張子龍,趙 雯,黃小玉,徐海芳,師曉敏,劉 晨,張冰玉,楊家樂,呂玉紅, ,岳昌武,
(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,延安市微生物藥物創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化重點實驗室,陜西延安 716000;2.河南省駐馬店市農(nóng)科院,河南駐馬店 463001)
稀有糖是被定義為“自然界中數(shù)量有限的單糖及其衍生物”的一類單糖或糖醇,稀有糖主要存在于天然植物中,與自然界中大量存在的葡萄糖和果糖相比存量非常稀少[1]。目前已報道發(fā)現(xiàn)約50種,已被廣泛應(yīng)用于保健食品、嬰幼兒配方食品、乳制品、飲料等食品生產(chǎn)和醫(yī)療臨床產(chǎn)品生產(chǎn)[2]。稀有糖類作為益生元的重要來源,一般不能為動物直接消化吸收利用,但可被腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌分解吸收,促進有益細菌生長繁殖,對維持腸道菌群平衡具有重要意義[3]。目前,常見的有開發(fā)價值的活性稀有糖類主要有塔格糖、阿洛酮糖、異麥芽酮糖(帕拉金糖)、L-阿拉伯糖和海藻糖等,也因其具有降血糖、降血脂、提高免疫力等重要的生物活性[4]而備受食品、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域關(guān)注。隨著人們對稀有糖產(chǎn)品功能認可度不斷提高,中國食糖結(jié)構(gòu)的日益優(yōu)化,國內(nèi)稀有糖的需求日益增長,將為功能性稀有糖的開發(fā)、生成及推廣帶來良好的機遇[5]。然而,由于稀有糖研發(fā)基礎(chǔ)薄弱、生產(chǎn)工藝落后、自主知識產(chǎn)權(quán)欠缺等因素,國內(nèi)稀有糖生產(chǎn)還有較大提升空間。本文將從稀有糖的結(jié)構(gòu)、生物活性及生物轉(zhuǎn)化合成等方面,對近年來稀有活性糖的研究進展進行回顧,并對其應(yīng)用和工業(yè)化發(fā)展趨勢進行展望,為國內(nèi)活性稀有糖的研究開發(fā)以及產(chǎn)業(yè)化利用提供理論依據(jù)。
從化學(xué)結(jié)構(gòu)上可以將稀有糖類分為稀有糖和稀有糖醇兩種主要結(jié)構(gòu)類型,二者化學(xué)結(jié)構(gòu)的差別導(dǎo)致了其生物活性有較大差異。大量的研究表明,活性稀有糖類的基本構(gòu)成單糖單元組成、特殊基團及構(gòu)象等結(jié)構(gòu)的差異決定了其生物活性的多樣性[6]。無論是稀有糖或是稀有糖醇,往往都有D-型構(gòu)象也有L-型構(gòu)象,而食品工業(yè)中利用價值較高的稀有糖往往是D-糖或D-糖醇,提示人們在食品加工添加稀有糖時需要關(guān)注稀有糖的構(gòu)象差異,才能確保產(chǎn)品的生物功能。
稀有糖具有糖類共有的多羥基醛類或者酮類化學(xué)結(jié)構(gòu)特征(圖1),目前研究較多的稀有糖有塔格糖(Tagatose)、D-阿洛酮糖(D-Psicose)和D-甘露糖(DMannose)、D-核酮糖(D-Ribulose)、D-鼠李糖(DRhamnose)、D-山梨糖(D-Sorbose)和D-木酮糖(DXylulose)。稀有二糖主要異麥芽酮糖/帕拉金糖(Isomaltulose/Palatinose)、L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、乳果糖(Lactulose)和海藻糖(Trehalose)等為主,這些活性糖大多是由乳糖、果糖、蔗糖和海藻多糖等生物質(zhì)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化而來,因而具有不同于常見天然單糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]。