范學(xué)寧，成艷，趙國(guó)服，陳明

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是一種對(duì)人體十分重要的ω-3多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育、增強(qiáng)視力、防治心血管疾病等生理功能[1]，廣泛用于食品醫(yī)藥行業(yè)。DHA的傳統(tǒng)來源是深海魚油，但由于受到魚類資源過度捕撈、海洋環(huán)境污染、產(chǎn)品腥味較大等限制，產(chǎn)量和質(zhì)量難以滿足人們對(duì)DHA日益增長(zhǎng)的需求，尋求一條可持續(xù)的替代生產(chǎn)途徑迫在眉睫[2]。近年來人們開展了利用海洋真菌包括裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)、破囊壺菌(Aurantiochytriumsp.)、隱甲藻(Cryptheconidiumcohnii)等發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂的研究[3-5]。

裂殖壺菌又稱裂壺藻，是一種異氧單細(xì)胞海洋真菌，具有生長(zhǎng)速度快、易培養(yǎng)、DHA含量高和油脂食用安全等優(yōu)點(diǎn)，是替代深海魚油生產(chǎn)DHA的極具潛力微生物[6]。2010年國(guó)家衛(wèi)生部將裂殖壺菌油脂批準(zhǔn)為新資源食品。利用裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂已成為研究熱點(diǎn)[7]，研究主要集中在菌株選育[8-9]、發(fā)酵底物[10]、發(fā)酵工藝[11]、油脂提取分析[12]等方面。裂殖壺菌培養(yǎng)過程一般可分為細(xì)胞增殖期、油脂積累期、油脂反耗期3個(gè)階段，而氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過參與并調(diào)控細(xì)胞代謝，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、油脂合成啟動(dòng)、油脂產(chǎn)量、脂肪酸組成等產(chǎn)生重要影響[13-16]。REN等[13]發(fā)現(xiàn)添加氮源谷氨酸鈉促進(jìn)了裂殖壺菌細(xì)胞生長(zhǎng)但抑制了油脂積累，而添加硫酸銨則提高了總脂肪酸中DHA含量但抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累；LING等[14]采用擋板搖瓶中補(bǔ)加谷氨酸鈉工藝提高了裂殖壺菌生物量和DHA產(chǎn)量；本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)酵母浸粉和谷氨酸鈉的有機(jī)氮源組合能夠提高裂殖壺菌生物量、油脂產(chǎn)量和DHA含量，而添加無(wú)機(jī)氮源則降低了生物量和油脂產(chǎn)量[15]。磷源方面，REN等[16]研究了KH2PO4濃度對(duì)裂殖壺菌油脂產(chǎn)量和DHA合成的影響，發(fā)現(xiàn)磷限制條件下更有利于油脂積累和DHA生成。上述研究表明，氮、磷源作為裂殖壺菌生長(zhǎng)所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其種類和濃度會(huì)顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累。本文利用一株裂殖壺菌DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂，進(jìn)一步研究了氮源(酵母浸粉+谷氨酸鈉)和磷源(KH2PO4)濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和油脂積累的影響，以期為裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

裂殖壺菌Schizochytriumsp.DP-16，本實(shí)驗(yàn)室保藏于-80 ℃冰箱的甘油管中。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硫酸鎂，天津市大茂化學(xué)試劑廠；酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；谷氨酸鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；海水晶，山東強(qiáng)隆海水晶廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨2，海水晶15，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min；對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基C(g/L)：葡萄糖80，酵母浸粉10，谷氨酸鈉10，KH2PO4·H2O 7，MgSO4·7H2O 5，海水晶15，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min；低氮發(fā)酵培養(yǎng)基N-(g/L)：酵母浸粉1，谷氨酸鈉1，其余同對(duì)照；高氮發(fā)酵培養(yǎng)基N+(g/L)：酵母浸粉30，谷氨酸鈉30，其余同對(duì)照；低磷發(fā)酵培養(yǎng)基P-(g/L)：KH2PO4·H2O 1，其余同對(duì)照；高磷發(fā)酵培養(yǎng)基P+(g/L)：KH2PO4·H2O 20，其余同對(duì)照；低氮低磷發(fā)酵培養(yǎng)基N-P-(g/L)：酵母浸粉1，谷氨酸鈉1，KH2PO4·H2O 1，其余同對(duì)照；高氮高磷發(fā)酵培養(yǎng)基N+P+(g/L)：酵母浸粉30，谷氨酸鈉30，KH2PO4·H2O 20，其余同對(duì)照。

