周英彪，陳塬星，李梅菁，龐藝明

(1.廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000；2.化州天橘化橘紅有機生物制品有限公司，廣東 化州 525100)

化橘紅是蕓香科柑橘屬植物廣東化州柚未成熟或近成熟的外層果皮或全果經(jīng)加工制成的名貴中藥材，具有化痰、理氣、健胃消食的作用，臨床用于治療風(fēng)寒咳嗽、喉癢痰多、食積酒傷等癥，有“南方人參”之稱，是“中國四大南藥”和“十大廣藥”之一[1,2]。

廣東化州市的化橘紅種質(zhì)資源經(jīng)過漫長人工栽培，已選育出不少性能優(yōu)良的栽培品種，其中“密葉金毛”是從傳統(tǒng)正毛化橘紅植株的變異枝條，進行無性繁殖得到的新品種(品系)，目前已有一些企業(yè)在種植，種植期間其產(chǎn)量及藥效表現(xiàn)良好，值得進行規(guī)?；茝V種植[3]。但目前對“密葉金毛”這個有優(yōu)良潛能化橘紅新品種(品系)的性狀、物候和生理等的研究報道較少。

指紋圖譜技術(shù)已成為國內(nèi)外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的有效手段，可實現(xiàn)對中藥內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和整體物質(zhì)的全面控制[4]?；偌t的指紋圖譜主要有基于遺傳物質(zhì)分析的DNA指紋圖譜及基于代謝產(chǎn)物分析的化學(xué)指紋圖譜[5]。其化學(xué)指紋圖譜可運用紅外色譜、氣相色譜及液相色譜等色譜技術(shù)建立[6-8]。其中，高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點，為國內(nèi)外廣泛接受。

化橘紅含有多糖、黃酮、香豆素及金屬微量元素等成分，其中黃酮類和香豆素類成分的HPLC分析常用于構(gòu)建化橘紅的化學(xué)指紋圖譜[9]?；贖PLC的指紋圖譜技術(shù)在化橘紅不同栽培品種選育及其栽培過程管理中，具有良好的應(yīng)用前景及重要的指導(dǎo)意義[10,11]。因此，本研究中，擬對化橘紅“密葉金毛”一年生產(chǎn)周期中，各個物候期樣本中香豆素類物質(zhì)進行HPLC檢測分析，建立化橘紅“密葉金毛”的花蕾、盛花、幼果及成果的HPLC 指紋圖譜。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植株的花蕾、盛花、幼果及成果樣本，采自廣東化州天橘化橘紅有機生物制品有限公司化橘紅種植基地；標(biāo)準(zhǔn)品羥甲香豆素、歐前胡素、異歐前胡素與呋喃香豆素(均為色譜純，中國藥品生物制品檢定所)；標(biāo)準(zhǔn)品香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素與香檸檬亭(均為色譜純，美國 Sigma 公司)；標(biāo)準(zhǔn)品佛手內(nèi)酯(色譜純，上海友思生物技術(shù)有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，德國Merck公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(BP211D型，德國Sartorius公司)；高效液相色譜儀(1100型，美國Agilent公司)配Agilent化學(xué)工作站、DAD檢測器與自動進樣器；反相色譜柱(Nucleosil C18，德國Macherey-Nagel公司)。

1.3 方法

1)樣品的采集和處理。按照中藥指紋圖譜的繪制方法，樣品的采集需要10個點以上的原則，采集廣東化州天橘化橘紅有機生物制品有限公司化橘紅種植基地內(nèi)，10株化橘紅“密葉金毛”一年生產(chǎn)周期內(nèi)的花蕾、盛花、幼果及成果樣本。各種樣本在65 ℃條件下烘干打成粉，60%以上過60目篩， 其余顆粒以直徑不大于1 mm為宜，在65 ℃烘至質(zhì)量恒定；各種樣本分別稱0.200 g置于25 mL容量瓶中，加30%的乙醇10 mL浸泡過夜，超聲波提取20 min，停止10 min，再超聲波提取20 min后，甲醇定容，靜止后取上清液經(jīng)0.5 μm的微孔膜過濾，進樣進行HPLC檢測[2,12]。

