熊冰婕，曹飄 綜述 劉安祥，張駿 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000

腦卒中是我國成人致死、致殘的首位病因，是嚴(yán)重危害中國國民健康的重大慢性非傳染性疾病，其中，缺血性腦卒中占所有腦卒中的85%左右[1-2]。急性缺血性腦卒中最有效的治療方法就是在有效的時間窗內(nèi)及時開通血管，恢復(fù)缺血腦組織的血供、挽救缺血半暗帶[3]。在實際臨床工作中，開通血管受交通、時間窗及適用范圍的影響，能進(jìn)行溶栓治療的患者數(shù)量有限，然而對于那些錯過時間窗的缺血性腦卒中患者來說，仍需要規(guī)范化治療才能提高患者生存質(zhì)量[4]。此外，接受此治療的患者還會面臨腦缺血再灌注損傷的威脅，如誘發(fā)腦水腫，顱內(nèi)壓增高、腦疝等致命并發(fā)癥[5]。因此，深入研究缺血性腦卒中溶栓后缺血再灌注損傷的相關(guān)發(fā)生發(fā)展病理機(jī)制對于缺血性腦卒中的治療極其重要。研究表明，線粒體自噬異常所致嚴(yán)重的線粒體功能障礙可導(dǎo)致血腦屏障破壞和神經(jīng)元損傷，是腦缺血再灌注損傷最基本的機(jī)制[6-7]。線粒體是存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的雙膜細(xì)胞器，參與了細(xì)胞的能量供應(yīng)和凋亡的過程，被稱為細(xì)胞的“能量工廠”[8]。在機(jī)體中線粒體分裂和融合是動態(tài)平衡的[9]，線粒體自噬對于線粒體穩(wěn)態(tài)和受損線粒體的清除極為重要[10]：線粒體受損時，線粒體裂變過程“切斷”線粒體受損部分，形成兩個線粒體，一個受損的線粒體和一個健康的線粒體，健康線粒體與其他健康線粒體融合，受損線粒體不能與其他線粒體融合且被自噬系統(tǒng)選擇性降解，這被稱為線粒體自噬[11-12]。在后生動物如黑腹果蠅、哺乳動物中，靶向受損線粒體以實現(xiàn)自噬涉及兩個蛋白：PARK2以及編碼線粒體定位激酶的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)，其蛋白產(chǎn)物Parkin是細(xì)胞質(zhì)E3泛素連接酶[13]。作為線粒體自噬中最主要的途徑，PTEN 誘導(dǎo)的PINK1/Parkin介導(dǎo)線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用[14-15]。關(guān)于PINK1/Parkin 介導(dǎo)相關(guān)蛋白參與缺血再灌注的研究方興未艾，現(xiàn)就線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1/Parkin 與腦缺血再灌注損傷的相關(guān)性予以綜述。

1 PINK1、Parkin及其介導(dǎo)的線粒體自噬

PINK1 是一個含有581 個氨基酸的蛋白，具有線粒體靶向信號，這個信號是一個跨膜螺旋和結(jié)構(gòu)域在N端的絲氨酸/蘇氨酸激酶；Parkin 是一種與家族性帕金森病有關(guān)的細(xì)胞質(zhì)E3 連接酶，在PINK1 的下游作用，Pallank 小組發(fā)現(xiàn)Parkin在線粒體形態(tài)學(xué)和功能的維護(hù)中起著重要作用[11]。在健康線粒體中，PINK1 被線粒體內(nèi)膜菱形蛋白酶老年素相關(guān)的菱形樣蛋白(presenilin-associated rhomboid-like，PARL)切割并被蛋白酶體降解[16]。在各種不利條件下，如缺氧和營養(yǎng)耗盡，線粒體會受損。功能失調(diào)的線粒體產(chǎn)生多余的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，促進(jìn)線粒體去極化[17]。線粒體損傷時，PINK1 穩(wěn)定并積累在線粒體外膜上，募集、磷酸化Parkin 以誘導(dǎo)泛素化線粒體蛋白[18]。WEN 等[19]發(fā)現(xiàn)，PINK1過表達(dá)組小鼠招募磷酸化Parkin，增加線粒體自噬，降解受損線粒體，使ATP 生成增加以及ROS生成減少，從而改善線粒體功能。另有LAN 等[20]證實再灌注后24 h 線粒體達(dá)到最大自噬。因此，PINK1/Parkin 介導(dǎo)線粒體自噬對細(xì)胞的能量供應(yīng)、凋亡有重要意義。