其中塔格糖為果糖的 “差向異構(gòu)體”,是以乳糖為原料,經(jīng)水解獲得半乳糖后經(jīng)異構(gòu)化酶處理轉(zhuǎn)化生成的含酮基的六碳己酮糖[7]。阿洛酮糖則是由D-果糖經(jīng)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶經(jīng)生物轉(zhuǎn)化而得到的D-果糖C3所對應(yīng)的差向異構(gòu)體[8]。異麥芽酮糖又叫帕拉金糖,是由葡萄糖和果糖以α-1,6糖苷鍵連接形成的還原性二糖,為蔗糖的1種異構(gòu)體[9]。L-阿拉伯糖是一種戊醛糖,又稱樹膠醛糖、果膠糖,常與其他單糖結(jié)合,以雜多糖的形式存在于膠質(zhì)、半纖維素、果膠酸、細菌多糖及某些糖苷中,可經(jīng)酸、堿水解或生物酶解而獲得[10]。乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖),是由果糖和半乳糖組成的乳糖的同分異構(gòu)體,該糖在自然界中并不存在[11]。作為自然界中最穩(wěn)定的一類天然雙糖,海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的一個非還原性雙糖,按照海藻糖的構(gòu)象又可以將其分為α,β-海藻糖(Neotrehalose,新海藻糖)、α,α-海藻糖(Mushroom sugar,蘑菇糖)、和β,β-海藻糖(Isotrehalose,異海藻糖)。其中只有α,α-海藻糖在自然界中以游離狀態(tài)存在,即為通常所說的海藻糖,而α,β-型海藻糖和β,β-型海藻糖在自然界中很少見,可由化學(xué)合成途徑獲得[12]。
圖 1 幾種重要生物活性稀有糖的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of important bioactive rare sugars
稀有糖醇是相應(yīng)稀有糖的酮基經(jīng)催化氫化還原而被相應(yīng)的羥基等取代生成的多元醇(圖2),因其多由相應(yīng)的稀有糖類衍生而來,因此還具有某些糖的化學(xué)和生物屬性。在食品工業(yè)有較大利用價值的稀有糖醇主要包括:麥芽糖醇(Maltitol)及其同分異構(gòu)體異麥芽糖醇(Isomaltitol)、山梨醇(Sorbitol)及其同分異構(gòu)體異山梨糖醇(Isosorbide)、巖藻糖醇(Fucitol)、蘇糖醇(Threitol)、艾杜糖醇(Iditol)、甘露醇(Mannitol)、塔羅糖醇(Talitol)以及阿拉伯糖醇(Arabinitol)等,這些活性糖醇大多數(shù)既有D-糖醇構(gòu)象也有L-糖醇構(gòu)象,且兩種構(gòu)象的生物活性差別較大。
圖 2 幾種重要生物活性稀有糖醇的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of important bioactive rare sugar alcohols
圖3總結(jié)了稀有糖類主要影響腸道菌群-腸腦軸而發(fā)揮生物活性的機制[13],食物中稀有糖類往往不能被胃和小腸直接消化吸收,進入大腸后可被腸道菌利用轉(zhuǎn)化成短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFA)或維生素等代謝產(chǎn)物,激活機體免疫系統(tǒng)或是刺激機體白介素等合成,增加機體免疫力等多種途徑發(fā)揮益生作用;或是抑制腸道有害菌異常發(fā)酵,減少了腸道內(nèi)各種毒素產(chǎn)生;或是通過影響人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)等的合成與分泌,發(fā)揮降血糖、血脂的作用。
