解 楊,鐘凌云,王 卓,宋金菊,李家晴

(江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330004)

中藥炮制技術(shù)是凝結(jié)無數(shù)古今中醫(yī)藥學家用藥精華的我國獨具特色的傳統(tǒng)制藥技術(shù)。在中醫(yī)藥理論指導下,根據(jù)藥材本身及調(diào)劑、制劑、臨床需要對藥材進行不同的炮制。藥物經(jīng)過炮制后,使本身的藥性和功效發(fā)生變化,因此在臨床應用中根據(jù)不同需要選擇特定的炮制品,從而發(fā)揮藥物最大療效。近年來,隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展,中藥炮制的研究也逐漸深入。在炮制物質(zhì)基礎方面,大多采用光譜法、色譜法及聯(lián)用技術(shù);在炮制機制研究方面,通過網(wǎng)絡藥理學挖掘藥物與疾病的共有靶點信息,組學技術(shù)結(jié)合液相-質(zhì)譜對血液、尿液等樣品進行處理分析,全方位把控藥物在生物體中的代謝過程,同時采用分子生物學技術(shù)對蛋白質(zhì)等進行研究。本文以中藥炮制物質(zhì)基礎及系統(tǒng)生物學為主線,將新興的分析技術(shù)在中藥炮制中的應用進行整理。

1 中藥炮制物質(zhì)基礎研究的技術(shù)應用

1.1 光譜檢測技術(shù) 常見的光譜技術(shù)包括紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、原子吸收光譜等技術(shù)。其中紅外光譜可對炮制前后的成分變化進行分析和預測,紫外光譜可對炮制前后含量變化進行定量分析,原子光譜具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍,適合微量元素的定量分析[1]。

紅外光譜的原理是根據(jù)分子中的化學鍵或官能團發(fā)生振動吸收,產(chǎn)生不同的吸收頻率,以此來鑒別化學物的結(jié)構(gòu)或基團。劉麗軍等[2]通過紅外光譜比較白芷炮制前后成分變化,結(jié)果表明醋制后所有峰的強度均明顯減弱,醋制后在3 734 cm-1出現(xiàn)小的吸收峰,在1 647.21 cm-1處發(fā)生藍移。紅外光譜除了可以對成分進行定性分析外,還可以定量分析用于指導炮制程度。范曉東[3]利用紅外光譜技術(shù)得出山茱萸炒制8～12 h所含的羧酸含量最高。

紫外光譜通過測定物質(zhì)在不同波長的吸光度,計算物質(zhì)的具體含量。施群等[4]在224 nm下測定何首烏炮制前后總蒽醌的變化,發(fā)現(xiàn)炮制后總蒽醌的含量降低,與緩和瀉下作用有關(guān),為臨床應用提供參考。豨薟草含有的二萜類成分具有抗血栓、降低血小板凝集等藥理作用,采用紫外光譜測定總萜類的含量,結(jié)果顯示炮制后總萜類含量均降低[5]。此外,紫外光譜還多應用于糖類成分的含量測定,其操作快捷,方法簡單。李詩慧等[6]比較生竹茹及其姜制、玫瑰制、枳殼制和枳實制不同輔料對多糖的影響,最終發(fā)現(xiàn)玫瑰制后竹茹多糖的含量增高明顯。

原子吸收光譜法的基本原理是在高溫作用下將樣品變成原子蒸氣,光源燈發(fā)射的某一種特征波長與原子蒸氣結(jié)合,發(fā)生光譜吸收反應,不同元素形成的不同光譜圖經(jīng)分析后轉(zhuǎn)為電信號[7],一般在藥物分析中多用于檢測微量元素。賈敏等[8]通過原子吸收光譜法檢測五味子不同炮制品中所含鉛、鎘、汞、銅、砷的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過炮制后含量均發(fā)生明顯變化,且炮制輔料黃酒、蜂蜜和醋中含有的鉛和砷超出標準限量,這也反映出輔料的質(zhì)量標準建立是非常有必要的。

1.2 色譜檢測技術(shù) 色譜檢測分析技術(shù)在中藥炮制領(lǐng)域的應用越來越多,為炮制品的質(zhì)量及藥性研究提供了新型技術(shù)支持。常見的色譜技術(shù)包括薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)及高效液相色譜法(HPLC)等,其中HPLC較為常用。

