秦浩仁 楊向紅

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110004)

自1986年在結直腸癌組織中首次發(fā)現神經營養(yǎng)因子酪氨酸受體激酶(NTRK)基因融合以來[1],NTRK基因融合作為原肌球蛋白受體激酶(TRK)致癌激活最常見的驅動因素[2]，導致了許多不同組織學類型成人和兒童腫瘤的發(fā)生。NTRK基因融合在一些罕見的腫瘤，如嬰兒型纖維肉瘤(IFS)、先天性中胚層腎瘤(CMN)(細胞型)、分泌型乳腺癌(SBC)、乳腺樣分泌性癌(MASC)中發(fā)生率極高，甚至可作為其特征性改變，而在一些常見的腫瘤類型中發(fā)生率較低。目前針對NTRK基因融合的檢測手段有免疫組織化學法(IHC)、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、熒光原位雜交(FISH)、基于DNA和RNA的高通量二代測序(NGS)，每種檢測方法都有各自的優(yōu)點和局限性，結合腫瘤的組織學類型，合理利用每種檢測方法的特點，制定檢測策略，可以提高其陽性檢出率。針對NTRK基因融合的靶向治療，第一代TRK酪氨酸激酶抑制劑Larotrectinib和Enrectinib已分別于2018與2019年在美國、日本及歐洲等地批準上市，用于治療局部晚期、遠處轉移的NTRK基因融合陽性成人和兒童腫瘤患者。針對第一代抑制劑使用后出現的靶向耐藥突變，第二代TRK抑制劑Selitrectinib(LOXO-195)和Re-potrectinib(TPX-0005)也已經被設計出來，在臨床前試驗中展現出了比第一代抑制劑更強的活性，由此也產生了TRK抑制劑的序貫療法。目前有關這兩種藥物的臨床試驗還在進行中。本文將從TRK蛋白的生理與功能、NTRK基因融合與腫瘤發(fā)生、NTRK基因融合的檢測、NTRK基因融合的靶向治療4個方面進行梳理闡述。

1 TRK蛋白的生理與功能

1.1 TRK蛋白的結構

TRK蛋白來自單跨膜受體型酪氨酸蛋白激酶家族，家族成員包括TRKA、TRKB、TRKC，分別由NTRK1、NTRK2以及NTRK3編碼。NTRK1位于染色體1q23.1，轉錄出含有開放閱讀框(ORF)的轉錄本4種，其中典型的TRKA含有796個氨基酸[3]。NTRK2位于染色體9q21.33，轉錄出含有ORF的轉錄本8種，其中典型的TRKB含有822個氨基酸。NTRK3位于染色體15q25.3，轉錄出含有ORF的轉錄本14種，其中典型的TRKC含有839個氨基酸。TRK蛋白由胞外配體結合區(qū)、中間跨膜區(qū)和含有酪氨酸激酶催化結構域的胞內區(qū)構成，胞外的結構域依次是1個富含半胱氨酸的簇(C1)，3個富含亮氨酸的重復序列(LRR1-3)，1個富含半胱氨酸的簇(C2),2個免疫球蛋白樣的結構域(Ig1、Ig2),其中LRR1-3模體是TRK蛋白所特有的[2]，胞內區(qū)含有5個主要的酪氨酸殘基，其中中間3個酪氨酸殘基(TRKA的Y676、Y680、Y681，TRKB的Y718、Y722、Y723，TRKC的Y705、Y709、Y710)位于激酶結構域的活化環(huán)上，是激酶活化所必需的，另外2個位于激酶結構域的兩側(TRKA的Y496、Y791，TRKB的Y532、Y833，TRKC的Y516以及Y834)，作為一些連接蛋白和酶的結合位點。

