李鵬昊，鄭楷煉，許熊飛，金 鋼

海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院肝膽胰脾外科，上海 200433

胰腺癌是預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然近年來胰腺癌的診斷方法、治療手段與管理理念的不斷進(jìn)步使得患者預(yù)后獲得較大改善，但其5年總體生存率仍不足10%，依然為“癌中之王”［1］。到目前為止根治性切除仍是胰腺癌最有效的治療手段，但是超過50%的胰腺癌患者確診時已出現(xiàn)明顯的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］，喪失手術(shù)根治機(jī)會。胰腺癌預(yù)后差的主要原因在于胰腺癌細(xì)胞具有極易局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，癌癥相關(guān)基因的可變剪接在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。Numb是一個進(jìn)化上保守的基因，具有控制細(xì)胞不對稱分裂和決定細(xì)胞命運(yùn)，調(diào)控細(xì)胞黏附與遷移、特定底物泛素化及多種信號通路等功能［3］，其復(fù)雜的生物學(xué)特性在胰腺癌中的作用日漸受到關(guān)注。Numb基因可發(fā)揮抑癌或促癌作用，產(chǎn)生這種功能差異的原因可能與可變剪接有關(guān)，然而Numb基因可變剪接的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不完全清楚，所產(chǎn)生的剪接異構(gòu)體在胰腺癌中的功能有待于進(jìn)一步揭示。本文將對Numb基因及其剪接異構(gòu)體的功能特點(diǎn)，及其對胰腺癌的影響進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 Numb基因及其可變剪接的研究

Numb是近20年來逐漸被認(rèn)識的一類胞漿蛋白，而后發(fā)現(xiàn)，Numb與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在不同的腫瘤組織中，Numb表現(xiàn)出的抑癌/促癌作用也不同。在一些腫瘤中Numb高表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞生長。例如，在肺鱗癌中，高水平Numb可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲［4］；在肝癌中，腫瘤組織Numb水平顯著高于周圍正常組織且與不良預(yù)后相關(guān)［5］。而在乳腺癌中，Numb處于缺失狀態(tài)，Numb表達(dá)越低乳腺癌的惡性程度越高，其預(yù)后越差［6］。Numb也參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，胰腺癌組織標(biāo)本中Numb的表達(dá)水平與腫瘤大小和腫瘤TNM分級、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，是患者預(yù)后情況的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)［7－8］，提示Numb可能發(fā)揮抑癌功能。上述情況或可歸咎于各類異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)差異［9］。

在哺乳動物體內(nèi)，Numb的可變剪接根據(jù)其mRNA在磷酸酪氨酸結(jié)合（phosphotyrosine－binding，PTB）結(jié)構(gòu)域是否有11個氨基酸的外顯子（Ex6）插入及在脯氨酸富集區(qū)域（proline rich region，PRR）是否有48個氨基酸的外顯子（Ex12）插入，產(chǎn)生4種不同的剪接異構(gòu)體：Numb1（p72）、Numb2（p66）、Numb3（p71）和Numb4（p65）［10］。在所有異構(gòu)體中，氨基端均包含PTB結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合膜蛋白，參與細(xì)胞膜定位，調(diào)控胞吞等功能［11］；PRR結(jié)構(gòu)域位于蛋白中間區(qū)域，參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并與細(xì)胞增殖與分化密切相關(guān)。根據(jù)PRR結(jié)構(gòu)域中是否含有Ex12插入，Numb蛋白可分為PRRL（p72/p71）及PRRS（p66/p65）兩類。在正常的胰腺組織中PRRS的表達(dá)量遠(yuǎn)高于PRRL，其Notch通路活性被抑制；而在胰腺癌組織中PRRL表達(dá)上調(diào)，PRRL/PRRS的比率明顯增高導(dǎo)致Notch1和Notch4的異常激活［7］；在肝癌中，Numb上調(diào)同樣以PRRL為主，高表達(dá)的PRRL表現(xiàn)出明顯的促增殖作用［5］。上述研究表明Numb的功能差異可能與剪接異構(gòu)體類型相關(guān)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2 胰腺癌中Numb剪接異構(gòu)體對不同信號通路的影響

與其他實(shí)體腫瘤相比，胰腺癌微環(huán)境中含有大量的基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)［12］，腫瘤細(xì)胞的分子生物學(xué)特征也更為復(fù)雜。Numb作為重要的抑癌/促癌分子在其他實(shí)體瘤中研究較為廣泛。然而，受限于胰腺癌復(fù)雜的分子機(jī)制和高度異質(zhì)性，目前Numb在胰腺癌中的研究相對較少，其剪接異構(gòu)體的不同功能與胰腺癌相關(guān)信號通路的關(guān)系更是鮮為人知。故Numb亞型和信號通路二者之間的關(guān)系值得進(jìn)一步探討和研究，為確認(rèn)胰腺癌治療的潛在靶分子提供理論基礎(chǔ)。

