張華蕊 夏智杰 宋江華 張立新*

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，安徽合肥 230036；2 安徽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，安徽合肥 230036）

甘藍（Brassica oleraceavar.capitataL.）是我國重要的蔬菜作物，營養(yǎng)豐富，適應性及抗逆性均較強，在全國各地普遍種植（楊麗梅 等，2021；楊麗梅和方智遠，2022）。菌核病是由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorium）引起的真菌性病害，在甘藍全生育期均可發(fā)生，發(fā)病初期產(chǎn)生水漬狀、淡褐色病斑，濕度較大時病部出現(xiàn)白色絮狀菌絲，可見黑色鼠糞狀菌核；一般導致甘藍減產(chǎn)5%～20%，受害嚴重的地塊減產(chǎn)可達50%以上，經(jīng)濟損失嚴重（杜磊和楊瀟湘，2016）。菌核病菌的寄主范圍非常廣泛，除了危害十字花科蔬菜以外，還可侵害茄科、豆科、葫蘆科等作物。據(jù)統(tǒng)計，核盤菌現(xiàn)已危害的植物有75 科408 種（劉佳 等，2016）。有研究表明，核盤菌種群內(nèi)存在致病性分化（孫葉爍等，2019）。國內(nèi)外對核盤菌致病力研究的報道多集中于油菜、向日葵和花椰菜等寄主植物（李沛利和葉華智，2006；孫溶溶 等，2011；許大鳳 等，2014），在甘藍上的研究鮮見報道。

近年來，安徽省甘藍產(chǎn)區(qū)菌核病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，危害越來越嚴重。目前，化學防治仍是防治菌核病的主要措施，常用的殺菌劑為苯并咪唑氨基甲酸酯類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑和琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑。然而，部分地區(qū)已發(fā)現(xiàn)核盤菌對常用殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性（齊永霞 等，2006；匡靜 等，2011；喬廣行 等，2014；楊利娟 等，2020）。本試驗對安徽淮南甘藍主產(chǎn)區(qū)的菌核病菌進行了分離和致病力測定，并對3 種常用殺菌劑進行了敏感性評估，以期為甘藍菌核病的綜合治理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試甘藍品種 京豐1 號、鋼頭50、精選爭春、日本夏冠，購自河北省邢臺市大力種苗有限公司；超級春豐，購自邢臺甘之都種業(yè)有限公司；方震紫甘藍，購自鄭州方震種子有限公司；中甘11號，購自河北省邢臺市興達種業(yè)有限公司；綠玉，購自浙江神良種業(yè)有限公司；博春，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。

1.1.2 供試藥劑 40%菌核凈可濕性粉劑，購自江西禾益化工股份有限公司；97%多菌靈原藥，購自先正達作物保護有限公司；50%啶酰菌胺水分散粒劑，購自巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離 2020—2021 年從安徽省甘藍主產(chǎn)區(qū)（懷遠縣和壽縣）的4 個菌核病發(fā)生地塊采集病株，采用組織分離法（張佳環(huán) 等，2015）進行病原菌分離。切取發(fā)病組織病健交界處，經(jīng)75%酒精表面消毒15～30 s，0.1%升汞消毒90 s 后，無菌水洗滌3 次，然后置于PDA 平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)；待菌落長出后進行純化、保存。分離獲得的菌株按地區(qū)來源編號，來自懷遠縣的記為HY，來自壽縣的記為SX。

將分離純化后的菌株分別接種于PDA 平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)特征，對分離物進行形態(tài)學鑒定（劉婷婷 等，2016）。

1.2.2 病原菌的致病力測定 2021 年于安徽農(nóng)業(yè)大學溫室內(nèi)種植參試9 個甘藍品種，在直徑為12 cm 的塑料花盆中裝入育苗基質(zhì)（購自淮安市中禾農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司），每盆1 株。幼苗4～6 葉期，選取健康、完整且相近葉齡的葉片采用菌絲圓片活體接種法進行接種。使用直徑為5 mm 的打孔器在培養(yǎng)2 d 的病原菌菌落邊緣打取菌餅，將帶有菌絲的一面貼到葉片頂端距主葉脈2 cm 處；每株菌株每個品種接種3 株幼苗，每株接種3 片葉片，以接種瓊脂塊為對照。然后，置于人工氣候箱（25℃，相對濕度90%，12 h/12 h 光暗交替）內(nèi)，第5天調(diào)查植株發(fā)病情況，病情分級標準參考姚星偉等（2018）的方法。0 級，無明顯癥狀；1 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的10%以下；2 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的11%～30%；3 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的31%～50%；4 級，發(fā)病葉片病斑面積占葉片面積的51%以上。