1.2 TRK蛋白的配體及信號通路

神經生長因子(NGF)作為配體與TRKA高親和力結合，腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)因子4(NF-4)分別作為配體與TRKB高親和力結合，NF-3作為配體與TRKC高親和力結合，NF-3能與所有TRK蛋白結合，但是與TRKC的親和力最高。配體主要與相應TRK受體的Ig2結構域結合(TRKB與BDNF、NF-3結合時除了Ig2也需要Ig1結構域的參與[4])，形成TRK二聚體，TRK蛋白構象改變引起激酶活性增強，使活化環(huán)內的酪氨酸殘基(TRKA的Y676、Y680、Y681或者TRKB、TRKC相應位置殘基)發(fā)生自我磷酸化，從而導致激酶完全活化，再引起TRKA的Y496、Y791或者TRKB、TRKC相應位置的殘基磷酸化，其作為連接蛋白和酶的結合位點分別與相應的蛋白結合，驅動下游通路，其中TRKA的Y496、TRKB的Y532、TRKC的Y516與連接蛋白SHC和FRS2結合，驅動RAS/ERK通路及PI3-K/AKT通路，TRKA的Y791、TRKB的Y833、TRKC的Y834與PLCγ結合，驅動IP3-Ca2+/DAG-PKC通路，調控細胞核內相關基因的轉錄、參與神經元分化與存活、細胞的增殖、突觸形成與可塑性等過程[2,5-6]。值得注意的是，上述3條通路是主要的信號通路，但是也存在著一些不依賴于Y496、Y532、Y516位點相互作用的信號通路，故關于TRK信號通路需進一步研究[2]。

1.3 TRK蛋白的作用

TRK蛋白主要在神經組織中表達，在胚胎發(fā)育和神經系統(tǒng)正常功能中發(fā)揮重要作用。TRKA可以在背根和三叉神經節(jié)中的痛覺神經元中表達[7-8]，TRKB在結狀神經節(jié)和巖神經節(jié)的神經元中表達，TRKC則在背根神經節(jié)中的本體感覺神經元中表達[9]，從而參與這些感覺神經節(jié)中神經元的分化與存活。TRK蛋白在記憶、疼痛感覺、本體感覺等方面起作用。具體來說，TRKA主要與疼痛感知有關，NTRK1基因突變可以引起先天性對疼痛不敏感伴無汗癥[10]；TRKB主要與能量平衡、攝食、學習、記憶、運動行為、疼痛感覺等有關，NTRK2基因突變可以導致能量失衡、攝食增加、肥胖和發(fā)育滯后[11]。TRKC蛋白主要與本體感覺有關，除了在神經系統(tǒng)中發(fā)揮作用外，也在心血管系統(tǒng)、卵巢、免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用[2，6]，值得一提的是TRK蛋白還在平滑肌細胞中有表達。

2 NTRK基因融合與腫瘤發(fā)生

雖然在一些腫瘤中可以檢測到NTRK基因突變、TRK剪接體變異、TRK過表達等分子改變，但是NTRK基因融合是TRK蛋白致癌激活的最常見的機制[2]。通過對TRK蛋白的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的臨床前和臨床研究，證實了NTRK基因融合是許多成人和兒童腫瘤的致癌驅動因素。另外值得注意的是，NTRK基因融合與信號通路中一些驅動因子的致癌改變(例如BRAFV600E基因突變、KRAS基因突變、NRAS基因突變、EGFR基因突變、ALK基因融合、ROS1基因融合等)相互排斥[12-13]。雖然總體上NTRK基因融合發(fā)生率在所有實體腫瘤中占1%左右，但是在一些罕見腫瘤中發(fā)生率高達90%以上。

2.1 NTRK基因融合機制

含有激酶結構域的NTRK基因3′端和其上游伴侶基因的5′端通過染色體內或染色體間重排的方式連在一起形成融合基因，在上游伴侶基因的啟動子驅動下開始轉錄，最終翻譯出NTRK基因的嵌合蛋白。嵌合蛋白的碳端含有完整的TRK激酶結構域，氮端一般含有來自上游伴侶的一個或多個可以介導二聚化的結構域(卷曲螺旋結構域、鋅指結構域、WD結構域、Pointed結構域等)[2，12]，嵌合蛋白這種結構可以導致其不依賴于配體的二聚化，從而激活碳端TRK激酶結構域，驅動下游通路，誘導細胞存活、增殖，致腫瘤發(fā)生。目前在腫瘤中發(fā)現的NTRK基因上游5′端的伴侶基因多達80多種[3]。