2 參與腦缺血再灌注損傷中線粒體自噬的相關(guān)蛋白

2.1 optiineurin (OPTN) 靶向自噬體是自噬的關(guān)鍵一步，選擇性自噬涉及貨物接頭蛋白的作用，如OPTN，此蛋白通過微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtube-associated protein 1 light chain 3，LC3)相互作用區(qū)域與ATG8蛋白結(jié)合參與選擇性自噬。在PINK1/Parkin介導(dǎo)的自噬過程中，除了從細(xì)胞質(zhì)池募集ATG8家族蛋白脂化膜外，OPTN-ATG9A啟動了自噬膜上泛素化產(chǎn)物的從頭生物生成[21]。OPTN，而不是其他自噬受體，能特異性地將含ATG9A的囊泡招募到病灶，這表明OPTN與含ATG9A的囊泡形成復(fù)合物。ATG9A是核心自噬蛋白中唯一的多跨膜蛋白，存在于胞漿囊泡中，也存在于反式高爾基網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)體膜上[22]。但PADMAN等[23]認(rèn)為PINK1/Parkin自噬過程中的貨物選擇性是通過線粒體表面的從頭自噬體生物發(fā)生實現(xiàn)的，而不是通過自噬膜上ATG8的橋接。OPTN蛋白與TBK1 的激活相關(guān)：線粒體去極化激活 TBK1 可促進(jìn) SQSTM1、OPTN 和NDP52 的磷酸化，且TBK1 活性是OPTN 有效募集到去極化線粒體的關(guān)鍵[24]。RICHTER 等[25]發(fā)現(xiàn)存在兩種不同的TBK1 激活途徑：Parkin 依賴和Parkin 獨(dú)立，由于OPTN對線粒體的穩(wěn)定招募也依賴于Parkin的存在，所以在Parkin 過表達(dá)時TBK1 的激活增加可能與其與OPTN 的相互作用有關(guān)。TBK1 激活線粒體去極化后，這種效應(yīng)需要上游激酶PINK1 的參與，并通過Parkin的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)。此外，TBK1的激活和線粒體定位取決于其與OPTN的相互作用以及OPTN在線粒體上與Ub結(jié)合的能力。反過來，OPTN在線粒體自噬過程中的功能依賴于其被激活的TBK1 磷酸化，這可以通過非磷酸化OPTN突變體表達(dá)后線粒體定位和自噬的減少來證明。S473 和S513 的雙磷酸化在體外可激活多聚泛素ubiquitin(Ub鏈)結(jié)合，在體內(nèi)可促進(jìn)TBK1 激活、受損線粒體OPTN 保留和線粒體自噬。因此，線粒體上Ub鏈的合成啟動了TBK1激活，TBK1介導(dǎo)的OPTN 磷酸化通過結(jié)合OPTN/TBK1 在泛素化線粒體上的招募和保留，形成一個信號放大環(huán)路，以促進(jìn)自噬體捕獲線粒體。PINK1/Parkin通過TBK1 促進(jìn) OPTN、NDP52 和 SQSTM1 磷酸化。MOORE 等[26]證明耗盡OPTN，而不是NDP52，可以阻止有效的線粒體自噬，因此OPTN是啟動線粒體線粒體自噬的必需受體。

