王 慧，陳麗梅，徐瑞祥，陳 釗，周娟清，卓文浩，劉紅寧＊＊

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；3.啟東市人民醫(yī)院 南通 226200）

《素問·上古天真論》中以女子七、男子八為基數(shù)遞進(jìn)描述了生長、發(fā)育、衰老曲線與腎氣盛衰相關(guān)聯(lián)。人之生長壯老，皆由陽氣為之主[1]，陽化氣的過程相當(dāng)于物質(zhì)代謝產(chǎn)生能量的過程[2]。且對(duì)人體生命而言，陽是人體溫?zé)岬哪芰縖3]。隨著年齡的增大，制造能量的線粒體會(huì)積累活性氧誘導(dǎo)的損傷，導(dǎo)致線粒體功能下降[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，24月齡大鼠離體心肌線粒體膜脂類物質(zhì)多不飽和脂肪酸含量隨年齡的增加而明顯下降[6]。大鼠睪丸線粒體膜多不飽和脂肪酸的含量隨年齡的增加而明顯下降，且飽和脂肪酸的比例增加，因此多不飽和脂肪酸的百分含量下降[7]。有研究顯示老年小鼠腦線粒體耗氧速率明顯低于青年小鼠[8]，可能是呼吸鏈的活性較低所致，而琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體的關(guān)鍵酶，參與細(xì)胞能量所需ATP的生物合成，有研究顯示衰老對(duì)小鼠心室肌細(xì)胞SDH水平有明顯的抑制作用[9]，影響線粒體的正常功能，因此線粒體是生命能量的創(chuàng)造者，線粒體的功能對(duì)衰老細(xì)胞的影響至關(guān)重要。

《扁鵲心書》提出“人于無病時(shí)，常灸關(guān)元……，雖未得長生，亦可保百余年壽矣?！边@種以灸法預(yù)防衰老的方法稱為“保健灸”[10]。艾灸燃燒時(shí)可通過熱效應(yīng)、光輻射和藥效應(yīng)等將熱量傳入人體，為機(jī)體細(xì)胞代謝活動(dòng)提供必要的能量，也能為能量缺乏的病態(tài)細(xì)胞提供活化能[11]。關(guān)元穴為元?dú)馑嬷?，趙小恒[12]認(rèn)為獨(dú)灸關(guān)元進(jìn)行養(yǎng)生，可以起到補(bǔ)益元?dú)?、溫腎健脾、溫中散寒、補(bǔ)腎納氣、溫暖下元、延年保健的作用。研究表明艾灸關(guān)元穴可以改善阿爾茨海默?。ˋD）小鼠的三羧酸代謝和不飽和脂肪酸代謝來改善AD動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能[13]。金匱腎氣丸有溫補(bǔ)腎陽、行氣化水之效，且是溫補(bǔ)腎陽、延緩衰老的代表方[14]，本文以此藥作為該研究的觀察對(duì)比用藥。

代謝組學(xué)主要用于分析生物生理與病理狀態(tài)下內(nèi)源性小分子代謝物的差異，通過數(shù)據(jù)分析，可以檢測(cè)出生物體代謝產(chǎn)物的微小變化，與中醫(yī)藥的整體性、動(dòng)態(tài)性原則相吻合[15]。艾灸作為一種治療方式靈活、費(fèi)用低廉的預(yù)防保健手段，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

基于此，本實(shí)驗(yàn)選取自然老齡化大鼠為研究對(duì)象，通過觀察腎臟病理狀態(tài)、腎功能水平、線粒體呼吸耗氧速率和琥珀酸脫氫酶的活性，利用代謝組學(xué)技術(shù)研究艾灸關(guān)元穴對(duì)老年大鼠腎代謝的影響，初步探討艾灸關(guān)元穴對(duì)老年大鼠補(bǔ)腎陽的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與試劑