2)HPLC分析條件。樣品上高效液相色譜儀(配Agilent化學(xué)工作站、DAD檢測器與自動進樣器)分析，色譜柱為Nucleosil C18(150 mm×4.6 mm×3 μm)。流動相A為水、B為甲醇、C為乙腈，三元梯度洗脫，起始流量0.3 mL/min。梯度洗脫順序：流動相(50% B +15% C)，流量0.3 mL/min，保持15 min；流動相(50% B+ 20% C)，流量0.4 mL/min，保持2 min；流動相(50% B+30% C)，流量0.6 mL/min，保持0.5 min；流動相(50% B+30% C)，流量0.8 mL/min，保持4.5 min；流動相(50% B+45% C)，流量1 mL/min，保持2 min；流動相(50% B+50% C)，流量1 mL/min，保持3 min；流動相(50% B+50% C)，流量0.8 mL/min，保持3 min；流動相(50% B + 30% C)，流量0.6 mL/min，保持2 min；流動相(50% B+15% C)，流量0.3 mL/min，保持3 min。檢測波長315 nm，柱溫35 ℃[2, 12]。進樣量20 μL。

3)香豆素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析。以甲醇為溶劑配制10種香豆素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，混合溶液中羥甲香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、呋喃香豆素、6-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、佛手內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素以及香檸檬亭的質(zhì)量濃度分別為10.200，10.000，5.200，9.600，15.000，10.000，5.000，10.000，8.000，9.800 μg/mL[2, 12]。然后按2)中HPLC分析條件，上HPLC進行分析。

4)不同物候期樣本的HPLC檢測與指紋圖譜的建立、分析。10株化橘紅“密葉金毛”一年生產(chǎn)周期內(nèi)的花蕾、盛花、幼果及成果樣本，經(jīng)1)方法處理后，按2)中的HPLC分析條件，上HPLC進行分析。應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的操作規(guī)范》，分析不同物候期特征指紋圖譜并繪制HPLC指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析

圖1為10種香豆素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜分析圖。按保留時間的先后順序依次為羥甲香豆素(7.541 min)、香豆素(8.808 min)、7-甲氧基香豆素(9.803 min)、呋喃香豆素(10.908 min)、6-甲基香豆素(11.617 min)、5, 7-二甲氧基香豆素(13.416 min)、佛手內(nèi)酯(14.291 min)、歐前胡素(20.916 min)、異歐前胡素(22.675 min)和香檸檬亭(26.716 min)。圖1中峰形表明，10種香豆素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品得到良好分離，表明本研究的HPLC色譜條件能對香豆素類物質(zhì)實現(xiàn)有效分析，可用于后續(xù)的指紋圖譜建立研究。

圖1 10種香豆素類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析

2.2 花蕾指紋圖譜

對S1植株(圖2)以及其他9株植株花蕾樣本中的香豆素類物質(zhì)進行HPLC分析，并應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》對10株植株的花蕾樣本的HPLC圖進行比較，繪制得到化橘紅“密葉金毛”花蕾的HPLC指紋圖譜(圖3)。由圖3可知，化橘紅“密葉金毛”花蕾的HPLC指紋圖譜有9個共有峰，表明其中至少含有9種香豆素類物質(zhì)；與圖1進行比較，可以確定其中3種分別為香豆素(圖3峰2)、呋喃香豆素(圖3峰3)和異歐前胡素(圖3峰8)。 對化橘紅“密葉金毛”花蕾的HPLC指紋圖譜(圖3)的9個共有峰的保留時間進行分析，發(fā)現(xiàn)9個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差均小于0.5%(表1)；而且S2—S9花蕾的HPLC圖譜分別與S1花蕾圖譜比較，相似度均大于0.900；上述兩點表明，基于10株化橘紅“密葉金毛”花蕾樣本中香豆素類物質(zhì)分析后所建立的花蕾HPLC指紋圖譜，符合指紋圖譜要求。

表1 花蕾期指紋圖譜9個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差分析共有峰序號10株化橘紅“密葉金毛”花蕾樣品HPLC分析的共有峰保留時間/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10標(biāo)準(zhǔn)相對偏差/%18.1478.1488.1468.1458.1508.1518.1478.1468.1488.1470.17528.7968.8018.7978.8018.7968.7968.7968.7958.8018.7960.233310.87910.88110.87510.87310.87810.87910.87910.87810.87810.8790.216412.65912.65912.65912.66112.65812.65712.65612.65712.65512.6570.166514.38614.38514.39114.38514.38714.38814.38614.38614.38614.3870.168616.14216.14216.14416.13916.14416.14316.14216.14516.14516.1420.172722.23822.23822.24122.23822.23722.23622.23622.24122.24122.2380.185822.67522.67622.67522.67522.67522.67622.67822.67622.67522.6780.115926.23326.23426.23426.23326.23426.23526.23426.23526.23326.2330.075圖2 S1植株花蕾的香豆素類物質(zhì)HPLC分析圖3 化橘紅“密葉金毛”花蕾HPLC指紋圖譜