2.2 NTRK基因融合發(fā)生頻率

根據NTRK基因融合在腫瘤中發(fā)生的頻率，可以將腫瘤分為2類[2]：第一類是高度富集NTRK基因融合且發(fā)生頻率高達90%以上的罕見腫瘤，包括IFS、CMN(細胞型)、SBC、MASC 4種。在這4類腫瘤中，融合類型主要是ETS變異轉錄因子6(ETV6)-NTRK3融合，這種基因改變可以作為這4種腫瘤的診斷要點[2，6]；第二類是NTRK基因融合發(fā)生頻率在25%以下的一些常見腫瘤，包括甲狀腺癌、結直腸癌、肺癌、肉瘤、中樞神經系統(tǒng)腫瘤、黑色素瘤、Spitz樣腫瘤、乳腺癌、膽管癌、胃腸道間質瘤、胰腺癌等實體瘤以及急性髓系白血病和急性淋巴系白血病等血液系統(tǒng)腫瘤[14]，上述腫瘤中具體融合類型以NTRK1、NTRK3融合為主。

3 NTRK基因融合的檢測方法

3.1 FISH檢測

FISH是在DNA水平上檢測甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織樣本中染色體重排的方法。ETV6-NTRK3融合在上述IFS、CMN(細胞型)、SBC及MASC 4種罕見腫瘤中高度富集，使用ETV6商品化分離探針檢測ETV6-NTRK3融合十分有效。一般在實驗室中可以使用研究者已經設計好的或者商品化的NTRK1、NTRK2、NTRK3分離探針來進行NTRK基因融合的檢測，但是對于融合類型未知的腫瘤來說，分離信號陽性并不能確定伴侶基因類型以及具體融合方式(伴侶基因-NTRK還是NTRK-伴侶基因)。FISH是在DNA水平上檢測是否發(fā)生基因斷裂、染色體重排，因此即使信號陽性也無法確定這種NTRK基因的重排是否發(fā)生嵌合轉錄及表達。

3.2 RT-PCR檢測

RT-PCR是在RNA水平上對融合轉錄本進行檢測，需要分別對斷裂點上游的鄰近外顯子和斷裂點下游的鄰近外顯子設計引物，因此該檢測前提條件是已知NTRK具體基因類型和上游具體的伴侶基因以及二者基因相應的斷裂位點。有研究針對25例MASC患者應用標準RT-PCR檢測ETV6基因5號外顯子-NTRK3基因15號外顯子這一經典型融合轉錄本，發(fā)現均未檢出，反而用更加靈敏的巢式RT-PCR檢出4例經典型；另外通過標準RT-PCR和(或)巢式RT-PCR均檢出5例患者具有非典型外顯子4-外顯子14或外顯子5-外顯子14融合轉錄本[15]。NTRK上游的伴侶基因類型、NTRK基因斷裂點的多樣性以及RNA在FFPE樣本中的提取都會限制該項技術的使用。