HPLC是以高壓下的液體為流動相,采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。通過HPLC對成分進行研究,以此發(fā)現(xiàn)炮制前后藥性的變化。有研究將黃連用寒熱兩種不同類型的輔料進行炮制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除醋制品外,黃酒、生姜、吳茱萸汁等辛溫燥熱的輔料炮制出的黃連所含的總生物堿含量高于膽汁、食鹽等輔料炮制的黃連,說明藥性的變化與炮制輔料及成分變化存在一定相關(guān)性[9]。干蟾皮具有清熱解毒、利水消腫的功效,主要成分為強心甾類化合物,在干燥過程中分解為有毒成分,采用HPLC檢測出砂炒加熱炮制后華蟾酥毒基和酯蟾毒配基有不同程度降低,這也說明炮制與藥性理論的減毒有一定關(guān)聯(lián)性[10]。此外,在優(yōu)化炮制工藝研究中,有研究者采用響應面法結(jié)合HPLC優(yōu)化大黃炒制工藝,以幫助確定炮制終點,達到“適中”的效果[11]。

1.3 色譜聯(lián)用檢測技術(shù) 色譜技術(shù)分離能力強,波譜可對未知化合物進行定性分析,兩種技術(shù)結(jié)合更有利于對成分的分析,因此色譜與光譜或波譜聯(lián)用已成為中藥炮制成分研究的有效手段,如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等。

GC-MS技術(shù)一般用于具有揮發(fā)油成分藥物的定性定量分析。張霞等[12]采用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)姜制天麻后引入的揮發(fā)性成分更穩(wěn)定,且多為有效成分,對人體有害的成分如1,1-二甲基肼、糠醛等成分較生品含量降低。陳炯等[13]對比吳茱萸用不同輔料炮制后揮發(fā)油的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)生品含量最高,生姜炙、黃連炙次之,甘草炙最低,炮制后毒性成分揮發(fā)油的含量及組成均較生品發(fā)生變化。

LC-MS技術(shù)在中藥炮制前后成分差異比較、質(zhì)量控制等方面發(fā)揮著重要的作用[14]。張楠茜等[15]基于LC-MS技術(shù)比較加熱炮制后鹿茸化學成分的差異,通過主成分分析(PCA)將生品和熱炸炮制品明顯區(qū)分,且熱炸后樣品較分散,可能是由于熱炸過程中溫度不同造成成分變化較大。中藥藥性包括中藥的四氣五味、升降浮沉、歸經(jīng)及有毒無毒。有研究對比酒炙前后黃芩物質(zhì)基礎的變化,以超高效液相色譜-電噴霧三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-TQMS)進行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒炙黃芩苷等黃酮苷類成分含量下降,黃芩素等黃酮苷元類成分含量有所增加,且黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙苷炮制前后含量有顯著性差異[16],與黃琪等[17]發(fā)現(xiàn)的黃芩酒炙前后藥性改變可能與黃酮類成分含量變化有關(guān)相一致。

1.4 感官分析檢測技術(shù) 電子鼻、電子舌是模仿人類嗅覺和味覺感知機制研究的一種現(xiàn)代化智能感官分析檢測技術(shù),通過對物體氣體和味道的客觀化、數(shù)字化信息處理,從而實現(xiàn)對中藥的質(zhì)量評價、炮制品鑒定等。利用電子舌、電子鼻檢測苦參炮制后氣味和味道的差異變化,通過主成分分析(PCA)、聚類分析(HCA)得出米泔水浸泡和蒸制后氣味和味道均發(fā)生變化,在蒸制6 h后與生品味道有明顯差異,得出古代炮制方法與現(xiàn)代方法對比,飲片的氣味弱于現(xiàn)代制法的飲片,苦味強于現(xiàn)代制法的飲片,揭示了苦參古今用藥理論的內(nèi)涵[18]。荊文光等[19]從氣、味角度尋找姜制后降低厚樸刺激性的原因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚樸姜制后澀味降低,電子鼻氮氧化物和硫化物傳感器的測定值降低,揮發(fā)性成分降低。

2 中藥炮制研究的系統(tǒng)生物學技術(shù)應用

2.1 網(wǎng)絡藥理學 網(wǎng)絡藥理學是融合系統(tǒng)生物學、信息學、計算機科學和藥理學的綜合學科,基于“藥物-靶點-疾病”的思路探索網(wǎng)絡各藥物節(jié)點及疾病的相互關(guān)系[20]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論對疾病的把控講究“天人合一”“整體觀念”,與網(wǎng)絡藥理學的思想具有一致性。近年來,在中藥炮制的機制研究中也逐漸引入網(wǎng)絡藥理學的研究思路。