2.3 盛花指紋圖譜

對S1植株(圖4)以及其他9株植株的盛花樣本中香豆素類物質(zhì)進行HPLC分析，并應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》對10株植株的盛花樣本的HPLC圖進行比較，繪制得到化橘紅“密葉金毛”盛花的HPLC指紋圖譜(圖5)。由圖5可看出，其盛花的HPLC指紋圖譜有10個共有峰，表明化橘紅“密葉金毛”盛花中至少含有10種香豆素類物質(zhì)；對照圖1，可以確定其中4種為香豆素(圖5峰2)、呋喃香豆素(圖5峰3)、異歐前胡素(圖5峰8)和香檸檬亭(圖5峰10)。

對化橘紅“密葉金毛”盛花的HPLC指紋圖譜(圖5)的10個共有峰的保留時間進行分析，發(fā)現(xiàn)10個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差均小于0.5%(表2)；而且S2—S9盛花的HPLC分析圖分別與S1盛花分析圖比較，相似度均大于0.900；上述兩點表明，基于10株化橘紅“密葉金毛”盛花樣本中香豆素類物質(zhì)分析后所建立的盛花HPLC指紋圖譜，符合指紋圖譜要求。

表2 盛花期指紋圖譜10個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差分析共有峰序號10株化橘紅“密葉金毛”盛花樣品HPLC分析的共有峰保留時間/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10標(biāo)準(zhǔn)相對偏差/%18.1478.1468.1488.1478.1488.1488.1478.1498.1488.1480.08028.7968.7968.7968.8018.7958.7958.7958.7968.8018.7970.218310.87910.87910.87710.87910.87910.87810.87910.87810.87810.8790.067412.65912.65912.65812.65712.65812.65912.65812.65812.65912.6590.066514.38614.38614.38614.38514.38814.38614.38514.38414.38614.3870.104616.14216.14316.14416.14216.14316.14316.14216.14216.14516.1420.098722.23822.23822.23922.23522.23722.23822.23622.23622.23822.2380.119822.67522.67622.67622.67322.67522.67622.67522.67622.67822.6750.120926.23326.23326.23326.23226.23526.23326.23326.23426.23326.2350.0921026.71626.71726.71826.71726.71626.71626.71526.71726.71726.7160.081圖4 S1植株盛花樣本的香豆素類物質(zhì)HPLC分析圖5 化橘紅“密葉金毛”盛花的HPLC指紋圖譜

2.4 幼果指紋圖譜

類似地，分析了S1植株(圖6)以及其他9株植株幼果樣本中香豆素類物質(zhì)，并繪制得到化橘紅“密葉金毛”幼果的HPLC指紋圖譜(圖7)。由圖7可看出，其幼果的HPLC指紋圖譜有14個共有峰，表明化橘紅“密葉金毛”幼果中至少含有14種香豆素類物質(zhì)；對照圖1，可以確定其中4種為香豆素(圖7峰2)、呋喃香豆素(圖7峰3)、異歐前胡素(圖7峰11)和香檸檬亭(圖7峰14)。

化橘紅“密葉金毛”幼果HPLC指紋圖譜(圖7)的14個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差分析均小于0.5%(表3)；S2—S9幼果的HPLC分析圖分別與S1幼果分析圖比較，相似度均大于0.900；表明基于10株化橘紅“密葉金毛”幼果樣本中香豆素類物質(zhì)分析所建立的幼果HPLC指紋圖譜，符合指紋圖譜要求。

表3 幼果期指紋圖譜14個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差分析共有峰序號10株化橘紅“密葉金毛”幼果樣品HPLC分析的共有峰保留時間/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10標(biāo)準(zhǔn)相對偏差/%18.1468.1478.1468.1488.1478.1488.1478.1498.1488.1470.09028.7948.7968.7978.7968.7948.7958.7978.7978.7978.7970.118310.87910.88110.87910.87610.87810.87910.87910.87810.87910.8790.119412.65812.65812.65912.65812.65812.65712.65612.65712.65812.6580.078514.38914.38914.38914.38814.38914.38614.38714.38714.38814.3890.104616.14216.14316.14216.14216.14516.14616.14216.14316.14516.1420.147717.94517.94517.94517.94617.94817.94717.94517.94317.94517.9450.128819.10819.10819.10719.10819.10819.10719.10619.10519.10619.1070.100921.70321.70321.70521.70821.70321.70321.70221.70421.70321.7010.1801022.23822.23822.23722.23822.23622.23522.23922.24122.23822.2380.1541122.67522.67622.67622.67522.67722.67722.68122.67522.67522.6740.1871225.68425.68225.68325.68425.68525.68425.68525.68525.68425.6840.0891326.23326.23526.23426.23326.23526.23226.23126.23326.23326.2350.1281426.71626.71726.71826.71626.71626.71626.71526.71426.71526.7160.104圖6 S1植株幼果樣本的香豆素類物質(zhì)HPLC分析圖7 化橘紅“密葉金毛”幼果的HPLC指紋圖譜

