)節(jié)。Jang等[40]研制了一種高靈敏的LSPR 生物傳感芯片，能夠高度靈敏地現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物。

4 總結(jié)與展望

基于核酸水平的轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)，需要在核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)三個(gè)步驟同時(shí)優(yōu)化提速。首先，對(duì)于核酸提取，要加快便攜簡(jiǎn)易的研磨裝置，特別是對(duì)于種子材料，如何在現(xiàn)場(chǎng)快速研磨，是提速的關(guān)鍵。DNA 直接提取法和核酸提取試紙條等可以省略核酸純化步驟，將細(xì)胞裂解液作為模板直接進(jìn)行擴(kuò)增可大大縮短時(shí)間，簡(jiǎn)化操作。但是，如何克服細(xì)胞內(nèi)離子、蛋白等抑制劑對(duì)核酸擴(kuò)增的不利影響，是將快速核酸提取應(yīng)用于核酸檢測(cè)需要解決的問題[41]。其次，對(duì)于核酸擴(kuò)增環(huán)節(jié)，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)PCR 技術(shù)對(duì)大型儀器的依賴，具有較好的應(yīng)用前景。其中，RPA 擴(kuò)增是特異性最好、最為快速的方法。但如何降低RPA 酶的成本，提升酶的運(yùn)輸保存穩(wěn)定性，優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，這些問題仍需進(jìn)一步研究。第三，對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)階段，一般分為實(shí)時(shí)檢測(cè)和終點(diǎn)檢測(cè)兩種類型。終點(diǎn)檢測(cè)更加貼近快速、可視的檢測(cè)需求。核酸試紙條和顯色法均屬于終點(diǎn)檢測(cè)，如何避免氣溶膠污染，保證靈敏度和特異性，是應(yīng)用的關(guān)鍵?？偟膩碚f，基于核酸的快速檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)靶標(biāo)更加廣泛，可以檢測(cè)非目標(biāo)蛋白表達(dá)的序列如載體構(gòu)建特異性序列、轉(zhuǎn)化體特異性序列、篩選元件等，也可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化體身份，更加真實(shí)、全面地反映產(chǎn)品的特征，是最接近實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的手段，具有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值。目前，優(yōu)化三個(gè)步驟的相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品，建立一體化、全流程的檢測(cè)策略，做好三個(gè)步驟的有效銜接，實(shí)現(xiàn)核酸快速提取技術(shù)、RPA 技術(shù)和試紙條檢測(cè)技術(shù)或可視化檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，需要探索和突破。

基于蛋白水平的轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)無需進(jìn)行核酸提取步驟，樣品只需要簡(jiǎn)單研磨即可進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，非常適合轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。特別是免疫層析試紙條，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研發(fā)出了很多成熟的產(chǎn)品，在轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。但是該技術(shù)無法進(jìn)行轉(zhuǎn)化體身份確認(rèn)和定量分析，是其進(jìn)一步應(yīng)用的局限所在。而且，隨著轉(zhuǎn)基因外源蛋白種類和數(shù)量的不斷增多，如何制備高質(zhì)量轉(zhuǎn)基因蛋白靶標(biāo)抗體是現(xiàn)今亟待解決的重點(diǎn)技術(shù)問題。特別是對(duì)于某些結(jié)構(gòu)高度相似的轉(zhuǎn)基因蛋白，如Bt 系列蛋白，研制特異性抗體是當(dāng)前一大難點(diǎn)。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這類蛋白的跟蹤、分析和研究，建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和生產(chǎn)線。

目前，世界上許多國(guó)家或地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行強(qiáng)制定量標(biāo)識(shí)制度，且規(guī)定了較低的標(biāo)識(shí)閾值，如歐盟閾值為0.9%，巴西和澳大利亞定量標(biāo)識(shí)閾值為1%。我國(guó)目前施行的是定性標(biāo)識(shí)，但不可否認(rèn)定量標(biāo)識(shí)管理將是未來發(fā)展的趨勢(shì)。因此，發(fā)展精準(zhǔn)、快速的定量檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫。生物傳感器技術(shù)非常容易實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化、微型化和集成化，為基于蛋白水平的現(xiàn)場(chǎng)快速定量分析提供了一個(gè)可行的技術(shù)方案[34]。將納米材料合成技術(shù)、等離子共振技術(shù)等與生物傳感器技術(shù)結(jié)合，發(fā)展多組分免疫傳感分析研究，進(jìn)一步提升檢測(cè)效率，研發(fā)便攜式設(shè)備，加強(qiáng)應(yīng)用推廣，將是轉(zhuǎn)基因高靈敏、現(xiàn)場(chǎng)快速定量分析的發(fā)展方向。