圖 3 稀有糖主要生物活性機制Fig.3 Main bioactivites mechanism of rare sugars
稀有糖類不能被人體直接吸收利用,當它們進入腸道后可作為養(yǎng)分直接為雙歧桿菌、乳酸菌或枯草芽孢桿菌等益生菌所利用提供能量或合成菌體成分,促進益生菌增殖同時被益生菌轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生多種乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等多種SCFA[14]。稀有糖轉(zhuǎn)化的有機酸一方面可降低腸道pH值促使腸道益生菌的大量增殖進而競爭性抑制有害菌的生長及其有害產(chǎn)物的產(chǎn)生,一方面還可以刺激腸道蠕動、潤濕糞便從而有效預(yù)防便秘[15]。此外,SCFA被腸道上皮細胞吸收入血,進而通過腸腦軸調(diào)節(jié)機體的免疫力等增強機體機能。稀有糖類也是維生素合成的重要前體物質(zhì),可以在體外由特定酶催化合成維生素,為實現(xiàn)維生素工業(yè)化量產(chǎn)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
稀有糖類除了通過對益生菌的益生作用抑制有害菌異常發(fā)酵,直接減少了腸道內(nèi)各種毒素產(chǎn)生外,其刺激增殖的雙歧桿菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等菌體的細胞壁成分和胞外分泌物,可刺激機體免疫系統(tǒng)抑制病原微生物活性[16]。稀有糖不被口腔微生物利用,可抑制口腔病原菌的生長,進而抑制牙齒齲變,有報道稱D-塔格糖可通過抑制變形鏈球菌在牙齒形成生物膜而發(fā)揮抗齲齒作用[17]。
稀有糖具有對細胞活性酸素的抑制作用,抑制收縮期、擴張期血壓的上升,對臟器貧血障礙的保護作用,抑制破骨細胞的分化,抑制癌細胞的增殖等作用[18]。稀有糖也可通過影響人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)等的合成與分泌,通過影響體內(nèi)相關(guān)信號途徑進而發(fā)揮降血糖、血脂的作用[4,19]。同時,有大量研究表明稀有糖對神經(jīng)性病變、腦梗塞、心肌梗塞、高血壓等疾病的具有抑制效果[20]。最新研究表明,稀有糖對肝臟細胞能量產(chǎn)生、肝脂肪積累和基因表達具有結(jié)構(gòu)特異性影響,具有保肝藥物應(yīng)用潛力[21]。
總之,稀有糖表現(xiàn)出抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、降血脂、防腹瀉、抗炎癥以及抗衰老等多種生物活性,可適合于腸胃功能失調(diào)、糖尿病、高血壓、肥胖癥、動脈硬化、齲齒患者以及免疫力低下的慢性病和老年病患者,更可作為日常飲食中添加成分用于人體營養(yǎng)與保健[22-24]。此外,稀有糖和合成化學(xué)藥品相比,無不良反應(yīng),因而必將在制造康養(yǎng)食品和醫(yī)藥品以及醫(yī)療制品方面具有非常大的應(yīng)用前景。
稀有糖作為極具市場開發(fā)潛力和大量使用的益生元,傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝已不能滿足市場和環(huán)境保護的需要,研究開發(fā)其高效、低耗、綠色的生產(chǎn)工藝尤為重要,目前稀有糖的主要制造方法大致可分為天然原料酸/堿水解及提取、化學(xué)合成、天然多糖生物轉(zhuǎn)化、糖基生物質(zhì)轉(zhuǎn)化、單糖酶學(xué)轉(zhuǎn)化等(圖4)[25-26],由于近年來從天然原料中提取稀有糖以及天然多糖的酸/堿水解以及化學(xué)合成的相關(guān)研究進展不大,本文主要就后3種方法展開介紹,包括基于糖基生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有糖;以單糖、寡糖為原料的稀有糖生物合成;己糖Izumoring策略的稀有糖生物合成。