1.2 儀器與設(shè)備

SYQ-DSK-20B高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SWCCL-2FD超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SL-202 N電子天平，上海長(zhǎng)橋精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-2102C全溫度恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；GL-21M高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙市湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SH420F石墨消解儀、K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備

取甘油管菌種，接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于25 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵

按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量將種子液接入裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定總氮、溶磷、葡萄糖濃度、生物量、油脂產(chǎn)量，并計(jì)算油脂含量。

1.3.3 分析方法

采用DNS法測(cè)定葡萄糖濃度；采用細(xì)胞干重法測(cè)定生物量：取2 mL發(fā)酵液加入預(yù)先稱重的離心管中，加入3 mL去離子水，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌2次，置于60 ℃烘干至恒重，稱重；采用磷酸香草醛法測(cè)定油脂產(chǎn)量[17]；采用凱氏定氮法測(cè)定總氮含量：發(fā)酵液離心后，取3 mL 上清液于消化管中，加入0.3 g硫酸銅、3 g硫酸鉀和10 mL濃硫酸進(jìn)行消化，然后采用凱氏定氮儀測(cè)定；溶磷濃度測(cè)定：發(fā)酵液離心后，取0.1 mL上清液至試管中，加2.9 mL去離子水和3 mL定磷試劑[V(3 mol/L硫酸溶液)∶V(水)∶V(25 g/L鉬酸銨溶液)∶V(100 g/L抗壞血酸溶液)=1∶2∶1∶1]搖勻，45 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，660 nm測(cè)吸光值，對(duì)照溶磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中溶磷濃度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)3個(gè)平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)油脂過程分析

Schizochytriumsp.DP-16在對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間進(jìn)程如圖1所示。在發(fā)酵初期(0～24 h)，葡萄糖濃度開始降低，生物量逐漸上升，而油脂產(chǎn)量和油脂含量均保持在很低水平，此階段為菌體消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括碳、氮、磷源)用于細(xì)胞增長(zhǎng)繁殖的增殖期；在發(fā)酵過程的第二階段(24～84 h)，葡萄糖被快速消耗利用，細(xì)胞生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量快速增加，在72 h左右葡萄糖基本耗盡，生物量達(dá)42.3 g/L，油脂產(chǎn)量和油脂含量在84 h達(dá)到最高，分別為14.1 g/L 和33.5%，此階段為菌體細(xì)胞代謝葡萄糖生成油脂(主要為甘油三酯)貯存在胞內(nèi)的油脂積累期；在發(fā)酵后期(84～96 h)，培養(yǎng)基中碳源葡萄糖已耗盡，菌體開始消耗利用細(xì)胞內(nèi)貯存的油脂來維持其必需的生命代謝活動(dòng)，油脂產(chǎn)量和油脂含量開始下降，進(jìn)入了油脂反耗期。

圖1 Schizochytrium sp.DP-16在對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)程Fig.1 Time course of fermentation by Schizochytrium sp.DP-16 in control fermentation medium

2.2 氮源濃度對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)和油脂積累的影響

Schizochytriumsp.DP-16在低氮(N-)、對(duì)照(C)、高氮(N+)3個(gè)不同氮源濃度下培養(yǎng)，葡萄糖濃度、生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量變化情況如圖2所示。在1 g/L酵母浸粉和1 g/L谷氨酸鈉的低氮源濃度(N-)條件下，菌株消耗利用葡萄糖較慢，96 h殘留葡萄糖濃度高達(dá)35.8 g/L，遠(yuǎn)高于對(duì)照(C)和高氮(N+)組，而低氮(N-)條件下的生物量則顯著低于對(duì)照(C)和高氮(N+)組，說明氮源濃度過低導(dǎo)致嚴(yán)重限制菌體生長(zhǎng)增殖。從油脂產(chǎn)量和油脂含量變化來看，低氮(N-)組從12 h開始油脂含量快速增加，高于對(duì)照(C)和高氮(N+)組，說明低氮條件下氮源被菌體快速耗盡使得更早進(jìn)入油脂積累期，但受限于生物量過低導(dǎo)致最終油脂產(chǎn)量低于對(duì)照(C)。30 g/L酵母浸粉和30 g/L谷氨酸鈉的高氮源濃度(N+)雖然有利于Schizochytriumsp.DP-16的增殖，84 h 生物量達(dá)到45.2 g/L，但由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(通常為氮源)耗盡是產(chǎn)油微生物油脂積累啟動(dòng)的先決條件，氮源濃度過高導(dǎo)致難以啟動(dòng)油脂積累，并不有利于油脂生成，96 h的油脂產(chǎn)量?jī)H為9.4 g/L，油脂含量?jī)H為23.3%，均明顯低于對(duì)照(C)。由上述結(jié)果可知，氮源濃度對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)和油脂積累產(chǎn)生重要影響，氮源濃度過低或過高均不利于油脂生成。為提高油脂產(chǎn)量，通常采用的策略是在發(fā)酵初期提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括氮源)供細(xì)胞大量增殖，以提高菌體細(xì)胞密度，然后通過氮饑餓(即氮源匱乏而碳源量充足)促使裂殖壺菌細(xì)胞合成油脂[6]。JU等[18]采用限量補(bǔ)加氮源策略促進(jìn)裂殖壺菌產(chǎn)油脂，60 h油脂產(chǎn)量達(dá)25.4 g/L，油脂含量達(dá)生物量的39.0%。