如草烏味辛,有大毒,一般炮制后入藥,有研究根據(jù)地方民族特色,在現(xiàn)有的?內(nèi)蒙古蒙成藥標準?指導下從整體觀闡明訶子解草烏心臟毒性的炮制機制。通過對訶子和草烏兩味藥的靶點預測及網(wǎng)站搜索心律不齊的相關(guān)靶點基因,獲得潛在作用靶點,結(jié)果發(fā)現(xiàn)訶子含有的大量鞣質(zhì)與草烏中生物堿生成難溶性鹽,使草烏毒性成分二萜類生物堿作用強度下降,延緩在體內(nèi)的吸收,從而緩和毒性,再結(jié)合KEGG通路結(jié)果可以推測出訶子通過調(diào)節(jié)心肌細胞進一步發(fā)揮保護心臟的作用,減輕草烏的心臟毒性,但后續(xù)仍需藥理實驗驗證[21]。

有研究通過網(wǎng)絡藥理學探索酒蒸黃連-石菖蒲藥對的潛在靶點,揭示該藥對在糖尿病中的作用機制。通過網(wǎng)絡藥理學結(jié)果,選定膽堿能通路中關(guān)鍵靶點乙酰膽堿酯酶(AchE)建立糖尿病認知功能障礙動物模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模后,在處于高糖高脂狀態(tài)下,兩個關(guān)鍵酶受到顯著影響,用藥后活性顯著降低,進一步說明酒蒸黃連-石菖蒲對糖尿病基因靶點乙酰膽堿(Ach)合成有一定的促進作用,后續(xù)可通過增強膽堿能信號通路改善認知功能障礙[22]。膽黃連的炮制以“相資為制”為基本原則,膽汁的加入使黃連生物堿溶出度增加,通過網(wǎng)絡藥理學分析輔料膽汁的作用,利用其活性成分對特定靶器官進行分析,篩選出 MAPK1、CASP3、ALB、NR3C1潛在核心靶點,提示可能是膽黃連瀉肝膽實火的核心靶點[23]。

2.2 組學技術(shù) 組學技術(shù)常用的有蛋白組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學、糖組學等,是在現(xiàn)代生物學研究體系中運用高通量分析檢測技術(shù)的研究方法。通過組學技術(shù),可以從多角度、多方面深入挖掘炮制的作用機制,闡明炮制內(nèi)涵。

(1)蛋白組學在中藥炮制研究中的應用 蛋白組學逐漸成為系統(tǒng)生物學研究的關(guān)鍵部分,一般是指一個基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。通過運用多種手段對生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達進行評估,從而了解復雜的病理過程,包括化學蛋白質(zhì)組學、定量蛋白質(zhì)組學和差異蛋白質(zhì)組學[24]。中藥炮制結(jié)合蛋白質(zhì)組學技術(shù)在藥物炮制品篩選、藥效機制的闡釋等方面應用廣泛,通過比較不同蛋白質(zhì)的表達差異,以期找到有效的藥物成分靶點。

有研究者通過采用Label Free蛋白質(zhì)組學技術(shù)對龜甲及炮制品差異蛋白表達進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)龜甲生品與炮制品相比,有39個差異蛋白,其中23個為特有蛋白,對其差異蛋白進行GO功能和KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)GO功能主要涉及氧化還原、單體分解代謝和磷酸核糖代謝等多個代謝過程,對KEGG通路主要涉及HIF-1信號通路、鈣通路、阿爾茨海默病等,通過綜合富集分析可以為龜甲炮制品的藥理活性研究提供參考[25]。楊欣[26]選取不同寒熱性中藥對肝臟、下丘腦、肝微粒體等組織差異蛋白的變化進行個性與共性比較分析,確定了差異蛋白參與的信號傳導通路。

(2)代謝組學在中藥炮制研究中的應用 代謝組學是運用液質(zhì)聯(lián)用、磁共振等現(xiàn)代技術(shù)手段對血液、尿液、糞便等內(nèi)源性代謝物通過數(shù)據(jù)處理,對生物體內(nèi)分子量小于1 000的物質(zhì)進行定性定量分析的研究技術(shù)[27],能夠全方位把控生物體內(nèi)代謝物質(zhì)群的變化,從而更好地解釋中藥炮制的機制。

