趙佳瑩，申艷佳，楊 冉，陳 渺，李 莉，杜冠華

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶點研究與新藥篩選重點實驗室，北京 100050)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種由免疫介導(dǎo)的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎癥性脫髓鞘疾病。全世界有超過200多萬人受累[1]，它對人類身體健康造成嚴(yán)重危害，并給社會造成沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。MS的發(fā)病機制復(fù)雜，病因不明，目前不能治愈，患者需接受長期治療。MS的急性期多采用短療程大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊療法來減輕急性發(fā)作癥狀，緩解期則采用疾病修正治療(disease-modifying therapies，DMTs)控制疾病進展，因此研究MS的發(fā)病機制和防治藥物具有重要意義。目前，在防治MS藥物的臨床前研究中，常用動物模型包括實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型、毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型和病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型。近年來，β-干擾素、醋酸格拉替雷、富馬酸二甲酯、特立氟胺、那他珠單抗、達利珠單抗、米托蒽醌，以及克拉屈濱等藥物已用于MS的臨床治療，研究者在這些藥物的研發(fā)中均使用了動物模型[2]。由此可見，合理地應(yīng)用動物模型，有助于研發(fā)更具有針對性的MS防治藥物。本文將主要介紹MS的特點、病理特征、臨床分型以及三類常用動物模型的發(fā)病機制、特點和它們在藥物研發(fā)中的應(yīng)用，總結(jié)動物模型在抗MS藥物研發(fā)應(yīng)用中存在的問題并提出基本的解決策略，從而能更好地將動物模型應(yīng)用于防治MS的藥物研究。

1 多發(fā)性硬化的特點及臨床分型

1.1 MS的特點及病理特征MS以炎癥和大腦、脊髓和視神經(jīng)出現(xiàn)脫髓鞘病變?yōu)橹饕±硖卣鱗1]。其臨床表現(xiàn)廣泛，包括肌肉無力、感覺障礙、認(rèn)知功能障礙和疲勞等[3]。世界各地MS的發(fā)病率各不相同，在西方國家，其發(fā)病率為1/1 000；而在亞洲，每10萬人中有2例患者[3]。盡管如此，MS的臨床癥狀復(fù)雜多變，緩解與復(fù)發(fā)交替進行，嚴(yán)重影響了患者的生活和生命質(zhì)量。

MS被認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，主要由自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞通過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)進入CNS導(dǎo)致。同時，MS的發(fā)生與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)，基因分析發(fā)現(xiàn)，EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是MS的重要環(huán)境誘因，且人類白細(xì)胞抗原(HLA)-DRB1*15:01等位基因在很大程度上決定了MS的CNS特異性[4]。MS的早期病變表現(xiàn)為周圍免疫細(xì)胞浸潤和BBB滲漏。細(xì)胞浸潤以巨噬細(xì)胞為主，CD8+T細(xì)胞次之，CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量相對較少[4]。T細(xì)胞的組成并未隨疾病的發(fā)展而改變，但B細(xì)胞和漿細(xì)胞的相對比例增加。小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在整個疾病過程中保持慢性激活的狀態(tài)，形成髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失的斑塊[4]。隨疾病進展，患者大腦出現(xiàn)局灶性白質(zhì)病變，大腦和脊髓損傷不明顯，但腦萎縮普遍出現(xiàn)，腦萎縮伴隨腦室增大，星形膠質(zhì)細(xì)胞在白質(zhì)病變中形成多發(fā)硬化性膠質(zhì)瘢痕，在大腦皮質(zhì)、核和脊髓的灰質(zhì)中也會發(fā)生脫髓鞘，但白質(zhì)的脫髓鞘區(qū)域可以通過髓鞘再生得到部分修復(fù)；此外，疾病過程不僅影響髓磷脂，還會導(dǎo)致軸突和神經(jīng)元出現(xiàn)退行性病變，從而造成患者出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的殘疾[4]。