安捷倫超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Aglient，1290-G6538）；真空離心濃縮儀（美國Thermo Fisher，SPD131DDA-P1-230）；高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher，LYNX6000）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan，Spark 10M）；高通量冷凍組織研磨儀（美國SPEX，Geno2010）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津，UV-2600）；全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckmancoulter，AU480）；石 蠟 包 埋 機(jī)（徠 卡，EG1150）；石蠟切片機(jī)（徠卡，RM2016）；顯微鏡（明美，MF43）；金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，產(chǎn)品批號(hào)：20030989）；5%金匱腎氣丸含藥飼料（上海帆泊生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20200831）；艾條（江西鄱艾生物科技有限公司，艾絨比∶8∶1，直徑8 mm）；HPLC級(jí)甲醇、乙腈（德國Merck）；甲酸（Dikma Pure，批號(hào)：2486917）。SM0020線粒體提取試劑盒（Solarbio，批號(hào)：20201027）；ab197243細(xì)胞外氧氣消耗量試劑盒（Abcam，批號(hào)：GR3351604-2）；琥珀酸（Solarbio，批號(hào)：225E081）；蔗糖（西隴科學(xué)，批號(hào)：191202）；氯化鉀（KCl）（西隴科學(xué)，批號(hào)：200301）；乙二醇雙2-氨基乙醚四乙酸（EGTA）（MACKUN，批號(hào)：C10916981）；氯 化 鎂（MgCl2）（西 隴 科 學(xué)，批 號(hào)：20180730）；磷酸氫二鉀（K2HPO4）（西隴科學(xué)，批號(hào)：180608）；琥珀酸脫氫酶（SDH）測(cè)試盒（南京建成，批號(hào)：20201221）；總蛋白定量（考馬斯亮藍(lán)法）（南京建成，批號(hào)：20201209）；肌酐（Cr）、尿酸（UA）、尿素（UREA）血清試劑盒均購自湖南海源醫(yī)療科技股份有限公司（批號(hào)：20210129、20201110、20200925）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣品收集

8月齡、21月齡雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，喂養(yǎng)過程中由于老年大鼠自然衰老死亡1只，故將8月齡SD雄性大鼠作為成年對(duì)照組（n=8），21月齡雄性大鼠隨機(jī)分為老年對(duì)照組（n=8）、老年金匱腎氣丸組（n=7）、老年艾灸組（n=8）。老年艾灸組大鼠參照《大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜》取穴，將穴區(qū)1.0 cm左右的鼠毛剃干凈，艾灸時(shí)大鼠用黑色襪子套頭，保持老鼠躺平的姿勢(shì)，艾條在穴區(qū)上方2 cm左右燃燒，保持溫?zé)岣?，使老鼠舒適安靜。每日艾灸關(guān)元穴（CV4）15 min，5日1療程，實(shí)驗(yàn)持續(xù)13周，其余組大鼠均按相同的方法和時(shí)間抓取。老年金匱腎氣丸組每日分框按大鼠體重喂食5%含藥飼料，給藥劑量由成人臨床用量10 g/60 kg的6.3倍換算而來，同樣5日1療程，實(shí)驗(yàn)持續(xù)13周。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食不禁水12 h，解剖后腹主動(dòng)脈取血，將血液在室溫下靜置2-3 h，4℃條件下3500 rpm離心15 min，放入-80℃冰箱，備用。取血后摘取新鮮腎組織，PBS緩沖液洗凈殘留血液，濾紙吸干，立即切取100 mg用于提取線粒體。另取一部分腎組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h，制作成HE染色病理切片，剩下的組織放于-80℃保存，供試劑盒檢測(cè)和代謝組學(xué)研究。

1.3 大鼠血清腎功能的測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清肌酐（Cr）、尿酸（UA）、尿素（UREA）含量。

1.4 觀察腎組織形態(tài)變化

將腎組織從多聚甲醛中取出，石蠟包埋、切片、HE染色，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.5 線粒體外耗氧速率實(shí)驗(yàn)