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×相應級值）／（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級值）× 100

根據(jù)病情指數(shù)判定菌株的致病力，病情指數(shù)≤30，為弱致病力（WP）；30 ＜病情指數(shù)≤ 70，為中等致病力（MP）；病情指數(shù)＞ 70，為強致病力（HP）（孫溶溶 等，2011；姚星偉 等，2018）。

1.2.3 甘藍菌核病菌對殺菌劑的敏感性試驗 采用菌絲生長速率法測定不同來源的代表性菌株對3 種殺菌劑的敏感性。利用丙酮將多菌靈配制成濃度為1 000 μg·mL-1母液，利用無菌水將菌核凈和啶酰菌胺配制成濃度為1 000 μg·mL-1母液，分別加入PDA 培養(yǎng)基中制成含藥培養(yǎng)基，使多菌靈的終濃度分別為0、0.01、0.05、0.25、0.50、1.00 μg·mL-1，菌核凈的終濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.10、0.50 μg·mL-1，啶酰菌胺的終濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μg·mL-1；以等量不含藥劑的丙酮或無菌水加入PDA 培養(yǎng)基作為對照，每處理3 次重復，每重復4 皿。使用內(nèi)徑為3 mm 的打孔器在培養(yǎng)3 d 后的病原菌菌落邊緣打取菌餅，分別接種到含藥PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）／（對照菌落直徑-3 mm）× 100%

使用DPS 7.05 軟件計算抑制中濃度（EC50）和毒力回歸方程，并進行卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化

對采集的甘藍菌核病病株（圖1-a）進行病原菌分離，共得到24 株菌株，其中懷遠縣純化得到15 株，壽縣得到9 株。所有分離獲得的菌株形態(tài)一致，25 ℃培養(yǎng)條件下，PDA 平板上病原菌菌絲呈白色，菌絲稀薄，3 d 后菌落基本長滿整個平板；5 d 后PDA 平板的邊緣菌絲聚集，開始形成突起，初期為白色，較小，隨后逐漸膨大，且在突出部位上出現(xiàn)水珠；7 d 后突起的顏色逐漸加深，直至變成黑色菌核，成環(huán)狀排列，菌核形狀為圓形、橢圓形及不規(guī)則形（圖1-b）。

圖1 甘藍菌核病的田間癥狀及其病原菌的菌落形態(tài)

2.2 甘藍菌核病菌的致病力測定

采用菌絲圓片活體接種法測定了24 株菌株在9 個甘藍品種上的致病力，接種后發(fā)病病斑與采樣病株田間發(fā)病癥狀一致，呈橢圓形、近圓形水漬狀褐色病斑，病健交界明顯，對照葉片均未發(fā)??；采集分離9 個甘藍品種的病原菌與原接種菌株形態(tài)相同。這表明從田間甘藍發(fā)病部位分離得到的菌株為甘藍菌核病病原菌。

由表1 可以看出，安徽省甘藍菌核病菌的致病力表現(xiàn)出明顯差異。不同菌株對同一甘藍品種的致病力不同，如博春接種不同菌株后，11 株菌株表現(xiàn)為強致病力，1 株菌株表現(xiàn)為中等致病力，剩余菌株表現(xiàn)為弱致病力甚至未能引起該品種發(fā)病。同一地區(qū)內(nèi)的菌株致病力也存在明顯差異，供試甘藍品種接種來自懷遠縣的菌株HY4-3 的病情指數(shù)為66.67～100.00，而接種同來自懷遠縣的菌株HY6-3的病情指數(shù)僅為0～33.33；對于來自壽縣的菌株，接種SXG12 的病情指數(shù)為8.33～100.00，而接種SXG8 的病情指數(shù)為0～25.00。這表明菌株的致病性分化與地理來源無明顯相關性。