MS具有易復(fù)發(fā)的特點，其復(fù)發(fā)由炎癥細(xì)胞浸潤引起，這些炎癥細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。它們與CNS中的膠質(zhì)細(xì)胞共同作用導(dǎo)致炎癥、脫髓鞘和神經(jīng)退行性變，并引起可溶性介質(zhì)的分泌和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。在MS疾病后期，特別是疾病進展期，進入CNS的免疫細(xì)胞浸潤減少，但CNS內(nèi)的炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，則進一步造成少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失和神經(jīng)-軸突變性[3]，并因此而導(dǎo)致MS的復(fù)發(fā)。

1.2 MS的臨床分型1996年，美國國家多發(fā)性硬化癥協(xié)會(National Multiple Sclerosis Society，NMSS)依據(jù)MS患者最常見臨床病程，將MS臨床表型分為復(fù)發(fā)性緩解型(relapsing-remitting MS，RRMS)、原發(fā)性進展型(primary progressive MS，PPMS)、繼發(fā)性進展型(secondary-progressive MS，SPMS)和進行性復(fù)發(fā)型(progressive relapsing MS，PRMS)四種類型。2012年，NMSS結(jié)合改進的臨床描述性術(shù)語、磁共振成像技術(shù)、液體生物標(biāo)志物分析，以及包括神經(jīng)生理學(xué)在內(nèi)的其他檢測分析方法，建議維持1996年對MS基本表型的描述，并提出了臨床孤立綜合征(clinically isolated syndrome，CIS)和放射學(xué)孤立綜合征(radiologically isolated syndrome，RIS)兩種新的疾病類型[5]。其中，CIS和RIS發(fā)生，提示后續(xù)發(fā)展為MS的可能性較大[5]。

2 MS動物模型的特點及應(yīng)用

準(zhǔn)確區(qū)分MS的臨床表型，能夠為其臨床試驗的開展以及治療策略的制定提供極大的幫助。因此，研究人員根據(jù)其研究的MS不同的臨床表型，采用特定的動物模型進行臨床前研究，將有利于認(rèn)識MS的病理過程，研發(fā)出更具有針對性的治療藥物。目前，用于研究MS的動物模型主要分為EAE模型，毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型和病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型三種，以EAE模型應(yīng)用最為廣泛。

2.1 EAE模型

2.1.1EAE模型發(fā)病機制 EAE是一種由特異性抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)進而引起的CNS炎癥性疾病。誘導(dǎo)EAE產(chǎn)生的方法主要有兩種：使用中樞神經(jīng)肽對動物的敏感品系進行主動免疫，及采用致腦炎T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移進行被動免疫[2]。將髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白 (proteolipid protein，PLP)、脊髓勻漿、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)等髓磷脂相關(guān)抗原或肽在完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)中乳化后進行皮下注射可誘導(dǎo)產(chǎn)生主動免疫的EAE[1-2]。其中，CFA為添加熱滅活結(jié)核分枝桿菌的礦物油佐劑，可促進外周Th1型免疫應(yīng)答，增加BBB的通透性，從而提高誘導(dǎo)效率[1-2]。在免疫當(dāng)天和第48 h注射百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)，可通過破壞BBB的完整性使免疫細(xì)胞進入CNS，促進T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，打破T細(xì)胞的免疫耐受[1-2]，從而促進EAE的誘導(dǎo)。此外，將從注射髓磷脂抗原的小鼠中分離出的T細(xì)胞或在體外髓鞘相關(guān)抗原存在條件下激活的na?ve T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到na?ve小鼠中，可誘導(dǎo)形成被動免疫的EAE模型[6]。