a-葡萄糖質(zhì)量濃度；b-生物量；c-油脂產(chǎn)量；d-油脂含量圖2 氮源濃度對(duì)Schizochytrium sp.DP-16發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響Fig.2 Effects of nitrogen source concentration on fermentation by Schizochytrium sp.DP-16 for lipid production

2.3 磷源濃度對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)和油脂積累的影響

Schizochytriumsp.DP-16在低磷(P-)、對(duì)照(C)、高磷(P+)3個(gè)磷源濃度下的發(fā)酵進(jìn)程如圖3所示。在1 g/L KH2PO4·H2O的低磷(P-)條件下，葡萄糖消耗利用速度最快，48 h基本耗盡，快于對(duì)照(C)和高磷(P+)組，生物量在48 h達(dá)到峰值35.3 g/L，之后緩慢下降，并低于對(duì)照(C)，說明磷源濃度較低同樣對(duì)菌體生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生不利影響。低磷(P-)組的油脂產(chǎn)量和油脂含量從12 h開始快速增加，明顯高于對(duì)照(C)組和高磷(P+)組，表明在磷限制條件下磷源被菌體快速耗盡，從12 h即進(jìn)入油脂積累期，葡萄糖被代謝轉(zhuǎn)化成油脂(以甘油三酯為主)，貯存在菌體細(xì)胞內(nèi)，72 h油脂產(chǎn)量和油脂含量分別達(dá)到14.8 g/L 和44.3%，均高于對(duì)照(C)和高磷(P+)組，在磷限制條件下72 h的油脂產(chǎn)量和油脂含量與對(duì)照組84 h的結(jié)果相比分別提高了5.0%和32.2%。20 g/L KH2PO4·H2O的高磷(P+)條件對(duì)Schizochytriumsp.DP-16細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累均產(chǎn)生不利影響，可能是培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度過高引起的高滲透壓對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)影響所致。磷限制能夠促進(jìn)產(chǎn)油微生物細(xì)胞內(nèi)油脂(主要為甘油三酯)的積累，在其他文獻(xiàn)中也得到證實(shí)[16,19]。

a-葡萄糖質(zhì)量濃度；b-生物量；c-油脂產(chǎn)量；d-油脂含量圖3 磷源濃度對(duì)Schizochytrium sp.DP-16發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響Fig.3 Effects of phosphorus source concentration on fermentation by Schizochytrium sp.DP-16 for lipid production

2.4 高氮高磷濃度下裂殖壺菌發(fā)酵特性

進(jìn)一步探究了Schizochytriumsp.DP-16在高氮高磷發(fā)酵培養(yǎng)基(N+P+)中發(fā)酵特性，結(jié)果如圖4所示。

a-碳源、生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量變化；b-總氮、溶磷變化圖4 Schizochytrium sp.DP-16在高氮高磷發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)程Fig.4 Time course of fermentation by Schizochytrium sp.DP-16 in high nitrogen and high phosphorus fermentation medium

可以看出，在培養(yǎng)基中氮源和磷源濃度均過高的條件下，Schizochytriumsp.DP-16僅能消耗利用少量的氮源和磷源，在96 h發(fā)酵液中仍有較高濃度的氮源和磷源殘留。碳源葡萄糖被緩慢消耗利用，96 h殘留葡萄糖質(zhì)量濃度為19.2 g/L。氮源和磷源濃度過高對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖并無(wú)明顯的促進(jìn)作用，相反還產(chǎn)生了一定程度的抑制，96 h的生物量?jī)H為28.8 g/L，此結(jié)果遠(yuǎn)低于對(duì)照(C)和高氮(N+)組，亦低于高磷(P+)組。高氮高磷濃度下整個(gè)發(fā)酵過程中油脂產(chǎn)量和油脂含量一直處于很低水平，96 h的油脂產(chǎn)量?jī)H為4.8 g/L，油脂含量則僅為16.8%，說明氮源和磷源濃度過高嚴(yán)重影響到Schizochytriumsp.DP-16細(xì)胞正常代謝，抑制了胞內(nèi)油脂生物合成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)量均產(chǎn)生了非常不利的影響。