2.2 NDP52 VARGAS 等[27]證 明 NDP52/TBK1以LC3獨(dú)立的方式將ULK1復(fù)合物招募到泛素化的貨物中，導(dǎo)致ULK1 激酶激活。有報道證明，ULK1的活性對于PINK1/parkin介導(dǎo)的自噬是必需的。增加貨物上ULK1 的局部濃度足以驅(qū)動自噬誘導(dǎo)，克服富營養(yǎng)條件下對自噬的抑制。NDP52和TBK1在貨物上的定位耦合了ULK1的激活和空間調(diào)控以啟動PINK1/parkin介導(dǎo)的自噬。

2.3 p62/Sequestosome1 (SQSTM1) SQSTM1基因編碼包含多個結(jié)構(gòu)域的多功能蛋白p62，該結(jié)構(gòu)域以錯誤折疊、聚集和/或泛素化蛋白為靶點，通過自噬降解[28]。p62包含多種可識別多泛型蛋白并降解多泛型蛋白的相互作用域，調(diào)控氧化應(yīng)激和自噬的發(fā)生發(fā)展，在信號傳導(dǎo)過程中起著重要作用[29]。線粒體通過自噬受體p62/SQSTM1 和LC3的相互作用，驅(qū)動泛素化線粒體被自噬小體自噬降解[28]。IVANKOVIC 等[17]發(fā)現(xiàn)，p62 蛋白在線粒體自噬誘導(dǎo)后表達(dá)上升，而在PINK1 敲除的細(xì)胞中上升的p62 表達(dá)被阻止，結(jié)果表明p62表達(dá)的增加是對PINK1/Parkin介導(dǎo)線粒體自噬的響應(yīng)；另一種觀點認(rèn)為，p62是受損線粒體聚集所必需的，而不是自噬本身[21]。因此，通過拮抗p62 的上調(diào)，可以抑制線粒體自噬的過度激活或受損線粒體的聚集，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

2.4 動力蛋白相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1) Drp1 的募集是線粒體裂變的一個標(biāo)志[30]。研究發(fā)現(xiàn)線粒體裂變不會促進(jìn)線粒體自噬，而是通過抑制PINK1/Parkin 活性，降低線粒體氧化應(yīng)激、維持正常的線粒體膜電位(MMP)以保護(hù)健康的線粒體結(jié)構(gòu)域免受消除[31-32]。TANG 等[33]發(fā)現(xiàn) Parkin 誘導(dǎo)再灌注損傷后Drp1的降解，保護(hù)再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙，再灌注的損傷不僅誘導(dǎo)線粒體碎片化，而且通過非轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控Drp1 的表達(dá)。GU 等[34]發(fā)現(xiàn)缺乏PINK1或Parkin 的神經(jīng)元積累Drp1，導(dǎo)致過量的線粒體裂變增加氧化應(yīng)激，減少了ATP 的產(chǎn)生。FLIPPO等[35]對缺乏內(nèi)源性Drp1抑制劑的小鼠的研究結(jié)果表明，Drp1依賴的線粒體裂變確實有助于缺血性腦卒中損傷，而靶向Drp1 調(diào)控因子或直接磷酸化Drp1 可能具有減少缺血性損傷的治療潛力。因此，Drp1 表達(dá)的改變在腦缺血再灌注損傷中直接影響細(xì)胞代謝并最終影響細(xì)胞存活。