2.1 胰腺癌中Numb剪接異構(gòu)體對Notch信號通路的影響 人類Notch途徑是一種進(jìn)化上保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞增殖與凋亡、多能祖細(xì)胞分化等重要功能，從而調(diào)節(jié)組織、器官的分化和發(fā)育［13］。近年來，Numb蛋白對Notch信號通路的調(diào)控在胰腺癌中的生物學(xué)效應(yīng)愈發(fā)受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，Numb蛋白能夠多層面抑制Notch通路：Numb可以與AP－2結(jié)合抑制Notch膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)吞［14－15］；Numb蛋白可以抑制Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD）共轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核［16］；Numb蛋白可以直接與NICD結(jié)合引起NICD泛素化［17］。剪接異構(gòu)體的變化也會影響其在Notch通路中的作用，PRRL表達(dá)增加激活Notch途徑，而PRRS抑制Notch活化及其下游基因的表達(dá)，表明Ex12的插入或缺失對Numb功能有重要影響［18］。

與其他實(shí)體腫瘤類似，Notch途徑在胰腺癌中高度失調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞放射抵抗與化學(xué)耐藥、腫瘤干細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）等惡性生物學(xué)行為［19－20］。胰腺癌干細(xì)胞（pancreatic carcinoma stem cell，PaCSC）作為腫瘤微環(huán)境中的重要細(xì)胞亞群，其對稱分裂特性是導(dǎo)致腫瘤快速增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與耐藥的關(guān)鍵元兇［21－22］。研究［23］證實(shí)Notch1異常高表達(dá)在對稱分裂的PaCSC中普遍存在，使用槲皮素誘導(dǎo)提高胞內(nèi)miR－200b－3p水平，降低Notch1/Numb比率可有效抑制PaCSC自我更新與增殖，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化，有效改善腫瘤組織的惡性生物學(xué)行為。EMT是指細(xì)胞失去部分上皮特性并獲得間充質(zhì)特性的生物學(xué)過程［24］。在腫瘤組織中，腫瘤組織微環(huán)境變化（例如低氧）以及間質(zhì)細(xì)胞釋放的各種細(xì)胞外信號和生長因子（例如TGFβ、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子等）作用于腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而降低上皮相關(guān)標(biāo)志（如E－Cadherin、上皮細(xì)胞黏附分子和cytokeratin等）蛋白表達(dá)而增加間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志（如NCadherin、vimentin和fibronectin等）蛋白表達(dá)，啟動EMT［25］。大約80%的胰腺癌患者在初次診斷或術(shù)后復(fù)查時確診為轉(zhuǎn)移癌，EMT被證實(shí)為啟動和促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵動力［26］。開發(fā)靶向EMT的治療手段或是緩解胰腺癌患者體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移與化學(xué)耐藥，改善預(yù)后的可行方案［27］。胰腺癌細(xì)胞中Numb表達(dá)與E－Cadherin呈正相關(guān)，與vimentin呈負(fù)相關(guān)，Numb和ECadherin共表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更好，表明Numb可能參與胰腺癌EMT進(jìn)程［28］。PRRL參與TGFβ1與表皮生長因子誘導(dǎo)的EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體外EMT樣形態(tài)變化、遷移和侵襲，提高皮下成瘤和肝轉(zhuǎn)移能力。不僅如此，在TGFβ1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中還觀察到Notch1的NICD水平升高，使用Notch1抑制劑能夠顯著逆轉(zhuǎn)TGFβ1誘導(dǎo)的EMT，提示PRRL與Notch協(xié)同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞EMT［29］。綜上，Numb剪接異構(gòu)體是胰腺癌中Notch信號通路的重要調(diào)控因素。