圖 4 稀有糖的主要生物制備途徑Fig.4 Biological production methods of rare sugars
得益于現(xiàn)代微生物組學(xué)、酶工程和基因工程技術(shù)的巨大進步,使得在工廠里以糖基生物質(zhì)為原料通過生物合成方法生產(chǎn)稀有糖成為了可能[27-30]。糖基生物質(zhì)水解法作為比較傳統(tǒng)生產(chǎn)方法,生產(chǎn)工藝較為成熟、近年來鮮有重大突破[31]。例如乳果糖是由半乳糖與果糖組成的二糖,在自然界中并不存在,可通過化學(xué)法或生物酶法生產(chǎn)?;瘜W(xué)法主要有堿單一催化法、鋁酸鈉催化法和酸堿協(xié)同催化法,后者是目前工業(yè)上的主要生產(chǎn)乳果糖的方法[32]。L-阿拉伯糖廣泛存在于水果、粗糧皮殼中,早期主要是通過堿水解、酸中和獲得阿拉伯聚糖,也可通過化學(xué)合成法,利用鼠李糖等為原料,在過氧化氫和乙酸催化下制備L-阿拉伯糖,現(xiàn)已開發(fā)出生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-阿拉伯糖[33]。塔格糖(Tagatose)是以乳糖為原料,經(jīng)水解獲得半乳糖,然后在堿性條件下,以堿金屬或堿土金屬鹽為催化劑,催化D-半乳糖與金屬氫氧化物發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng),生成金屬氫氧化物+D-塔格糖復(fù)合物沉淀,然后酸中和分離沉淀而得[34]。盡管化學(xué)家通過兩種不同催化劑介導(dǎo)的受氫和供氫的連續(xù)步驟、通過位點選擇性差向異構(gòu)化反應(yīng)直接以D-葡萄糖為原料經(jīng)一系列催化合成中間體,最終成功制備出D-阿洛糖,實現(xiàn)了稀有糖化學(xué)合成的重大突破[35],是迄今為止產(chǎn)率和選擇性最好的方法,為合成高價值的稀有糖提供了一條簡潔且廣泛的方法,但由于其復(fù)雜的化學(xué)工藝、轉(zhuǎn)化成本高昂,目前尚不能應(yīng)用于實際生產(chǎn)。
纖維素、半纖維素為代表的陸生植物糖基生物質(zhì)以及褐藻多糖、紅藻多糖、綠藻多糖和藍藻多糖等為代表的海藻多糖是地球糖基生物質(zhì)的主要來源。其中占植物界碳含量的50%以上的纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖,是通過生物轉(zhuǎn)化獲得優(yōu)質(zhì)稀有糖的重要原料[36]。已有大量的研究通過將分解纖維素、半纖維素產(chǎn)生葡萄糖、纖維二糖、木糖的纖維素酶(Cellulase)、木聚糖酶(Xylanase)和下游能將后二者進行轉(zhuǎn)化的合成稀有糖的相關(guān)酶類通過代謝工程等方法構(gòu)建全細胞級聯(lián)反應(yīng)體系或體外轉(zhuǎn)化體系,成功實現(xiàn)以直接以纖維素、半纖維素為原料的稀有糖的生物轉(zhuǎn)化[37]。
以淀粉為原料的稀有糖生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)過這些年的探索,已經(jīng)取得了較大進展,可用于稀有糖的低成本綠色生物制造,如游淳課題組基于“熱力學(xué)驅(qū)動策略”構(gòu)建了一個以淀粉為原料的體外稀有糖的合成酶生物體系(圖5),通過多種酶的級聯(lián)反應(yīng),最終實現(xiàn)了合成多種稀有糖生物合成[38]。甘油是生物體內(nèi)通過糖異生途徑合成多種糖的重要原料,科學(xué)家們已經(jīng)實現(xiàn)了體內(nèi)外的甘油為原料的多種稀有酮糖的生物催化合成,李子杰等成功構(gòu)建了一鍋多酶系統(tǒng)(Onepot multienzyme system)策略(圖6)。該策略以甘油為唯一碳源,將多種來自不同微生物的甘油糖異生和稀有糖合成相關(guān)的酶在大腸桿菌基因工程菌體內(nèi)過表達,最終獲得14.8 g/L的D-山梨糖和D-阿洛酮糖產(chǎn)量,該策略也可用于其他稀有糖高效、低成本的合成,該團隊還利用該策略實現(xiàn)多種稀有糖的體內(nèi)酶促催化合成[39]。