1.5.1提取線粒體

取新鮮腎組織100 mg，放入預(yù)冷的Dounce勻漿器內(nèi)，添加1 mL預(yù)冷的Lysis Buffer進(jìn)行勻漿。取出上清，按說明書操作進(jìn)行梯度離心，最后棄上清，得高純度線粒體沉淀。

1.5.2線粒體代謝速率測(cè)定

緩 沖 液 的 配 制：250 mmol·L-1蔗 糖，15 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1EGTA，5 mmol·L-1MgCl2，30 mmol·L-1K2HPO4，PH=7.4，過濾除菌。

向細(xì)胞外氧氣消耗試劑中添加1 mL雙蒸水，并充分混勻，測(cè)時(shí)用緩沖液稀釋制成重組探針。向明底黑色壁的96孔板中加入重組探針100μL、線粒體50μL和100 mmol/L琥珀酸底物50μL?？瞻讓?duì)照孔中只加入緩沖液200μL。立即用37℃高靈敏度礦物油（2滴）密封每個(gè)孔，并除去氣泡。將96孔板插入預(yù)熱至37℃的酶標(biāo)儀，Ex/Em=380/650 nm條件下持續(xù)檢測(cè)信號(hào)10-30 min。

1.6 琥珀酸脫氫酶（SDH）活性

取儲(chǔ)存于-80℃冰箱的腎組織，用生理鹽水按重量體積比1∶9制備成組織勻漿液，在4℃條件下3500 rpm離心10 min，取上清，按試劑盒說明書操作。組織蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.7 代謝組學(xué)檢測(cè)

1.7.1腎組織樣品前處理

將樣本從-80℃冰箱中取出，稱取腎組織200 mg，加入1.5 mL預(yù)冷的水：甲醇（20∶80）進(jìn)行低溫勻漿，渦旋振蕩3-5 min。然后，在4℃條件下以15000 rpm離心15 min，吸取上清液，低溫濃縮使其干燥。將殘?jiān)眉状紡?fù)溶，混勻，在4℃條件下以15000 rpm離心15 min。最后從每個(gè)樣品上清液中取10μL混合作為QC（quality control）樣品以監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜濾過后上機(jī)檢測(cè)。

1.7.2色譜條件

安捷倫超高液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）；色譜柱為ZORBAX Extend-C18（2.1×100 mm，3.5 μm，Agilent），流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫條件：0-8 min，2-28% B；8-10 min，28-54% B；10-15 min，54-71% B；15-18min，71-88% B；18-19 min，88-100% B；19-20 min，100-2%B；20-21 min，2%B。進(jìn)樣量6μL，柱溫35℃，樣品室溫度4℃，流速0.4 mL·min-1。

1.7.3質(zhì)譜條件

采用雙電噴霧離子源（Dual ESI），正離子模式下，干燥器溫度：350℃，流速10 L·min-1，掃描方式：Full Scan，掃描范圍：m/z 50-1000，毛細(xì)管電壓：4000 V，噴霧室壓力：35 psig，碎片電壓：175 V，錐孔電壓：65 V。負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓：3500 V，其余條件同正離子模式。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），符合正態(tài)分布且方差齊以LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示成年對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，均勻分布于腎皮質(zhì)中（圖A1，A2）；老年對(duì)照組腎小球體積略微增大，偶見間質(zhì)淤血，腎小管管腔中偶見嗜酸性蛋白液，形成管型（圖B1，B2）；老年金匱腎氣丸組腎小球體積略微增大，腎小管管腔中偶見嗜酸性蛋白液，形成管型（圖C1，C2）；老年艾灸組腎小球體積略微增大，偶見間質(zhì)淤血，但程度較老年對(duì)照組減輕（圖D1，D2）。

2.2 艾灸關(guān)元穴對(duì)血清腎功能的影響

結(jié)果顯示，與成年對(duì)照組大鼠比較，老年對(duì)照組大鼠腎功能水平無顯著性差異（P＞0.05），與老年對(duì)照組大鼠比較，老年金匱腎氣丸組大鼠腎功能水平無顯著性差異，老年艾灸組大鼠血清Cre含量顯著降低。結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清腎功能水平的比較（±s）

表1 大鼠血清腎功能水平的比較（±s）

注：與老年對(duì)照組比較，#P＜0.05。

?