表1 甘藍菌核病菌對不同甘藍品種的致病性

2.3 甘藍菌核病菌對3 種殺菌劑的敏感性

2.3.1 對菌核凈的敏感性 由表2 可知，參試甘藍菌核病菌菌株對菌核凈的EC50值范圍為0.055 4～0.137 7 μg·mL-1；其中，菌株HY4-3 的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG1 的2.49倍。參考匡靜等（2011）、喬廣行等（2014）的標準，當EC50值小于5.0 μg·mL-1，則認為菌株對藥劑具有敏感性。表明本試驗中的參試菌株對菌核凈較敏感。

表2 甘藍菌核病菌對菌核凈的敏感性

2.3.2 對多菌靈的敏感性 由表3 可知，參試甘藍菌核病菌菌株對多菌靈的EC50值范圍為0.037 1～0.104 2 μg·mL-1；其中，菌株SXG12 的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG8 的2.81倍。表明參試菌株對多菌靈較敏感。

表3 甘藍菌核病菌對多菌靈的敏感性

2.3.3 對啶酰菌胺的敏感性 由表4 可知，參試甘藍菌核病菌菌株對菌核凈啶酰菌胺的EC50值范圍為0.074 4～0.187 0 μg·mL-1；其中，菌株HY4-1的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG3 的2.51倍。表明參試菌株對啶酰菌胺較敏感。

表4 甘藍菌核病菌對啶酰菌胺的敏感性

3 結(jié)論與討論

本試驗采用菌絲圓片活體接種法測定了來自安徽省2 個地區(qū)的24 株甘藍菌核病菌菌株對9 個甘藍品種的致病力，結(jié)果顯示安徽省甘藍菌核病菌的致病力表現(xiàn)出明顯差異，不同菌株對同一甘藍品種的致病力不同，同一地區(qū)內(nèi)的菌株致病力也存在明顯差異，但菌株的致病性分化與地理來源無明顯相關性。李沛利和葉華智（2006）在對油菜菌核病菌致病性分化研究時發(fā)現(xiàn)，油菜菌核病菌致病性存在強弱差異，致病性分化與寄主來源關系不大；劉佳等（2016）對黑龍江地區(qū)向日葵菌核病菌致病性分化研究表明，不同菌株之間致病力存在顯著差異，測試菌株與地理來源無明顯聯(lián)系，這與本試驗中發(fā)現(xiàn)的甘藍菌核病菌菌株的致病性分化與來源地區(qū)無關趨于一致。另外，本試驗中參試的甘藍品種大多數(shù)為目前安徽地區(qū)推廣的品種，對菌核病的抗病性信息不明，今后仍需進一步開展不同甘藍品種對菌核病的抗性篩選，以及甘藍菌核病菌的致病力差異分析。

多菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，因其殺菌譜廣、內(nèi)吸性強、防病效果好而得到廣泛應用，但其作用位點單一，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。目前已有安徽、北京、江蘇等地區(qū)報道油菜等作物的菌核病菌對多菌靈產(chǎn)生了抗藥性（齊永霞 等，2006；匡靜 等，2011；喬廣行 等，2014）。菌核凈屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，已被廣泛應用于控制油菜菌核病，但隨著該藥劑的推廣使用，部分地區(qū)的油菜菌核病菌逐漸出現(xiàn)抗藥性（石志琦 等，2000）。啶酰菌胺是目前使用范圍最廣、用量最大的琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，天津地區(qū)報道蔬菜菌核病菌對啶酰菌胺出現(xiàn)了抗藥性（楊利娟 等，2020）。本試驗采用菌絲生長速率法測定了安徽甘藍菌核病菌代表性菌株對多菌靈、菌核凈和啶酰菌胺的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參試菌株對3 種殺菌劑的敏感性均較高，未發(fā)現(xiàn)有抗藥性的菌株；其中對多菌靈敏感性最高，EC50值范圍為0.037 1～0.104 2 μg·mL-1；對菌核凈和啶酰菌胺的EC50值分別為0.055 4～0.137 7 μg·mL-1和0.074 4～0.187 0 μg·mL-1。這表明當前安徽省甘藍菌核病菌還未對常規(guī)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，建議在生產(chǎn)上使用多菌靈時與其他殺菌劑搭配使用，能夠有效控制甘藍菌核病。