將葡萄糖、果糖等單糖或寡糖轉(zhuǎn)化成稀有糖的方法除了已經(jīng)介紹的化學(xué)法外,利用自然界已發(fā)現(xiàn)的具有轉(zhuǎn)化合成稀有糖酶活性的菌株或酶類的發(fā)現(xiàn)、定向突變和酶工程一直是科學(xué)家們研究的熱點。科學(xué)家通過突變獲得了耐熱型β-半乳糖苷酶,該酶以乳糖和果糖為底物、可高效的將乳糖水解成半乳糖并后者轉(zhuǎn)移給果糖而合成乳果糖,其轉(zhuǎn)化效率較傳統(tǒng)補料法提高了10.6倍,極大提高了乳果糖產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率[40]。目前海藻糖生產(chǎn)主要利用酶轉(zhuǎn)化法,該法是以麥芽糖為原料,利用麥芽磷酸化酶、海藻糖磷酸酶共同催化麥芽糖或單獨使用海藻糖合成酶將麥芽糖產(chǎn)生海藻糖[41-42]。生產(chǎn)上利用枯草芽孢桿菌、金黃色節(jié)桿菌或酵母菌的培養(yǎng)物酶解阿拉伯聚糖是獲得L-阿拉伯糖重要途徑[43]。塔格糖則是采取化學(xué)法和生物法結(jié)合的生產(chǎn)方式,先通過水解乳糖獲得半乳糖,再通過脫氫酶催化氧化半乳糖醇得到D-塔格糖,或者通過L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖異構(gòu)化生成D-塔格糖[44-45]。利用微生物來源的酮糖3-差向異構(gòu)酶催化D-果糖與D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化,是目前D-阿洛酮糖生產(chǎn)的主要途徑[46]。利用沙雷氏桿菌、大腸桿菌等微生物的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化蔗糖或是利用酶法轉(zhuǎn)化葡萄糖和果糖是目前生產(chǎn)異麥芽酮糖重要方法[47-49]。
圖7總結(jié)了以葡萄糖為原料,通過不同來源的已糖異構(gòu)酶等生物酶類組合催化,實現(xiàn)多種稀有糖的生物合成技術(shù)路線。目前基于基因工程的組合酶催化生物合成已經(jīng)在 L-己糖、D-塔格糖、D-阿洛糖等多種稀有糖生物合成中取得成功[50-51]。生產(chǎn)中可以此為借鑒,根據(jù)目標產(chǎn)物的生物合成進展,采取固定化菌株或固定化酶的技術(shù),將來自不同微生物的催化稀有糖合成的高活性酶類基因進行克隆并將相應(yīng)的催化單元按照一定的順序進行模塊化組合,就可完成特定的稀有糖的高效生物轉(zhuǎn)化[52]。
圖 5 淀粉為原料的體外多種酶組合合成稀有酮糖體系Fig.5 In vitro strategy for the synthesis of rare ketose from starch
受益于稀有糖酶工程模塊化技術(shù)進步,Ken Izumori提出了一套完整的適用于所有稀有糖的生物制備Izumoring策略,該策略利用基于各種稀有糖化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性和酶促催化的相關(guān)性,利用AIase(Aldose isomerase,醛糖異構(gòu)酶)催化醛糖-酮糖異構(gòu)化,KEase(Ketose 3-epimerase,酮糖3-差向異構(gòu)酶)催化酮糖C-3異構(gòu)化,Arase(Aldose reductase,醛糖還原酶)和PDH(Polyol dehydrogenase,多元醇脫氫酶)分別催化醛糖和酮糖還原為相應(yīng)的多元醇的四個基本酶促反應(yīng)實現(xiàn)各種稀有糖的轉(zhuǎn)化[53]。