2.5 成果指紋圖譜

類似地，分析了S1植株(圖8)以及其他9株植株成果樣本中香豆素類物質(zhì)，并繪制得到化橘紅“密葉金毛”成果的HPLC指紋圖譜(圖9)。由圖9可發(fā)現(xiàn)，其成果的HPLC指紋圖譜有17個共有峰，表明化橘紅“密葉金毛”成果中至少含有17種香豆素類物質(zhì)；對照圖1，可以確定其中4種為香豆素(圖9峰2)、呋喃香豆素(圖9峰3)、異歐前胡素(圖7峰12)和香檸檬亭(圖7峰17)。

表4 成果期指紋圖譜17個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差分析共有峰序號10株化橘紅“密葉金毛”成果樣品HPLC分析的共有峰保留時間/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10標(biāo)準(zhǔn)相對偏差/%18.1468.1488.1528.1498.1538.1508.1548.1488.1518.1490.23728.7948.8028.7958.8038.7958.7948.7968.7948.8028.8010.367310.87910.8810.87610.87310.87910.87310.88310.88210.88210.8780.338412.65812.6612.65812.6612.65912.65612.65412.65812.65412.6580.206514.38914.38614.39214.38214.3914.38714.38614.38814.38714.3860.257616.14216.14416.14516.13816.14616.14516.14716.14816.14216.1470.287717.43617.43817.43617.44117.43917.44017.43817.43617.43917.4350.188817.94517.94317.94617.94817.95017.94817.94917.94617.94717.9460.194919.10819.11019.10619.11219.10619.10819.11219.11519.11219.1080.2831021.70321.70521.70621.70821.69521.69521.70621.70021.70621.7080.4661122.23822.23622.24222.23622.23822.23422.24622.24322.24522.2340.42421222.67522.67522.67222.67422.67622.67822.6822.67822.6822.6820.2971323.16723.16523.16823.15923.16423.16623.16523.16923.16423.1650.2601423.84223.84023.83823.84623.83823.84823.83623.8423.84223.8460.3771525.68425.68025.68225.68225.68625.68725.67825.67525.67925.6820.3471626.23326.23326.23226.2326.23726.23426.23826.23826.23526.2380.2711726.71626.71826.72026.72326.71226.71526.71626.71826.71626.7150.288圖8 S1植株成果樣本的香豆素類物質(zhì)HPLC分析圖9 化橘紅“密葉金毛”成果的HPLC指紋圖譜

化橘紅“密葉金毛”成果HPLC指紋圖譜(圖9)的17個共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差分析均小于0.5%(表4)；S2—S9成果的HPLC分析圖分別與S1成果分析圖比較，相似度均大于0.900；表明基于10株化橘紅“密葉金毛”成果樣本中香豆素類物質(zhì)分析所建立的成果HPLC指紋圖譜，符合指紋圖譜要求。

3 結(jié)論

本研究基于HPLC技術(shù)，對化橘紅“密葉金毛”花蕾、盛花、幼果與成果等物候期樣本中香豆素類化學(xué)物進行了分析，建立了化橘紅“密葉金毛”花蕾、盛花、幼果與成果等物候期的指紋圖譜。所建立的各個指紋圖譜共有峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)相對偏差均小于0.5%，且10個樣品間的HPLC分析圖比較相似度均大于0.900，均符合指紋圖譜要求。而且發(fā)現(xiàn)，化橘紅“密葉金毛”花蕾、盛花、幼果與成果中的香豆素類化學(xué)物的種類與含量呈有規(guī)律的動態(tài)變化，因此所建立的化橘紅“密葉金毛”HPLC指紋圖譜，可以應(yīng)用于化橘紅“密葉金毛”栽培種植過程中進行質(zhì)量監(jiān)測，以保障化橘紅“密葉金毛”的栽培種植質(zhì)量。