劉明月，張洋銘，黃 鑫，成子碩，郭保霖，武勝昔，楊彥玲

(1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，陜西 延安 716099；2空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

睡眠不足是當(dāng)今社會(huì)普遍存在的公共衛(wèi)生問題，長期睡眠不足導(dǎo)致癌癥、猝死、心血管等疾病[1]的發(fā)生率顯著增高，同時(shí)也會(huì)引發(fā)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力受損、焦慮抑郁情緒異常等。這些嚴(yán)重地影響人類的生活質(zhì)量和工作效率，同時(shí)降低社會(huì)的生產(chǎn)效率。然而，目前睡眠不足導(dǎo)致相關(guān)行為異常的機(jī)制尚不清晰。既往研究發(fā)現(xiàn)6 h睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)誘發(fā)小鼠前額葉皮層小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨鹭?fù)性情緒發(fā)生[2]，然而其是否同樣介導(dǎo)長時(shí)程SD誘發(fā)的行為異常仍不清楚。因此，建立長時(shí)程SD模型、闡明其誘發(fā)的相關(guān)高級腦功能改變、探究關(guān)鍵腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的改變對于理解SD和找尋潛在的干預(yù)靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義。

在本研究中，我們成功構(gòu)建了72 h SD小鼠模型，通過高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測SD在焦慮行為表型以及認(rèn)知記憶中產(chǎn)生的負(fù)面影響[3]，進(jìn)一步利用免疫組化染色結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析的方式探究小膠質(zhì)細(xì)胞在該過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性C57小鼠(20～25 g)16只，每4～6只一籠飼養(yǎng)于特定的無病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，控制溫度為22～24 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境保持12 h晝夜節(jié)律。本研究由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號：IACUC-20211053)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》(國家衛(wèi)生研究院出版物第80～123號，1996年修訂)進(jìn)行，將小鼠隨機(jī)分為SD組和對照組，每組8只。

實(shí)驗(yàn)儀器：恒冷冰凍切片機(jī)(Lecia CM3050S，德國)；改良多平臺(tái)SD平臺(tái)(實(shí)驗(yàn)室定制)；曠場(實(shí)驗(yàn)室定制)；高架十字迷宮(實(shí)驗(yàn)室定制)；共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000，日本)；行為視頻分析軟件(Panlab SMART 3.0，西班牙)。

1.2 方法

1.2.1 SD動(dòng)物模型的建立 SD動(dòng)物模型構(gòu)建采用改良多平臺(tái)SD法SD裝置[4]，SD裝置是一個(gè)大小為25 cm×35 cm×16 cm的聚丙烯材質(zhì)水槽，內(nèi)置12根間距相同，直徑為3 cm、高度為5 cm的木質(zhì)圓柱，水槽內(nèi)注有24 ℃溫水，水平面在圓柱頂端下1 cm處。小鼠能夠在圓柱平臺(tái)之間自由行動(dòng)，但無法橫跨趴在兩根圓柱之間休息，當(dāng)小鼠進(jìn)入快速眼動(dòng)睡眠時(shí)，由于四肢肌肉松弛，肌張力降低而觸水或落入水中被喚醒，使之保持清醒狀態(tài)。SD過程中小鼠能夠自由地從裝置頂端攝取水和食物。在本實(shí)驗(yàn)中，SD組小鼠從第1日上午08∶30至第3日上午08∶30進(jìn)行SD。實(shí)驗(yàn)過程中每日更換2次裝置內(nèi)的水以保持水質(zhì)清潔。對照組小鼠置于沒有水的相同裝置。SD結(jié)束后，用吸水紙巾輕輕擦去小鼠身上的水跡，進(jìn)行后續(xù)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物行為學(xué)檢測

1.2.2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析 將小鼠提前4 h放入實(shí)驗(yàn)等待區(qū)適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)區(qū)與外界隔音，光照均勻，亮度為20 lx，環(huán)境溫度維持在(22.0±0.5) ℃。實(shí)驗(yàn)裝置由兩個(gè)開放臂(25 cm×8 cm×12 cm)和兩個(gè)封閉臂(25 cm×8 cm×12 cm)組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)輕柔地將小鼠從飼養(yǎng)籠子中取出，放入高架十字中心區(qū)域，確保小鼠頭部朝向開放臂的方向。釋放小鼠同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，視頻錄制5 min[5]。每只小鼠測試結(jié)束后清理糞便、尿液后使用750 mL/L乙醇去除氣味，待實(shí)驗(yàn)設(shè)備完全干燥后進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持環(huán)境安靜。采用頭-體-尾三點(diǎn)法分析小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，使用SMART 3.0統(tǒng)計(jì)開臂進(jìn)入次數(shù)、開臂滯留時(shí)間。