2.3 艾灸關(guān)元穴對(duì)腎線粒體耗氧速率的影響

對(duì)OD值下降曲線進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程，方程斜率的絕對(duì)值越大說明線粒體代謝速率越快。與老年對(duì)照組比較，成年對(duì)照組大鼠腎線粒體耗氧速率顯著高于老年對(duì)照組（P＜0.01），老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組均能顯著升高老年大鼠腎線粒體耗氧速率（P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織線粒體耗氧速率比較

2.4 艾灸關(guān)元穴對(duì)腎組織SDH酶活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，老年大鼠較成年大鼠的腎組織SDH酶活力顯著降低（P＜0.01）；與老年對(duì)照組比較，老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組大鼠的腎組織SDH酶活力均顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見圖3。

注：與老年對(duì)照組比較，##P＜0.01。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.5 艾灸關(guān)元穴對(duì)腎組織代謝模式的影響

2.5.1腎組織代謝物譜的UHPLC-Q-TOF-MS分析

正、負(fù)離子模式下成年對(duì)照組、老年對(duì)照組、老年金匱腎氣丸組、老年艾灸組大鼠腎組織總離子流圖譜見圖4。從圖中可以看出，樣本重疊性較好，說明儀器運(yùn)行穩(wěn)定。正離子模式下老年對(duì)照組相較于成年對(duì)照組腎組織總離子流圖發(fā)生了明顯的變化，說明隨著年齡的增長，老年大鼠腎組織代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化，且艾灸關(guān)元穴和金匱腎氣丸給藥使老年大鼠腎組織代謝產(chǎn)物接近成年對(duì)照組大鼠。

圖4 正負(fù)離子模式下各組大鼠腎組織總離子流圖

2.5.2多元統(tǒng)計(jì)分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件并采用有監(jiān)督模式的偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）方法對(duì)各組腎組織樣本進(jìn)行代謝輪廓分析。分析結(jié)果顯示，正離子模式下老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組沒有完全分離開（圖5A），負(fù)離子模式下老年對(duì)照組和老年金匱腎氣丸組沒有完全分離開（圖5B）。但是通過三維圖可知，正離子模式下老年金匱腎氣丸組和老年艾灸組只有個(gè)別樣本分離不開，說明兩者代謝譜是接近的（圖5C），負(fù)離子模式下老年對(duì)照組和老年金匱腎氣丸組能夠很好的分開（圖5D）。正負(fù)離子模式下金匱腎氣丸和艾灸關(guān)元穴對(duì)老年大鼠腎代謝物都產(chǎn)生了明顯影響。為了驗(yàn)證模型可靠性，對(duì)PLS-DA模型數(shù)據(jù)進(jìn)行200次隨機(jī)排列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，模型驗(yàn)證結(jié)果顯示左側(cè)所有R2和Q2值低于右側(cè)原始點(diǎn)，Q2截距值等于或小于0，表明模型未產(chǎn)生過分?jǐn)M合，此模型可靠[16][截距：R2=0.702，Q2=-0.109（圖5E）；R2=0.34，Q2=-0.37（圖5F）]。

圖5 正負(fù)離子模式下大鼠腎組織代謝物PLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)