主動免疫和被動免疫均會導(dǎo)致髓磷脂抗原特異性T細(xì)胞激活，被激活的T細(xì)胞隨后增殖并分化為效應(yīng)T細(xì)胞，以髓鞘特異性CD4+T細(xì)胞為主[1-2]。效應(yīng)T細(xì)胞能夠通過傳出淋巴管從次級淋巴器官排出并進入血液循環(huán)，分泌粘附分子、細(xì)胞因子和趨化因子及其受體導(dǎo)致BBB破壞解體，從而進入CNS[1]。在CNS內(nèi)，效應(yīng)T細(xì)胞識別小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)表面的抗原后會被重新激活，APC通過不斷激活效應(yīng)T細(xì)胞和招募其他細(xì)胞來放大炎癥反應(yīng)，分泌促炎因子，如干擾素-γ、白細(xì)胞介素-17、腫瘤壞死因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，并吸引大量效應(yīng)T細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，導(dǎo)致組織損傷[1-2]；同時，這些細(xì)胞會攻擊產(chǎn)生髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞并使其變性，破壞病變部位的髓鞘，導(dǎo)致局灶性脫髓鞘和軸突損傷[6]。在此過程中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也被招募到CNS內(nèi)參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[1]。因此，動物表現(xiàn)為上升性麻痹的肢體癥狀，從尾部無力開始，接著是后肢麻痹，繼而發(fā)展為上肢癱瘓[2]。

2.1.2EAE模型特點 EAE模型是目前研究最多的MS動物模型之一，具備MS的組織病理學(xué)和免疫學(xué)方面的特征[1]。多種動物經(jīng)誘導(dǎo)后均可形成EAE模型，各具特點并對應(yīng)MS特定的臨床表型。

小鼠因其價格較低且適合進行轉(zhuǎn)基因研究，是EAE研究中最常用的動物物種[2]。目前，C57BL/6小鼠為MS研究中最常應(yīng)用的小鼠品系。C57BL/6小鼠經(jīng)MOG35-55誘導(dǎo)可發(fā)生EAE，該模型呈進展性病程，沒有復(fù)發(fā)期，CD4+T細(xì)胞為主要與MS相關(guān)的T細(xì)胞，且脊髓病變程度較大腦更為嚴(yán)重[7]，對應(yīng)臨床表現(xiàn)為慢性進行性疾病[8]。研究人員應(yīng)用PLP139-151誘導(dǎo)SJL小鼠也可產(chǎn)生EAE，該動物模型出現(xiàn)小鼠癱瘓的復(fù)發(fā)-緩解過程，可用于復(fù)發(fā)性自身免疫性疾病的機制研究或免疫調(diào)節(jié)的研究[8]。Biozzi ABH小鼠經(jīng)脊髓勻漿誘導(dǎo)可產(chǎn)生晚期慢性EAE，該模型可再現(xiàn)MS病程中的復(fù)發(fā)-進展階段，適合用于研究DMTs和神經(jīng)再生療法[9]。此外，研究人員采用MOG誘導(dǎo)非肥胖糖尿病小鼠可發(fā)展為原發(fā)性進展性EAE，可從免疫學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)角度對其進行MS藥效學(xué)和機制探究[10]。

近年來，大鼠對低劑量抗原肽具有高度敏感性，可再現(xiàn)嚴(yán)重的癱瘓疾病，并且具備極大的基因改造潛力，因此，大鼠EAE模型被越來越多地用于MS相關(guān)的實驗研究，其中以Lewis大鼠應(yīng)用最為廣泛[11]。采用豚鼠MBP或在改良的完全弗氏佐劑中乳化MBP68-88可誘導(dǎo)近交Lewis大鼠產(chǎn)生EAE的經(jīng)典模型[11]。Lewis大鼠的EAE模型表現(xiàn)為急性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的上肢麻痹，在免疫后11 d開始出現(xiàn)臨床癥狀，于免疫后15～20 d進入疾病恢復(fù)期，這種自發(fā)緩解的單相病程與MS的進展期和(完全)緩解期相似[11]。