1.2.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析 曠場實(shí)驗(yàn)在一個(gè)空曠的正方形箱體(50 cm×50 cm×50 cm)中進(jìn)行。測試開始時(shí)，將每只小鼠放置在角落中，并通過位于曠場上方的攝像機(jī)記錄5 min[6]。每次實(shí)驗(yàn)后，用750 mL/L乙醇清理小鼠排泄物，擦洗曠場內(nèi)壁及縫隙。用SMART 3.0統(tǒng)計(jì)分析小鼠進(jìn)入曠場中心區(qū)域的次數(shù)、在中心區(qū)探索滯留花費(fèi)的時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)的總距離。曠場的中心面積為總面積的25%(約25 cm×25 cm的正方形)。

1.2.2.3 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析 72 h SD后，我們對小鼠進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。將兩個(gè)相同但對于小鼠完全陌生的物塊放至距正方形箱體測內(nèi)壁10 cm處[7]。物塊在放入前用750 mL/L乙醇噴洗干凈并晾干。實(shí)驗(yàn)包括適應(yīng)、學(xué)習(xí)和測試三個(gè)階段。適應(yīng)階段將小鼠放入曠場中對曠場的環(huán)境進(jìn)行5 min的適應(yīng)；學(xué)習(xí)階段讓小鼠對兩個(gè)形狀以及顏色相同的物塊進(jìn)行10 min的學(xué)習(xí)；測試階段將學(xué)習(xí)階段的一個(gè)物塊用形狀、顏色均不相同的新物塊進(jìn)行替代。實(shí)驗(yàn)在20∶00～23∶00區(qū)間(夜晚周期)進(jìn)行，輕柔地將小鼠放置在曠場的一角后開始錄制。利用SMART 3.0軟件分析小鼠對物塊探索時(shí)間。

1.2.3 組織處理及免疫熒光染色

1.2.3.1 動(dòng)物組織獲取及處理 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用50 mL/L異氟烷對小鼠進(jìn)行氣體麻醉，同時(shí)用手術(shù)剪刀剪開其胸腔，暴露心臟。用一次性注射器吸取0.01 mol/L PBS 15 mL，將針尖插入小鼠心臟左心室，剪開右心耳后推入PBS置換血液。待小鼠肝臟泛白后，換成預(yù)冷的40 mL/L多聚甲醛，灌注約100 mL。待小鼠全身僵硬后，小心剪開其頭皮及顱骨，暴露鼠腦，用鑷子完整取出大腦組織放入裝滿40 mL/L多聚甲醛的離心管中，并于4 ℃冰箱過夜。固定結(jié)束后，將組織轉(zhuǎn)移至配好的300 g/L蔗糖溶液中脫水，置于4 ℃冰箱保存。從蔗糖中取出鼠腦，用冰凍包埋劑包埋，在恒冷冰凍切片機(jī)中，進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚50 μm，將包含海馬腦區(qū)的組織切片收集入0.01 mol/L PBS中備用。用PBS漂洗組織3次后，將其轉(zhuǎn)移入冰凍保護(hù)液中，置于-20 ℃保存。

1.2.3.2 免疫熒光染色 從冰凍保護(hù)液中取出切片，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。將組織切片挑出放入抗體孵育板中，加入50 mL/L驢血清，室溫下封閉2 h。而后轉(zhuǎn)移至Goat-anti-Iba1(# 011-27991，1∶500，Wako)一抗中，4 ℃孵育過夜。孵育結(jié)束后使用PBS漂洗3次，每次10 min。而后在室溫下將組織切片轉(zhuǎn)移至Alexa 594-conjugated Donkey-anti-Goat(A-11058，1∶500，Invitrogen)二抗中避光孵育3 h。結(jié)束后用PBS漂洗3次，每次10 min。染色后將腦片裱在載玻片上，而后利用防淬滅熒光封片劑進(jìn)行封片保存。

1.2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞面積分析 使用40倍共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus公司)采集小膠質(zhì)細(xì)胞圖像(Z軸方向每0.5 μm拍攝1張)。每組共追蹤到海馬背側(cè)CA1腦區(qū)細(xì)胞帶臨近區(qū)域的10個(gè)完整小膠質(zhì)細(xì)胞。采集圖片后使用ImageJ軟件的NeuronJ插件對神經(jīng)元形態(tài)進(jìn)行描繪。細(xì)胞面積測量方法同之前的研究，利用插件進(jìn)行計(jì)算[8]。進(jìn)一步對小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 SD導(dǎo)致小鼠焦慮樣行為改變