3.3 IHC檢測

IHC檢測具有成本低、檢測時間短的優(yōu)點，適合于臨床中的篩查工作的開展。IHC檢測采用的是抗廣譜TRK抗體(pan-TRK)，該抗體是來自英國Abcam公司以及美國Roche/Ventana公司的兔重組單克隆抗體(EPR17341)，該抗體與TRKA、TRKB、TRKC蛋白碳端的一段保守的特有的肽序列反應。目前，文獻中大部分使用來自Abcam公司的抗體，本文基于使用來自英國Abcam公司抗體的文獻，陽性判定標準為至少1%的腫瘤細胞被染色，染色定位于細胞膜、細胞漿、細胞核、核周(核膜)；睪丸組織、結腸黏膜下神經叢神經節(jié)和皮質腦組織染色陽性可以作為陽性對照，而非腫瘤性淋巴細胞、肝細胞、結直腸上皮、肺泡上皮和腎皮質染色陰性可以作為陰性對照[16]。根據HECHTMAN等[16]研究發(fā)現，在20例IHC真陽性病例中，染色模式除了全部是細胞漿陽性以外，有的還同時合并核膜陽性或者胞膜陽性或者核陽性，具體如下：核纖層蛋白基因(LMNA)編碼的蛋白質位于細胞核膜內表面，而LMNA-NTRK1基因融合的IHC染色模式為核膜陽性，LMNA編碼的蛋白質定位與IHC染色定位一致；原肌球蛋白基因3/4(TPM3/4)編碼的蛋白定位在細胞膜上，而TPM3/4與NTRK基因融合的IHC染色模式為膜陽性，TPM3/4編碼的蛋白質定位與IHC染色定位一致；而腫瘤壞死因子基因(TRAF)編碼的蛋白質定位于細胞膜，TRAF2-NTRK2基因融合的IHC染色模式為膜陽性，TRAF編碼的蛋白質定位與IHC染色定位一致；6例ETV6-NTRK3基因融合中3例 IHC染色定位于細胞核，與ETV6基因編碼的轉錄因子定位于細胞核一致[16]。故基于以上染色規(guī)律，HECHTMAN等[16]認為NTRK不同融合類型的特異染色模式似乎與上游融合伴侶基因編碼蛋白的亞細胞定位有關。但是有關TPM-NTRK基因融合的腫瘤IHC染色模式似乎并不是一致的，HECHTMAN等[16]研究發(fā)現結直腸癌以及肺腺癌的TPM3-NTRK1基因融合IHC染色為細胞漿陽性合并細胞膜陽性；SOLOMON等[17]研究發(fā)現脂肪纖維瘤病樣神經腫瘤的TPM3-NTRK1基因融合IHC染色只有細胞漿陽性；GATALICA等[18]的研究發(fā)現肺腺癌的TPM3-NTRK1基因融合IHC染色為細胞漿陽性同時合并細胞膜陽性以及細胞核陽性，而在結直腸癌中為細胞漿陽性。TPM3相關染色模式的不確定性是否與TPM3編碼的蛋白的生理功能有關、是否與腫瘤類型有關還需更多實驗驗證。RUDZINSKI等[19]研究發(fā)現IHC染色模式與NTRK基因類型有關，NTRK1/2基因融合IHC染色僅細胞漿陽性(14/14)；NTRK3基因融合IHC染色為細胞核陽性(15/16)，可以合并細胞漿陽性，15例ETV6-NTRK3基因融合的IHC染色顯示，11例細胞核陽性合并細胞漿陽性，余4例中除去1例假陰性，3例僅細胞核陽性?？梢钥闯黾词故褂脕碜酝还尽⑼豢寺√柕目贵w，HECHTMAN等[16]與RUDZINSKI等[19]的IHC染色結果并不完全一致，差異主要體現在NTRK3上，造成此差異的原因在于細胞漿陽性判讀方面，RUDZINSKI等[19]將IHC細胞漿陽性的閾值設定為50%，而HECHTMAN等[16]保持了1%的閾值。綜上可以看出NTRK融合陽性的腫瘤中IHC染色模式主要定位在細胞漿，與判讀標準對于閾值的設定有一定關系。目前不同研究報道的IHC染色檢測NTRK融合的靈敏度和特異度分別為95.2%(20/21)、100%(22/22)[16]；96.7%(29/30)、97.9%(47/48)[19]；75%(21/28)、95.9%(3 942/4 108)[18]；87.9%(58/66)和81.1%(257/317)[17]。綜合分析以上數據，IHC檢測靈敏度為75%～96.7%，特異度為81.1%～100%。SOLOMON等[17]使用IHC檢測NTRK1、2、3的靈敏度分別為96.2%、100%以及79.4%。據上述4篇文獻[16-19]中假陰性標本的NTRK基因類型以及NTRK基因分別的IHC檢測靈敏度可知，NTRK3基因融合是IHC檢測靈敏度下降的主要因素。對于IHC檢測的特異度而言，由于TRK一般在神經和平滑肌組織中生理性表達，因此假陽性主要出現在有著神經和平滑肌分化的腫瘤中，這些假陽性的染色模式主要是胞漿陽性或者膜陽性，而沒有核陽性[17]。值得注意的是SOLOMON等[17]研究發(fā)現對乳腺癌和涎腺癌進行IHC檢測的特異度分別為82%和52%，應注意這兩種腫瘤假陽性的出現，對肉瘤進行IHC檢測的靈敏度和特異度均較低，建議采用二代測序的方法進行檢測。