2.5.3潛在生物標(biāo)記物的分析

通過MPP軟件分析，篩選出Fold-change＞2及P＜0.05的代謝物作為潛在生物標(biāo)志物，通過HMDB數(shù)據(jù)庫結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜信息對(duì)篩選出的大鼠潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行鑒定指認(rèn)。以保留時(shí)間RT 16.28，m/z 280.2633的離子為例，通過分子特征提取，得到[M+H]+（m/z 280.2635），分子式C18H33NO在MassHunter中得分值比較高，在MS/MS圖譜中主要有m/z 55.0538、m/z 83.0858、m/z 95.0870、m/z 124.1195、m/z 175.1490、m/z 245.2212、m/z 265.0197、m/z 280.2635的碎片離子，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)與亞油酰胺化合物的圖譜最吻合，對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫m/z 55.0542、m/z 83.0855、m/z 245.2264、m/z 280.2635。因此該化合物被鑒定為亞油酰胺，見圖6。利用此方法在正離子模式中鑒定出4個(gè)共同潛在生物標(biāo)記物，分別是丁酸十二烷基酯、亞油酰胺、5-甲基四氫葉酸、PC(16：0/22：5(7Z，10Z，13Z，16Z，19Z))，在負(fù)離子模式中鑒定出9個(gè)共同潛在生物標(biāo)記物，分別是6,8-二羥基嘌呤、1,2,3-丙烷三羧酸、3-(4-甲氧基苯基)-2-氧代丙酸、吲哚-3-乙酰甘氨酸、亞麻油酸、9,10-環(huán)氧十八烷酸、二十二碳五烯酸(22n-6)、?；悄懰?、LysoPS(18:0/0:0)。結(jié)果見表2。

表2 腎組織中鑒定的潛在生物標(biāo)記物及變化趨勢(shì)

圖6 亞油酰胺二級(jí)質(zhì)譜圖

2.5.4代謝通路

將鑒定所得潛在生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)帶入在線數(shù)據(jù)庫MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示潛在生物標(biāo)記物主要參與亞油酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x、葉酸參與的一碳單位代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成，見圖7。

圖7 大鼠腎組織代謝通路圖

3 討論

陰陽五行學(xué)說中把對(duì)于人體具有推進(jìn)、溫煦、興奮等作用的物質(zhì)和功能統(tǒng)歸于陽[17]，中醫(yī)認(rèn)為，腎陽為各臟陽氣之本，對(duì)各臟腑、組織器官起著推動(dòng)、溫煦的作用，腎陽得以溫煦，則人體機(jī)能活動(dòng)旺盛。線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場(chǎng)所，其負(fù)責(zé)的最終氧化的共同途徑是三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化[18]。琥珀酸脫氫酶是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一[19]。作為參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，琥珀酸脫氫酶是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一。本研究結(jié)果顯示，青年大鼠腎組織線粒體呼吸耗氧速率和琥珀酸脫氫酶的活力明顯高于老年大鼠，由此可見，青年大鼠處于生長發(fā)育階段，其腎氣旺盛，而其代謝也處于旺盛階段。隨著年齡的增長，機(jī)體腎功能下降，且與線粒體功能有關(guān)[20]。陽氣是人體熱量的來源，金匱腎氣丸給藥和艾灸關(guān)元穴后都能夠提高老年大鼠的腎組織線粒體功能，推測(cè)艾灸可能通過影響線粒體三羧酸循環(huán)中的中介物質(zhì)來提高腎組織的能量代謝，從而進(jìn)一步推動(dòng)腎陽的溫煦作用。