為了探究SD是否會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮樣情緒，在小鼠進(jìn)行SD后對其進(jìn)行高架十字迷宮檢測和曠場實(shí)驗(yàn)檢測。在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中(圖1A)，使用SMART 3.0軟件中的頭-體-尾三點(diǎn)法分析小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，并繪制出小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖(圖1B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠在開放臂區(qū)域存在一定的探索行為，而SD組小鼠進(jìn)入開放臂的時(shí)間顯著少于對照組小鼠(P<0.05,圖1C～D)。同時(shí)，SD組小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)較對照小鼠顯著降低(P<0.01,圖1E)。

A：72 h SD示意圖及高架十字迷宮行為實(shí)驗(yàn)示意圖；B：小鼠在高架十字迷宮中的典型軌跡圖；C:小鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中滯留在開放臂的時(shí)間柵狀圖；D：兩組小鼠開放臂探索停留時(shí)間比較兩組小鼠進(jìn)入開放臂探索次數(shù)比較睡眠剝奪。圖1 成年SD小鼠在高架十字迷宮中的行為學(xué)改變

在曠場實(shí)驗(yàn)中(圖2A)，同樣利用SMART 3.0軟件對錄像結(jié)果進(jìn)行分析，使用4×4分割法，將曠場等分為16個(gè)區(qū)域，界定中間4個(gè)區(qū)域?yàn)闀鐖龅闹行膮^(qū)域(圖2B)，并繪制出小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)軌跡圖(圖2C)，結(jié)果顯示，SD組小鼠進(jìn)入曠場中間區(qū)域探索的時(shí)間顯著少于對照組小鼠(P<0.01,圖2D)；SD組小鼠進(jìn)入曠場中間區(qū)域的次數(shù)顯著少于對照組小鼠(P<0.01,圖2E)；SD組小鼠在曠場的運(yùn)動(dòng)總路程降低(圖2F)；兩組小鼠進(jìn)入曠場中間區(qū)域探索行為存在差異(圖2G)。以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，SD會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為。

A：72 h SD示意圖及曠場行為實(shí)驗(yàn)流程圖；B：4×4分析法中曠場中心區(qū)域示意圖；C：小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的典型軌跡圖；D：SD小鼠進(jìn)入中間區(qū)域探索停留的時(shí)間小鼠進(jìn)入中間區(qū)域探索的次數(shù)F：SD小鼠在曠場運(yùn)動(dòng)的總路程降低小鼠在曠場中心區(qū)域的探索情況。SD：睡眠剝奪。圖2 成年SD小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的行為學(xué)改變

2.2 SD導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)認(rèn)知記憶功能的改變

為了探究SD對認(rèn)知功能的影響，我們對小鼠進(jìn)行了新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(圖3A～B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第2日測試階段，對照組小鼠對新物體出現(xiàn)了明顯的識(shí)別偏好，探索時(shí)間明顯高于舊物體(P<0.01)；而SD組小鼠則對新物體無明顯偏好，且對新、舊物體的探索時(shí)間無明顯差異(圖3C)。計(jì)算其偏好指數(shù)發(fā)現(xiàn)，SD組小鼠對新物體的偏好指數(shù)明顯低于對照組小鼠(P<0.01,圖3D)。以上結(jié)果證明，SD損傷了小鼠對新事物的認(rèn)知功能。

A：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)流程圖；B：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D；C：小鼠對新舊物體探索的時(shí)間識(shí)別指數(shù)(小鼠探索新物體時(shí)間/新舊物體時(shí)間之和)睡眠剝奪。圖3 成年SD小鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的行為學(xué)改變

2.3 SD誘導(dǎo)海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活

海馬是情緒及認(rèn)知編碼的重要腦區(qū)。72 h SD后，我們對兩組小鼠進(jìn)行灌注取材，而后進(jìn)行了海馬區(qū)域免疫組織熒光染色，標(biāo)記表達(dá)Iba1的小膠質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)行三維重塑及形態(tài)學(xué)分析(圖4A)。通過分析小膠質(zhì)細(xì)胞樹突分支與不同半徑同心圓的交叉點(diǎn)數(shù)顯示，總體交叉點(diǎn)數(shù)SD組顯著高于對照組(P<0.01,圖4B～C)，平均交叉點(diǎn)數(shù)SD組也顯著高于對照組(P<0.01,圖4D)；且通過分析小膠質(zhì)細(xì)胞的面積和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)域SD組小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞面積均相較于對照組出現(xiàn)了明顯增高(P<0.05，P<0.01，圖4E～F)。上述結(jié)果初步證實(shí)了SD能夠誘發(fā)海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)異常激活，可能參與了SD誘發(fā)情緒及認(rèn)知異常的發(fā)生發(fā)展。