2.2 胰腺癌中Numb剪接異構(gòu)體對p53的影響 p53是一種應(yīng)激傳感器，在細(xì)胞面對各種刺激如DNA損傷、癌基因激活、氧化應(yīng)激和營養(yǎng)不良時被激活，被認(rèn)為是最重要的腫瘤抑制因子［30］。野生型p53可通過阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡等多種方式抑制腫瘤產(chǎn)生，而突變型p53卻能避免腫瘤死亡，具有強(qiáng)烈的致癌蛋白特性［31－32］。Numb通過與p53和Mdm2形成三聚體復(fù)合物，并與這兩種蛋白直接相互作用，抑制Mdm2介導(dǎo)的p53泛素化，從而穩(wěn)定p53水平，發(fā)揮抑癌作用［33］。敲除Numb導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p53水平與活性降低，繼發(fā)正常成熟上皮組織分化障礙、EMT、細(xì)胞干性重新獲得等形態(tài)學(xué)改變，為腫瘤發(fā)生提供重要條件［33］。Numb參與的p53調(diào)節(jié)過程與剪接異構(gòu)體關(guān)系密切，其泛素化抑制作用主要由PTB介導(dǎo)［34］。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中可觀察到Numb－Mdm2或PTB－Mdm2二元復(fù)合物，表明Numb或PTB片段能夠獨(dú)立于p53與Mdm2相互作用。而Ex6的編碼片段對于這一結(jié)合過程至關(guān)重要，沉默全部Numb亞型或p72/p66可降低p53水平，沉默p71/p65則沒有顯著影響［35］。胰腺癌中p53與Numb的關(guān)系也被相繼證實(shí)。相比于p53突變體，胰腺癌細(xì)胞中野生型p53受Numb影響更大，過表達(dá)Numb顯著提高野生型而不是突變型p53水平，siRNA敲低Numb使野生型p53泛素化增強(qiáng)，細(xì)胞侵襲能力得到顯著提升［8］。綜上，Numb影響胰腺癌細(xì)胞中p53蛋白調(diào)節(jié)過程，不同亞型與胰腺癌p53蛋白的關(guān)系值得深究。

3 Numb及剪接異構(gòu)體對胰腺癌治療的潛在影響

盡管胰腺癌新輔助治療與免疫療法的聯(lián)合使用使患者生存率進(jìn)一步提高［36－37］，其特殊腫瘤微環(huán)境引起的耐藥仍是臨床治療的最大阻礙［38］。吉西他濱作為胰腺癌患者化療一線用藥之一，其耐藥性是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要原因［39］。相比Numb表達(dá)正常的胰腺癌細(xì)胞，Numb低表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性顯著增強(qiáng)，這可能與野生型p53及凋亡相關(guān)蛋白caspase－3含量降低有關(guān)［40］，然而具體的分子機(jī)制尚不清楚。作為腫瘤治療的重要療法，放射治療在胰腺癌患者中的客觀反應(yīng)率普遍低下［41］。高血糖記憶是糖尿病患者在嚴(yán)格血糖控制條件下由并發(fā)癥引起的功能失調(diào)［42］，被證明是胰腺癌患者放射抵抗的因素之一［43］。Numb在慢性高糖條件下的顯著下調(diào)與Notch途徑的異常激活在放射抵抗形成過程中起到關(guān)鍵作用，過表達(dá)Numb或使用二甲雙胍則能顯著逆轉(zhuǎn)這一過程，通過抑制Notch途徑提高高血糖記憶下胰腺癌的放射敏感性［43］。綜上，Numb基因參與胰腺癌細(xì)胞放射抵抗與化學(xué)耐藥的復(fù)雜過程，深入研究Numb及剪接異構(gòu)體在胰腺癌中的具體功能，有利于解釋胰腺癌耐藥機(jī)理和提高治療效果。

4 總結(jié)

綜上所述，Numb是一個重要的細(xì)胞命運(yùn)決定因子，產(chǎn)生的多種剪接異構(gòu)體通過Notch、p53等信號通路在胰腺癌細(xì)胞增殖與分化、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移和耐藥性等方面發(fā)揮不同功能，促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展。上文提到的干預(yù)環(huán)節(jié)和潛在治療靶點(diǎn)絕大多數(shù)處于前瞻性實(shí)驗(yàn)階段，距離開展臨床實(shí)驗(yàn)還有很長一段路要走。在晚期胰腺癌治療十分困難的前提下，迫切需要基于現(xiàn)有理論開發(fā)新的治療方法以改善胰腺癌治療現(xiàn)狀。因此深入了解Numb基因及剪接異構(gòu)體功能并闡明其在胰腺癌中的作用具有重要意義，為改善胰腺癌的治療及患者預(yù)后提供新的理論和思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李鵬昊負(fù)責(zé)擬定寫作思路，檢索文獻(xiàn)和論文撰寫；許熊飛、金鋼、鄭楷煉負(fù)責(zé)課題設(shè)計；鄭楷煉負(fù)責(zé)指導(dǎo)、修改論文并最終定稿。