2.5 低氮低磷濃度下裂殖壺菌發(fā)酵特性

同時(shí)降低培養(yǎng)基中氮源和磷源濃度，探究了Schizochytriumsp.DP-16在低氮低磷發(fā)酵培養(yǎng)基(N-P-)中發(fā)酵特性，結(jié)果如圖5所示?？梢姡诘春土自礉舛染^低情況下，培養(yǎng)基中氮源和磷源被菌體快速消耗利用，可利用氮源在6 h左右即耗盡，而溶磷在12 h后處于較低水平。在低氮低磷條件下，Schizochytriumsp.DP-16消耗利用葡萄糖較為緩慢，96 h殘留葡萄糖濃度仍高達(dá)31.2 g/L，與低氮(N-)組結(jié)果相當(dāng)。從生物量來看，在84 h達(dá)到最高值，但僅為18.3 g/L，比低氮(N-)組、低磷(P-)組結(jié)果更低，這是因?yàn)榈?、磷元素是蛋白質(zhì)、核酸等生物合成的必需元素，氮、磷源濃度過低將嚴(yán)重抑制Schizochytriumsp.DP-16細(xì)胞增殖。從油脂產(chǎn)量和油脂含量變化來看，接種后細(xì)胞油脂含量急劇上升，在60 h達(dá)到最高值47.7%，說明低氮低磷條件下任一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氮源或磷源)的快速耗盡使得菌體快速啟動(dòng)油脂生物合成，但受限于低氮低磷條件下細(xì)胞生物量過低，導(dǎo)致最終油脂產(chǎn)量不高，84 h的油脂產(chǎn)量?jī)H為8.4 g/L，低于低氮(N-)組、低磷(P-)組和對(duì)照(C)組結(jié)果。上述結(jié)果表明，氮限制或磷限制作為促進(jìn)產(chǎn)油微生物油脂積累的常用策略，但如果氮源或磷源濃度過低，菌體過早進(jìn)入氮饑餓或磷饑餓，會(huì)嚴(yán)重限制細(xì)胞增殖，細(xì)胞生物量太低將直接導(dǎo)致總油脂產(chǎn)量不高。因此，確定適宜的氮、磷源濃度需要在獲得高細(xì)胞濃度(生物量)和達(dá)到高油脂含量之間找到一個(gè)合適的平衡，氮、磷源濃度過高或過低均不利于油脂生產(chǎn)[6]。

a-碳源、生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量變化；b-總氮、溶磷變化圖5 Schizochytrium sp.DP-16在低氮低磷發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)程Fig.5 Time course of fermentation by Schizochytrium sp.DP-16 in low nitrogen and low phosphorus fermentation medium

3 結(jié)論

本研究利用一株海洋真菌Schizochytriumsp.DP-16發(fā)酵產(chǎn)油脂，以葡萄糖為碳源，以酵母浸粉和谷氨酸鈉為氮源，以KH2PO4為磷源，探究了氮、磷源濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)、葡萄糖消耗和油脂積累的影響。結(jié)果顯示，Schizochytriumsp.DP-16在適量氮、磷源濃度的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0～24 h為細(xì)胞增殖期，此階段菌體消耗碳、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖；24～84 h為油脂積累期，此階段氮源耗盡，碳源充足，菌體轉(zhuǎn)化葡萄糖為胞內(nèi)油脂；84～96 h進(jìn)入油脂反耗期，此階段碳源耗盡，需消耗胞內(nèi)油脂來維持細(xì)胞代謝活動(dòng)。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源充足，氮源或磷源任一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡均能使菌體由增殖期轉(zhuǎn)入油脂積累期。裂殖壺菌的油脂產(chǎn)量取決于菌體生物量和細(xì)胞內(nèi)油脂含量的乘積，為提高總油脂產(chǎn)量，需要在獲得高細(xì)胞濃度(生物量)和達(dá)到高油脂含量之間找到一個(gè)合適的平衡，以確定適宜的氮、磷源濃度。本研究對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)油脂過程中控制適宜的氮磷源濃度，縮短發(fā)酵周期，提升油脂生產(chǎn)效率具有重要參考價(jià)值。