A：小膠質(zhì)細(xì)胞的三維重建(標(biāo)尺為20 μm)；B～C：Sholl分析中小膠質(zhì)細(xì)胞樹突分支與不同半徑同心圓的交叉點(diǎn)數(shù)分析結(jié)果中小膠質(zhì)細(xì)胞突起的平均分支數(shù)海馬中Iba1陽性細(xì)胞的數(shù)量(每組n=10個(gè)細(xì)胞/8只小鼠)小膠質(zhì)細(xì)胞面積的定量(每組n=10個(gè)細(xì)胞/8只小鼠)睡眠剝奪。圖4 SD對小鼠海馬中的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

3 討論

SD嚴(yán)重影響身心健康。臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)睡眠不足會(huì)誘發(fā)負(fù)性情緒及認(rèn)知功能不可逆的損害，然而相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明[9-10]。研究表明，SD對機(jī)體的影響與免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其主要通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。在嚙齒類相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，SD能夠打破機(jī)體促炎及抗炎平衡穩(wěn)態(tài)，同時(shí)大量的炎癥因子如TNF-α、IL-1β等表達(dá)增加[11]。因此從神經(jīng)免疫炎癥角度入手是探尋SD潛在神經(jīng)機(jī)制的重要方向。

睡眠在調(diào)節(jié)認(rèn)知和情緒方面發(fā)揮著重要作用。早在1983年研究者就提出了睡眠對記憶鞏固過程至關(guān)重要，隨著研究的不斷深入，睡眠和記憶的關(guān)系被廣泛證實(shí)。海馬和額葉與情緒認(rèn)知有很大的關(guān)系[12]，海馬是調(diào)節(jié)記憶的經(jīng)典腦區(qū)，額葉與情緒調(diào)節(jié)有關(guān)。大量研究表明，睡眠不足會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能的損害，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶能力下降[13-16]。據(jù)ESTRADA等[17]研究報(bào)道，SD對機(jī)體的空間學(xué)習(xí)記憶有一定的損傷。TUAN等[18]通過新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SD對小鼠短期記憶同樣有不良的影響。在本研究中，SD后的小鼠同樣表現(xiàn)出記憶能力的降低，即在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，SD組的小鼠無法區(qū)分出新舊物體，這與以往的報(bào)道相一致[19]。另外，既往研究表明SD與焦慮等情緒相關(guān)，SD會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)明顯的焦慮狀態(tài)，且在完全SD的狀態(tài)下也有相似的結(jié)果[20]。本研究中的結(jié)果與其報(bào)道一致，72 h SD后，SD組小鼠在高架十字迷宮中進(jìn)入開放臂的次數(shù)及其滯留于開放臂的時(shí)間均低于對照組小鼠，提示SD小鼠表現(xiàn)出了明顯的焦慮樣行為。此外，72 h SD后的小鼠，在曠場實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入曠場中心區(qū)域的次數(shù)、滯留于中心區(qū)域的時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)的總距離顯著低于對照組小鼠。

研究表明，大鼠認(rèn)知功能的損傷與PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)[21]。SD加重小鼠海馬區(qū)域Aβ斑塊沉積和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，降低了海馬區(qū)PSD-95的表達(dá)，導(dǎo)致小鼠的短期工作記憶、長時(shí)程空間參考記憶和恐懼記憶等多種類型的認(rèn)知損傷加重[22]。在本研究中，我們從形態(tài)學(xué)角度驗(yàn)證了SD會(huì)導(dǎo)致海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是否會(huì)進(jìn)一步通過對神經(jīng)突觸的異常修剪等過程影響局部神經(jīng)環(huán)路功能穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而造成行為異常仍需要進(jìn)一步探索。

本研究存在一定的局限性：①相關(guān)認(rèn)知檢測僅限于空間位置記憶，后續(xù)還需對SD導(dǎo)致恐懼、文字等記憶形式認(rèn)知受損進(jìn)行進(jìn)一步的探索驗(yàn)證；②對小膠質(zhì)細(xì)胞的觀察僅限于形態(tài)學(xué)，后續(xù)需從信號通路、膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元交互等角度做進(jìn)一步的機(jī)制研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，72 h SD會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為的改變以及認(rèn)知功能的障礙，海馬CA1小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了過度活化。探明小膠質(zhì)細(xì)胞參與SD誘發(fā)行為異常發(fā)生的機(jī)制、建立靶向過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)策略將對未來防治SD對高級腦功能的影響具有重要意義。