隨著科學(xué)研究的不斷進步，越來越多的動物種類在MS的研究中得以應(yīng)用。MS的斑馬魚模型能產(chǎn)生大量胚胎，易于進行遺傳操作，可作為研究神經(jīng)疾病和高通量篩選的良好模型[2]。在非人類靈長類動物中，采用MOG誘導(dǎo)絨猴可發(fā)生慢性復(fù)發(fā)-緩解型或嚴(yán)重進行性的EAE模型[12]。此外，研究人員采用章魚作為實驗動物建立EAE模型，有助于拓展人類對MS先天性免疫系統(tǒng)的功能、患者肢體的自主性機制和神經(jīng)可塑性方面的認(rèn)識[13]。

由此可見，動物EAE模型的病理生理表現(xiàn)多樣，對應(yīng)MS不同的臨床表型；各種模型的臨床表現(xiàn)也因動物種類、品系、誘導(dǎo)模型所用的蛋白多肽和免疫途徑的差異而不同。不同動物模型可用于研究MS中特定病理階段的組織病理學(xué)特征，并分析其潛在的病理機制和與之對應(yīng)的治療策略。

2.1.3EAE模型與藥物研發(fā) 多種嚙齒動物和非人靈長類動物的EAE模型對我們了解MS中自身免疫和神經(jīng)炎癥方面的機制具有重要貢獻，已成為開發(fā)新的MS治療方法的重要工具。

首先，多種免疫抗原和動物敏感品系為科學(xué)家探索MS中RRMS、SPMS和PPMS等多種臨床表型提供了機會[12]。這也提示我們，針對MS的病程特點和臨床分型進行藥物研究，可開發(fā)出更有針對性的藥物，從而為MS的治愈提供可能。運用對應(yīng)不同MS臨床表型的EAE模型進行實驗研究，可以更好地解析MS發(fā)病時CNS自身免疫的機制，且在驗證DMTs藥物的療效方面也具有非常高的應(yīng)用價值。迄今為止，EAE模型已經(jīng)成為MS治療藥物研發(fā)的必要工具模型，至少7種經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于治療MS的免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)過程中均使用了EAE模型，如醋酸格拉替雷(glatiramer acetate，GA)、芬戈莫德和那他珠單抗等[12]，而這些藥物的適應(yīng)癥大都對應(yīng)了MS特定的臨床表型。

其次，EAE模型對于研究藥物調(diào)控T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫機制具有十分重要的作用。以GA為例，在EAE模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)GA可增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和B細(xì)胞的表達，下調(diào)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達，從而拓展了我們對GA治療MS的免疫學(xué)調(diào)節(jié)機制的認(rèn)識[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)魯索替尼可通過抑制Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相互作用，改善EAE的嚴(yán)重程度，調(diào)節(jié)JAK2和STAT3信號通路，可作為防治MS的候選藥物[15]。最近，低劑量皮下抗CD20的B細(xì)胞調(diào)節(jié)療法在EAE模型中得到驗證，該療法可有效靶向疾病相關(guān)的B細(xì)胞群，并可維持免疫應(yīng)答，從而在不嚴(yán)重影響免疫監(jiān)視功能的情況下實現(xiàn)自身免疫的改善[16]。

近年來，EAE模型應(yīng)用于MS新藥研發(fā)及藥效機制研究也獲得突破性進展。Ozanimod屬于鞘氨醇-1-磷酸受體(sphingosine-1 phosphate receptors，S1PR)調(diào)節(jié)家族，最近已在不同國家被批準(zhǔn)用于MS的疾病活動期治療，其抗炎和神經(jīng)保護等作用均在EAE動物模型的研究中獲得證實[17]。

2.2 毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型

2.2.1毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型發(fā)病機制及其特點 促進髓鞘再生是MS防治策略中神經(jīng)保護的關(guān)鍵和對抗進展型MS的主要防線，毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型是MS研究中最重要的工具之一。局部注射溶血卵磷脂和溴化乙錠以及口服雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ)是最常用于誘導(dǎo)動物脫髓鞘的三種毒素[18]。

溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholines，LPCs)是一種磷脂酶A2的激活劑，在貓、兔、大鼠和小鼠等動物脊髓白質(zhì)中局部注射可誘導(dǎo)局灶性脫髓鞘[19]。LPCs對形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞具有特異性毒性，可特異性地破壞髓磷脂，導(dǎo)致髓磷脂片層融合，髓磷脂片層轉(zhuǎn)化為球狀泡并逐漸縮小，最終被吞噬[2]。因此，該模型并非由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)[19]，其病理特征包括巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，軸突損傷以及少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)增殖或遷移[2]。其中，LPCs誘導(dǎo)動物脫髓鞘導(dǎo)致的軸突損傷較其他毒素更為明顯[18]。動物注射LPCs 23 d后會發(fā)生自發(fā)性的髓鞘再生[2]，再生的髓鞘主要由OPCs產(chǎn)生的新生少突膠質(zhì)細(xì)胞形成[18]，由此可知，該模型可用于研究髓鞘再生的復(fù)雜機制[2]。

在大腦白質(zhì)束局部注射溴化乙錠(ethidium bromide，EB)可誘導(dǎo)動物的脫髓鞘和髓鞘再生。EB是一種能插入雙鏈DNA堿基對之間的平面分子，可抑制DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，且對病變區(qū)域的所有細(xì)胞都具有毒性[18]。局部注射EB后可導(dǎo)致病變區(qū)的少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和OPCs均發(fā)生退化，但細(xì)胞核遠(yuǎn)端的軸突不受影響[18, 20]。可能由于OPCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞死亡，局部注射EB形成的病變面積往往更大，且髓鞘再生更慢[18]。該模型的優(yōu)點為可預(yù)測脫髓鞘的位置，并且可根據(jù)注射EB的濃度確定脫髓鞘病變的面積[1]。此外，研究人員對EB和LPCs誘導(dǎo)的脫髓鞘模型病變進行比較，可分別研究星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在髓鞘再生中的作用[18]。

CPZ是一種銅離子螯合劑，可通過氧化損傷機制引起少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)脫髓鞘發(fā)生[20]。使用0.2% CPZ飼養(yǎng)5～6周可誘導(dǎo)小鼠易感品系產(chǎn)生CPZ模型，以C57BL/6小鼠最為常用[12]。該模型會導(dǎo)致小鼠灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)廣泛脫髓鞘，尤其是胼胝體區(qū)域和小腦上腳，但其脊髓不受影響，BBB仍保持完整[12]。在CPZ誘導(dǎo)的組織損傷中，脫髓鞘和髓鞘再生與MS病變進展一致，并表現(xiàn)出類似的損傷和修復(fù)特征[7]。目前，CPZ模型已被作為研究脫髓鞘的基礎(chǔ)生物學(xué)模型進行廣泛應(yīng)用[20]。

2.2.2毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型與藥物研發(fā) 毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型在藥物的研發(fā)過程中各有其獨特應(yīng)用，以藥物對于MS中脫髓鞘及髓鞘再生的保護作用為主要應(yīng)用方向，體現(xiàn)在以下幾個方面：首先，LPCs對少突膠質(zhì)細(xì)胞具有較高的選擇性，也可用于器官型切片培養(yǎng)中脫髓鞘和髓鞘再生的研究[18]，例如，西尼莫德是S1PR 1和S1PR 5的雙重激動劑，該藥物目前正在進行治療SPMS的臨床試驗。研究人員將10日齡小鼠的小腦制備成器官型切片培養(yǎng)物，并用LPCs處理，發(fā)現(xiàn)西尼莫德可降低LPC誘導(dǎo)的IL-6水平升高并減輕脫髓鞘病變[21]；其次，研究人員運用EB誘導(dǎo)大鼠脫髓鞘，證實了Guggulsterone可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平，改善炎癥因子水平和氧化應(yīng)激，防止細(xì)胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護作用[22]；此外，CPZ小鼠模型可廣泛應(yīng)用于研究與藥物相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞遷移和分化的具體機制等[2]。