3.4 NGS分析

NGS分析分為基于DNA的NGS分析和基于RNA的NGS分析。對于DNA-NGS分析而言，目前靶向panel分析有Memorial Sloan Kettering Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets(MSK-IMPACTTM)、FoundationOneCDx(Foundation Medicine)、FoundationOne?Heme及UW Oncoplex等，他們一般使用雜交捕獲技術對靶基因富集之后再進行測序。研究中常使用的MSK-IMPACT的panel包括NTRK基因在內的468個基因的全部外顯子以及一些選定的內含子(NTRK1的3、7～12號內含子來檢測NTRK1融合,NTRK2的15號內含子來檢測NTRK2融合，ETV6的4、5號內含子來檢測最常見的ETV6-NTRK3融合)，NTRK3的13、14、15號內含子沒有被覆蓋的原因可能是其長度過長，并含有高度的重復序列。DNA-NGS分析檢測NTRK基因融合的靈敏度取決于融合斷裂點是否被panel所覆蓋，因為斷裂點通常發(fā)生在內含子區(qū)域，對于NTRK3來說，常見斷裂點所在的內含子都未被覆蓋，所以常會導致假陰性的發(fā)生(非ETV6的上游基因伴侶-NTRK3融合會檢測不出來)。DNA-NGS分析檢測NTRK融合的特異度取決于檢測出的NTRK基因融合是否可以表達NTRK融合蛋白，而這往往還需要使用RNA-NGS分析進行確認。DNA-NGS分析除了可以檢測基因融合，還可以同時檢測基因突變、擴增(拷貝數變異)、缺失、微衛(wèi)星穩(wěn)定性，同時由于NTRK融合與常見的致癌改變(BRAF、RAS、EGFR等)相互排斥，因此可以根據這些常見致癌基因的狀態(tài)來決定是不是要進行NTRK融合的檢測。對RNA-NGS分析而言，靶向panel分析主要有ArcherFusionPlexTM、MSK Solid Fusion及MGH Solid Fusion等，他們都使用anchored multiplex PCR技術[20]，這種技術可以在NTRK上游伴侶基因未知的情況下對靶向區(qū)域富集來進行檢測。這種靶向RNA-NGS的優(yōu)勢在于直接證實是否產生融合轉錄本，并且能看到相應的融合基因和斷裂點處的外顯子。RNA的不穩(wěn)定性、易降解是RNA測序的限制因素。

3.5 NTRK基因融合檢測策略

每種技術都有優(yōu)點和局限性，在NTRK基因融合的篩查與確認過程中，除了合理利用上述檢測方法，還要考慮腫瘤的類型，并基于NTRK基因融合與其他基因改變互斥的特點，形成檢測策略情況：如果該腫瘤是一個高度富集NTRK基因融合的罕見組織學類型(如IFS、MASC、SBC以及CMN)，可以使用FISH檢測NTRK3融合情況；如果該腫瘤是一個NTRK基因融合發(fā)生率較低的常見腫瘤類型，有兩種選擇：一是先進行IHC篩查，再對IHC染色陽性的進行NGS分析以進一步確認[21]。二是首先使用靶向DNA-NGS分析，檢測結果又會出現3種情況：①檢測出文獻中報道過的能表達嵌合蛋白的伴侶基因-NTRK基因融合；②檢測出新發(fā)現的伴侶基因-NTRK基因融合；③檢測出MAPK通路中的BRAF、RAS、EGFR、ALK等基因均為野生型且NTRK基因融合陰性。針對情況①，判定為融合陽性；針對情況②和③，再進行靶向RNA-NGS分析確認[22]。