以己糖Izumoring策略為例(圖8),只經(jīng)過6步反應(yīng),即可將L-葡萄糖依次經(jīng)L-葡萄糖醇、D-山梨糖、D-塔格糖、D塔洛糖醇/D-阿卓糖醇、D-阿洛酮糖、D-果糖等中間體,最終得到D-葡萄糖[54]。Izumoring策略為工廠化生產(chǎn)稀有糖提供了一條簡便、高效且靈活的生產(chǎn)策略,人們可以將各種來源的AIase、KEase、Arase、和PDH固定化,根據(jù)生產(chǎn)目的進行有機的組合,可以實現(xiàn)從L-葡萄糖等糖基生物質(zhì)原料到己糖稀有糖目標高效生產(chǎn)。
圖 6 甘油全細胞合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖的策略Fig.6 Strategy for the whole-cell synthesis of D-sorbose and D-allulose from glycerol
圖 7 基于單糖異構(gòu)化的稀有糖生物轉(zhuǎn)化策略Fig.7 Strategy for the rare sugars biotransformated by isomerase
圖 8 稀有糖的己糖Izumoring策略Fig.8 Strategy of hexose Izumoring for rare sugars
本文對近年來稀有糖類的結(jié)構(gòu)、活性及制備方法等研究進展進行較為系統(tǒng)的回顧,盡管目前稀有糖的工廠化生產(chǎn)還是主要從糖基生物質(zhì)植物中通過理化工藝提取,但以位點選擇性差向異構(gòu)化反應(yīng)為代表的從葡萄糖為原料生產(chǎn)稀有糖的化學(xué)法的巨大突破為工廠化大規(guī)模化學(xué)合成稀有糖提供了新的技術(shù),今后如能再進一步提高轉(zhuǎn)化效率、簡化生產(chǎn)工藝,必將成為稀有糖的生產(chǎn)一種重要工藝。綠色生物合成是今后稀有糖生產(chǎn)的發(fā)展方向,今后的生產(chǎn)中可以嘗試基于代謝工程的原理、通過基因編輯技術(shù)將不同來源高活性纖維素酶、淀粉酶和下游的己糖激酶、磷酸己糖異構(gòu)酶、醛縮酶、醛(酮)糖醇氧化酶、己糖異構(gòu)酶、多元醇脫氫酶等進行有機組合,構(gòu)建出可以分別以纖維素、淀粉等多糖類糖基生物質(zhì)為原料的高效稀有糖生產(chǎn)工藝。以葡萄糖等己糖為原料生產(chǎn)稀有糖的Izumoring策略可根據(jù)生產(chǎn)目的進行有機的組合,可以實現(xiàn)從L-葡萄糖等己糖原料到多種己糖稀有糖或糖醇自由切換,極大方便了生產(chǎn)者根據(jù)市場行情隨時調(diào)整相應(yīng)的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品類型,具有很高的生產(chǎn)應(yīng)用價值?;诟视偷忍钱惿虚g分子的稀有糖生物合成技術(shù)則可以將稀有糖生產(chǎn)的原料突破了糖基生物質(zhì)的范圍,衍生到可代謝產(chǎn)生這類小分子中間產(chǎn)物的脂肪、蛋白類原料,為稀有糖生產(chǎn)提供更大原料和代謝途徑改造選擇空間。今后應(yīng)重點考慮將目前這些研究進展如何優(yōu)化成適應(yīng)工廠生產(chǎn)模式,可重點考慮解決上述相關(guān)酶的催化效率、催化活性穩(wěn)定性、多酶體系組合優(yōu)化、超級菌株構(gòu)建及其穩(wěn)定性、稀有糖分離純化工藝優(yōu)化(去蔗糖、葡萄糖殘留)方面存在的問題,以提高稀有活性糖的轉(zhuǎn)化效率、簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本,滿足人們?nèi)找嬖鲩L的對稀有糖的需求。