能量代謝系統(tǒng)是需氧生物體內(nèi)分布于線粒體的普遍代謝途徑，是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。?；悄懰釣橐环N常見的結(jié)合型膽汁酸，牛磺膽酸由膽酸的羧基與?；撬岬陌被怎０锋I結(jié)合而成，參與脂類的消化吸收[21]，在人類機(jī)體中，膽汁酸合成的減少與年齡增長有關(guān)。?；撬崾菂⑴c多個(gè)氨基酸代謝與能量代謝的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)化節(jié)點(diǎn)，?；撬岷蛠喤；撬岽x路徑側(cè)面反應(yīng)了機(jī)體的能量代謝水平[22]。有研究提到?；撬岷肯陆?0%與嚴(yán)重的呼吸鏈功能障礙有關(guān)[23]，細(xì)胞?；撬岷慕邥?huì)降低呼吸功能并增加線粒體超氧化物的生成[24]，可能會(huì)使呼吸鏈復(fù)合物I（NADH氧化酶）和III（細(xì)胞色素c氧化還原酶）的活性下降，耗氧量減少[25]。有研究[26]表明長期補(bǔ)充低劑量的牛磺酸可以減輕與SD大鼠年齡相關(guān)的O2消耗下降，并且能夠提高比目魚肌和胃肌中SDH基因的表達(dá)，提高肌肉SDH活性，說明?；撬崤c能量代謝密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的代謝組學(xué)結(jié)果顯示，?；悄懰嵩诶夏杲饏T腎氣丸組和老年艾灸組的腎組織中含量下降且與成年對(duì)照組趨勢(shì)一致，牛磺酸的含量可能升高，側(cè)面反應(yīng)出艾灸關(guān)元穴能夠調(diào)節(jié)老齡化機(jī)體的能量代謝水平。

亞麻酸和亞油酸是人體中重要的必須脂肪酸，α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）是n-3多不飽和脂肪酸（EPA、DHA）合成前體，二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）是ALA在體內(nèi)生成二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的中間產(chǎn)物。n-3多不飽和脂肪酸被報(bào)道可以改善線粒體功能，增加心肌細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量[27]，減緩小鼠線粒體蛋白質(zhì)質(zhì)量隨年齡的下降[28]。補(bǔ)充人體必備脂肪酸被證明可上調(diào)線粒體解偶聯(lián)蛋白（UCP）的表達(dá)，保持氧化還原狀態(tài)，從而在能量代謝中起著關(guān)鍵作用[29-30]。亞油酸已被證明可以防止心磷脂含量降低并改善患有自發(fā)性高血壓心力衰竭（HF）的老年大鼠的線粒體功能[31]。細(xì)胞膜和線粒體膜的主要磷脂組分是甘油磷脂，磷脂（PL）的脂肪酸（FA）組成對(duì)線粒體膜功能有很大影響[32]，有研究表明線粒體膜的脂質(zhì)組成與線粒體在能量代謝和氧氣消耗中的作用有關(guān)[33]。本研究中結(jié)果顯示，金匱腎氣丸和艾灸關(guān)元穴可使老年大鼠腎組織中亞麻油酸、二十二碳五烯酸和亞油酰胺含量升高，推測(cè)艾灸和金匱腎氣丸可能都通過促進(jìn)亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝來提高老年大鼠腎組織能量代謝。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)老年大鼠血清腎功能、腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、線粒體耗氧速率和琥珀酸脫氫酶活力的檢測(cè)，并從代謝組學(xué)分子層面觀察艾灸關(guān)元穴對(duì)老年大鼠腎組織能量代謝的影響。其中，老年艾灸組和老年金匱腎氣丸組與老年對(duì)照大鼠相比，腎結(jié)構(gòu)狀態(tài)和腎功能指標(biāo)均無顯著性影響，說明長期艾灸補(bǔ)陽與從內(nèi)服用藥物補(bǔ)陽對(duì)老年大鼠的腎功能均無明顯損害作用。不少學(xué)者認(rèn)為，腎陽虛和機(jī)體能量代謝是密切相關(guān)的[34-36]。艾灸關(guān)元穴能夠提高老年大鼠腎組織線粒體能量代謝的功能，側(cè)面反應(yīng)出艾灸關(guān)元穴可通過溫補(bǔ)腎陽的作用促進(jìn)腎的能量代謝，這種作用可能是通過?；撬岷蛠喤；撬岽x、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝來調(diào)控的。艾灸具有治療方便、經(jīng)濟(jì)、安全，易被患者接受等特點(diǎn)，是一種有潛力的保健方法，值得進(jìn)一步發(fā)掘以發(fā)揮中醫(yī)藥在治未病中的主導(dǎo)作用。