2.3 病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型

2.3.1病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型特點 病毒感染CNS可以誘發(fā)小鼠脫髓鞘，其脫髓鞘通常發(fā)生在腦部炎癥消退之后[7]。目前，以慢性脫髓鞘和軸突損傷為病變特征的動物模型已被用于研究病毒在MS病理進程中發(fā)揮的作用，并已取得了重要突破[12]，Theiler氏小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler′s murine encephalomyelitis virus，TMEV)模型是其中最常用的模型之一。

TMEV是屬于小核糖核酸家族中心臟病毒屬中的一種無包膜的單鏈RNA病毒[1]。SJL小鼠腦內(nèi)感染BeAn毒株所形成的TMEV脫髓鞘模型應(yīng)用最為廣泛[12]。小鼠約在感染TMEV后3～12 d進入疾病的早期急性期，以大腦灰質(zhì)內(nèi)發(fā)生強烈的多發(fā)性炎癥、神經(jīng)元內(nèi)病毒快速復(fù)制和神經(jīng)元凋亡為主要特征[1]。這種廣泛的炎癥由病毒特異性CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等共同引起，主要在大腦皮質(zhì)下灰質(zhì)、海馬和基底神經(jīng)節(jié)發(fā)生，而脊髓部位的炎癥并不明顯，僅局限于脊髓灰質(zhì)前角[1]。在急性期，軸突損傷先于脫髓鞘發(fā)生;這種由內(nèi)到外的脫髓鞘為TMEV模型的特征之一[1]。慢性期通常在感染后約30 d出現(xiàn)，表現(xiàn)為炎性脫髓鞘，并伴有功能缺陷，如共濟失調(diào)和痙攣性麻痹[1]。病毒誘導(dǎo)發(fā)生脫髓鞘的病理特征一般由免疫系統(tǒng)激活介導(dǎo)，而不是由病毒對靶細(xì)胞的直接毒性作用介導(dǎo)[19]。TMEV誘導(dǎo)的脫髓鞘模型與MS具有相似的病理特征，因此可用于模擬MS慢性的原發(fā)性進展型病程[12]。此外，TMEV模型與EAE模型的不同之處在于，EAE可在多種不同物種中誘導(dǎo)，而TMEV僅可在小鼠中誘導(dǎo)炎癥性脫髓鞘疾病，不會引起人類的病理反應(yīng)[12]。

2.3.2病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型與藥物研發(fā) 病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型產(chǎn)生的病理特征與人類MS具有明顯的相似之處，能模擬CNS中病毒感染引發(fā)的自身免疫反應(yīng)，在藥物研發(fā)中具有極大應(yīng)用潛力，主要體現(xiàn)在以下幾點：首先，應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型進行MS相關(guān)研究，可以明確炎癥性脫髓鞘的機制，即抗病毒和自身免疫反應(yīng)如何在誘導(dǎo)炎癥性脫髓鞘病變中發(fā)揮作用[20]；其次，TMEV誘導(dǎo)的動物模型可用于研究MS原發(fā)性進展型疾病[12]。通過評估聚乙二醇-干擾素治療對感染TMEV的小鼠髓鞘內(nèi)的抗體反應(yīng)、疾病進展和CNS內(nèi)病毒承載量的影響，研究人員發(fā)現(xiàn)聚乙二醇-干擾素在CNS中缺乏直接的抗病毒活性，對髓鞘內(nèi)免疫反應(yīng)沒有任何影響，因此不能用于治療MS原發(fā)性進展型疾病[23]；此外，TMEV模型亦可用于驗證新的藥物治療方法，特別是針對粘附分子、軸突變性和免疫抑制的治療。利用MS的TEMV病毒模型，研究人員證明大麻二酚的氨基醌衍生物VCE-004.8可預(yù)防脫髓鞘、軸突損傷和免疫細(xì)胞浸潤；此外，VCE-004.8能下調(diào)與MS病理生理密切相關(guān)基因的表達，這些基因與產(chǎn)生趨化因子、細(xì)胞因子和粘附分子相關(guān)[24]。