4 NTRK基因融合的靶向治療

從曲妥珠單抗治療HER2陽性的乳腺癌、伊馬替尼治療費城染色體陽性的慢性粒細胞白血病、吉非替尼治療EGFR突變的肺癌到PD-1/PD-L1抑制劑帕博利珠單抗治療高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定的實體腫瘤，腫瘤的靶向治療已經從針對特定的組織學類型的窄譜治療過渡到了針對特定的生物標記物的廣譜治療。繼PD-1/PD-L1抑制劑之后，與腫瘤類型無關的廣譜抗癌藥拉羅替尼(Larotrectinib)和恩曲替尼(Enrectinib)是第一代針對TRK蛋白的TKI，通過與ATP競爭性結合激酶結構域，阻礙酪氨酸殘基的磷酸化，并從而阻斷下游通路，發(fā)揮著抑制NTRK融合所介導的腫瘤細胞生長增殖的作用。拉羅替尼是針對NTRK基因融合的高度選擇性抑制劑，而恩曲替尼是針對NTRK基因融合、ROS1基因融合、ALK基因融合的多激酶抑制劑。拉羅替尼于2018年由美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市，于2019年被歐洲藥品管理局批準營銷授權；恩曲替尼于2019年被日本厚生勞動省和美國FDA批準上市，這兩個藥物都可以用于治療攜帶NTRK基因融合的局部晚期的、發(fā)生遠處轉移的成人和兒童實體腫瘤患者，同樣適用于手術切除可能導致嚴重并發(fā)癥且無滿意替代治療方案、替代治療后又進展的腫瘤患者；另外恩曲替尼還可以用于治療ROS1基因融合陽性的遠處轉移的非小細胞肺癌成人患者?；颊呓浀谝淮鶷RK抑制劑治療一段時間后會產生耐藥問題，耐藥分為靶向耐藥和脫靶耐藥。靶向耐藥的機制是TRK融合蛋白的激酶結構域突變，導致氨基酸的替代，這種替代主要發(fā)生在3個位置：solvent front(溶劑前沿)、gatekeeper(門衛(wèi))殘基以及DFG模體[23]，然后通過在空間上阻礙TRK抑制劑和激酶的結合或改變激酶結構域的構象或改變ATP結合的親和力引起耐藥[24]。這種耐藥突變與在ALK基因融合陽性、ROS1基因融合陽性的肺癌中識別的耐藥突變同源[3,25]。脫靶耐藥的機制主要是其他受體酪氨酸激酶的基因改變或者TRK下游通路的驅動因子的基因改變，例如MET擴增、BRAFV600E突變、KRAS熱點區(qū)突變以及IGF1R的活化等。第二代TRK抑制劑Selitrectinib(LOXO-195)和Repotrectinib(TPX-0005)的出現是為了解決第一代抑制劑的靶向耐藥突變問題，他們被設計成低分子量的大環(huán)狀結構來容納那些替代之后的氨基酸的大的側鏈，避免空間上的碰撞[24,26]。與拉羅替尼、恩曲替尼類似，Selitrectinib是針對NTRK的高選擇抑制劑，Repotrectinib是針對NTRK、ROS1、ALK的多激酶抑制劑，二者體內和體外研究結果均獲得肯定，目前對應的臨床試驗(NCT03215511、NCT03093116)還在進行中。

5 小結與展望

被譽為“鉆石突變”的NTRK基因融合作為成人和兒童腫瘤的致癌機制之一，高度富集于某些罕見腫瘤，雖然在常見的腫瘤組織類型中占比不足5%，但有效性及安全性都有不錯表現的靶向藥物的上市，勢必給腫瘤患者的治療手段多一種選擇。隨著NTRK基因融合的檢測方法進一步完善，不良反應更少、耐受性更高的TRK抑制劑的進一步研發(fā)，NTRK基因融合作為靶向治療的新靶點，正改變著腫瘤治療的格局，為腫瘤患者帶來希望。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：秦浩仁、楊向紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The manuscript was drafted and revised byQINHaorenandYANGXianghong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.