3 線粒體自噬相關(guān)蛋白在腦缺血再灌注損傷中可能治療靶點及藥物

3.1 氫(H2) H2是一種無色、無臭、快速擴(kuò)散的醫(yī)用氣體，由于氫分子在哺乳動物細(xì)胞中通常被表示為惰性氣體，因此以前人們認(rèn)為氫分子在人體細(xì)胞中沒有功能[36]。近年來氫被發(fā)現(xiàn)是治療腦血管疾病的有效新穎介質(zhì)，2007 年 YANG 等[37]發(fā)現(xiàn)，H2具有選擇性的抗氧化特性，通過特異性中和羥自由基(hnyoh)和過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，保護(hù)大腦免受缺血再灌注損傷和腦卒中的影響。而后，WU等[38]用新生SD大鼠建立氧葡萄糖剝奪/再灌注(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)實驗?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)OGD/R 損傷可誘導(dǎo)線粒體自噬相關(guān)的mRNA 和蛋白PINK1 和Parkin 的表達(dá)，H2和RAP(自噬激活劑)處理可進(jìn)一步提高其表達(dá)水平，而3-MA(自噬抑制劑)抑制其表達(dá)水平，結(jié)果表明H2通過線粒體自噬和PINK1/Parkin修復(fù)了OGD/R 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷。此外，理論上據(jù)藥物的劑量-效應(yīng)關(guān)系，高濃度H2的效果應(yīng)該比低濃度H2好，吸入高濃度H2應(yīng)該是治療腦血管疾病的更佳選擇，夏裕寧等[39]證明高濃度H2確實對腦缺血再灌注損傷大鼠產(chǎn)生明確的保護(hù)作用。綜上，H2可保護(hù)線粒體功能，對腦缺血再灌注損傷有良好的治療作用。

3.2 燈盞花素 據(jù)報道，燈盞花素注射液能減少實驗性大鼠缺血邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量、減緩缺血神經(jīng)元損害，從而達(dá)到腦保護(hù)作用[40]。燈盞花素提取自菊科植物燈盞花，主要有效成分為燈盞乙素，化學(xué)結(jié)構(gòu)為4,5,6-三羥基黃酮-7 葡萄糖醛酸苷[41-42]。WU等[43]發(fā)現(xiàn)，燈盞花素誘導(dǎo)PINK1/Parkin 介導(dǎo)線粒體自噬：燈盞花素可以穩(wěn)定OMM(線粒體外膜)上的PINK1，然后招募和激活Parkin，調(diào)節(jié)Parkin的E3連接酶活性從而促進(jìn)線粒體自噬，這有助于防止腦缺血再灌注損傷。研究結(jié)果為燈盞花素在未來抗腦缺血再灌注損傷藥物開發(fā)中的潛在應(yīng)用提供了有價值的信息。

3.3 電針(electroacupuncture，EA) 電針是一種結(jié)合傳統(tǒng)針灸和電刺激的技術(shù)。電針在中國已被廣泛用于治療中風(fēng)，其療效已得到認(rèn)可，可有效保護(hù)腦組織，然而，具體機(jī)制尚不清楚[44]。WANG等[45]以大鼠建立實驗?zāi)Ｐ停攸c研究了EA治療對線粒體的影響，發(fā)現(xiàn)EA 能增強(qiáng)PINK1/Parkin 介導(dǎo)線粒體自噬清除，減少受損線粒體的積累，改善硝基/氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦缺血再灌注所致的線粒體功能損傷。研究結(jié)果為EA對缺血性卒中治療的分子機(jī)制提供了更好的理解。

4 小結(jié)

綜上，線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1/Parkin 參與了腦缺血再灌注損傷，在治療方面具有重要價值，該信號通路的結(jié)構(gòu)和功能及其與效應(yīng)因子的關(guān)系較為復(fù)雜，因此需要進(jìn)一步開展相關(guān)方面的研究。線粒體自噬是一個動態(tài)過程，調(diào)控其激活程度具有難度，且在單一靜態(tài)時間點評估PINK1/Parkin 的表達(dá)可能會產(chǎn)生一定誤差[46-47]。因此將來對PINK1/Parkin 介導(dǎo)線粒體自噬參與缺血性卒中的機(jī)制進(jìn)一步深入的探討，將有助于闡述急性缺血性腦卒中后腦缺血再灌注的發(fā)病機(jī)制，且為把控缺血再灌注損傷中線粒體自噬的激活程度提供指導(dǎo)，從而減少其帶來的傷害，達(dá)到治療目的，并為人類疾病治療提供新的分子靶標(biāo)和方向。