2.4 其他模型除以上三類常用動物模型外，轉(zhuǎn)基因小鼠等其他動物模型亦可用于MS的臨床前研究，其發(fā)病機制除炎癥和脫髓鞘外，與免疫相關(guān)因子介導(dǎo)的免疫機制直接相關(guān)，具有廣闊的應(yīng)用價值和應(yīng)用前景。

首先，從SJL或C57BL/6小鼠體內(nèi)可分離出致腦炎髓磷脂抗原特異性的T淋巴細(xì)胞系進行過繼轉(zhuǎn)移，可以被動免疫的方式誘導(dǎo)EAE模型建立[25]。目前，T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)轉(zhuǎn)基因小鼠可用于研究CNS中自身免疫反應(yīng)起始階段的免疫機制[26]。MOG免疫缺陷小鼠只能誘發(fā)急性EAE，而不會出現(xiàn)慢性復(fù)發(fā)性的EAE，從而闡明了慢性EAE的形成需要MOG自身免疫介導(dǎo)[27]。在小鼠CNS中，研究人員敲除或過表達細(xì)胞因子或趨化因子相關(guān)基因可用于研究它們在MS和EAE免疫應(yīng)答中的細(xì)胞招募和病理機制[27]。同時，研究者利用Cre loxP重組酶系統(tǒng)條件性敲除小鼠某基因可深入探討該基因在MS疾病發(fā)展過程中的作用，對于發(fā)現(xiàn)治療MS的潛在靶點具有重要意義[27]，例如，在CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR 5)基因敲除的小鼠EAE模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)CCR 5基因缺失通過抑制炎癥反應(yīng)抑制了脫髓鞘的發(fā)生，這些發(fā)現(xiàn)表明，CCR 5可能參與脊髓脫髓鞘的MS發(fā)展，可以作為MS的治療靶點，臨床可利用CCR 5抑制劑作為MS的治療藥物[28]。此外，研究人員使用成年Sprague Dawley雄性大鼠建立實驗性Ⅲ型脫髓鞘損傷模型，可評估尼莫地平對于MS早期病變中脊髓脫髓鞘程度的作用[29]。

3 MS動物模型應(yīng)用于藥物研發(fā)中存在的問題及解決策略

MS的動物模型在闡明MS的病理機制和藥物研究方面具有極大的應(yīng)用價值，但科研人員在應(yīng)用各種動物模型時也存在不足之處。研究者唯有認(rèn)識到其中存在的問題，才能有針對性的改進研究方法，從而更好地服務(wù)于MS領(lǐng)域的科學(xué)研究。

3.1 存在的問題

3.1.1動物模型無法完全模擬人類疾病進程 動物模型僅能夠體現(xiàn)MS疾病的特定方面，其本身的病理變化與人類MS的疾病進程不完全吻合，無法完全模擬人類MS的疾病進程。例如，利用動物實驗?zāi)Ｐ蜕胁荒芡耆U明MS的病理過程和關(guān)鍵發(fā)病機制，包括CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的作用，以及MS進展期脫髓鞘和組織損傷的機制等[20]。

不同的EAE模型在病理和免疫學(xué)方面存在差異，且大多數(shù)EAE模型由CD4+T細(xì)胞激活而誘導(dǎo)建立，而用于研究CD8+T細(xì)胞作用的EAE模型較少[19]。此外，EAE主要是一種影響脊髓白質(zhì)的疾病，而MS主要是一種大腦和小腦皮質(zhì)明顯病變的腦部疾病，分析腦皮質(zhì)在EAE中的作用的相關(guān)研究較少，且與髓鞘再生相關(guān)的研究在EAE模型中也較難開展[19]。

毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型為研究脫髓鞘的有效模型，但用于研究髓鞘再生過程時會受到一定程度的限制，并且缺乏一定的免疫原性[1]。TMEV僅可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生炎性的脫髓鞘疾病，無法引起人類的病理變化，由此產(chǎn)生了使用非人類病原體來研究人類疾病(如MS)是否合理的問題[19]。并且，TMEV誘導(dǎo)小鼠脫髓鞘的發(fā)病機制與人類MS不完全相同，目前尚無采用病毒持續(xù)感染人類CNS的實驗研究[19]。

3.1.2動物模型的研究設(shè)計有待規(guī)范 科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性對于實驗研究至關(guān)重要，因此，研究人員應(yīng)用動物模型進行MS相關(guān)研究時需要進行科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯吭O(shè)計。以EAE模型為例，EAE模型經(jīng)常因研究設(shè)計不規(guī)范、臨床評分終點不一致和統(tǒng)計計算不恰當(dāng)?shù)纫蛩貙?dǎo)致其實驗效力降低[12]。這反映了不同的研究設(shè)計之間存在顯著的差異，提示MS相關(guān)動物模型的研究設(shè)計有待規(guī)范。對此，研究人員可以通過隨機分組、結(jié)果盲評和統(tǒng)計檢驗等方法提高實驗結(jié)論的可信度，并通過關(guān)注現(xiàn)有動物模型的優(yōu)勢和局限性來使實驗結(jié)論能夠更好的在臨床實踐中得到應(yīng)用。

3.1.3動物模型研究結(jié)果的重現(xiàn)率低 許多已在MS臨床前研究中確證具有治療療效的藥物，在進行人體臨床試驗時，治療效果往往不能得到很好的重現(xiàn)[20]。例如，他汀類的神經(jīng)保護和免疫調(diào)節(jié)作用在EAE模型中均已得到驗證，但研究人員將其應(yīng)用于RRMS患者的臨床研究時，試驗結(jié)果顯示患者腦體積分?jǐn)?shù)及擴展殘疾狀態(tài)評分、年復(fù)發(fā)率、認(rèn)知能力和磁共振成像等臨床指標(biāo)均未見改善[30]。這表明動物模型并不能完全重現(xiàn)MS的病理過程，我們需要更好地理解MS發(fā)病機制的復(fù)雜性及其在個體患者中的異質(zhì)性。

3.2 解決策略針對目前MS動物模型中存在的問題，相應(yīng)的解決策略如下：首先，由于多數(shù)MS動物模型的研究無法完全模擬疾病進程，研究人員必須突出模型的機制和癥狀特點，從不同側(cè)面反映藥物作用；運用多種不同機制的動物模型，綜合評價藥物的治療效果；運用組織病理學(xué)方法進一步細(xì)致評估，以確認(rèn)實驗結(jié)果的可靠性。其次，良好的實驗操作和規(guī)范的實驗設(shè)計是提高EAE動物研究質(zhì)量的關(guān)鍵[2]，這在其他MS動物模型研究中也同樣重要。其三，理想情況下，研究人員可在動物模型中確定適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)記物，使其便于應(yīng)用于人體研究。沒有一種動物模型能夠完全復(fù)制MS的疾病進展，從動物模型中獲得的實驗結(jié)論直接外推到人類疾病的做法是不合理的，研究者必須謹(jǐn)慎解釋藥物在動物模型中的治療效果，針對特定的臨床分型選擇更有針對性的動物模型，同時不斷探索建立新的動物模型和實驗技術(shù)以促進MS的研究，研發(fā)出更加有效的藥物和治療方法，使MS的治愈成為可能。