淫羊藿具有補腎壯陽、強筋骨等作用,經(jīng)過羊脂油炒后藥性由寒轉(zhuǎn)溫,溫腎壯陽作用增強。王玲等[28]從代謝組學角度出發(fā)尋找淫羊藿炮制前后對腎陽虛內(nèi)源性代謝物的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊脂油通過調(diào)節(jié)半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路,在加熱炮制的過程中通過調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝以增強炮制后的療效。鈕敏潔等[29]通過代謝組學技術(shù)對酒制前后山茱萸抗肝纖維化作用進行分析,發(fā)現(xiàn)炮制品藥效作用及回調(diào)水平均優(yōu)于生品,如調(diào)節(jié)甘油磷酸代謝、視黃醇代謝和花生四烯酸代謝方面效果更佳。有研究運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)的非靶向代謝組學測定酒黃芩對急性肺損傷小鼠糞便和血液代謝物水平的影響,以論證?本草蒙筌?中“凡藥制造,貴在適中……酒制升提”的內(nèi)涵。糞便和血漿代謝組學結(jié)果顯示,酒黃芩干預后主要回調(diào)7條代謝通路,其中以對苯丙氨酸和色氨酸的代謝通路作用突出[30]。苯丙氨酸作為人體必需的氨基酸,在急性炎癥疾病中發(fā)揮著重要作用。色氨酸代謝產(chǎn)物與芳香烴受體結(jié)合后,可激活炎癥因子,從而有效抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。

炮制生熟異用是指生品飲片炮制為熟制品后,兩種飲片具有不同的功效,以此來擴大臨床用途,同時達到降低毒性的目的。雷公藤有大毒,毒性主要靶器官為肝臟,在炮制中用甘草調(diào)和雷公藤的藥性,可降低其肝毒性,結(jié)果得出脂肪酸代謝可能是甘草制雷公藤降低肝毒性的重要代謝通路[31]。山楂的不同炮制品臨床應用不同,炒山楂善于消食化積,焦山楂常用于消食止瀉,山楂炭性澀,長于止血止瀉。有研究采用氫核磁共振譜(1HNMR)技術(shù)的代謝組學,通過體內(nèi)藥理試驗結(jié)合代謝組學,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各炮制品均可用于消食導滯,但療效存在一定差異,其中焦山楂對O-乙酰糖蛋白、谷氨酰胺和甘油磷脂酰膽堿(GPC)的回調(diào)水平更趨近于正常,療效更為顯著[32]。

2.3 分子生物學 分子生物學是炮制研究的重要技術(shù)之一,在一定程度上能反映檢測樣本生物體內(nèi)的蛋白生成、基因活性、表達等過程,可以用于闡明致病及治病機制的重要依據(jù)[33]。在研究中一般以酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、免疫印跡法(Western blotting)、熒光定量PCR等為主。

(1)ELISA在中藥炮制研究中的應用 ELISA法是利用抗體與抗原分子結(jié)合特點,將游離雜蛋白和固相載體的目的蛋白結(jié)合,利用特殊的標記物對其進行定性或定量的一種檢測方法。在炮制藥效研究方面,通過ELISA測定機體血清或臟器勻漿中不同蛋白的含量,用以說明藥物在機體的治療效果。麥麩為小麥過篩后的種皮,味甘,性平,能和中益脾,緩和藥物的燥性。對比蜜麩和麩炒枳殼對大鼠胃腸功能的燥性,用ELISA測定水通道蛋白3(AQP-3)含量及血清環(huán)磷酸腺苷(c AMP)/環(huán)磷酸鳥苷(c GMP)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜜麩品對水液代謝及津液損傷最小,分析可能與蜜麩所含蜂蜜炒后補中、調(diào)和藥性有關(guān)[34]。于艷等[35]利用麥麩緩和燥性的特點,對比茅蒼術(shù)生品及麩炒品對胃潰瘍大鼠抗炎的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)麩炒可使胃組織中白細胞介素-6、白細胞介素-8及前列腺素E2含量降低,較生品有顯著性差別。黃連味苦,性寒,用吳茱萸炮制后可以抑制黃連苦寒藥性,讓黃連寒而不滯。陳春梅[36]研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸制后可以在一定程度上降低黃連的寒性,緩和黃連生品對交感神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。

(2)免疫印跡法在中藥炮制研究中的應用 免疫印跡法是將混合抗原樣本在凝膠板上進行電泳分離,然后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。在印跡紙的外力作用下,使凝膠中的單一抗原組分轉(zhuǎn)移到印跡紙上,并且固相化。最后應用免疫覆蓋液技術(shù)如免疫同位素探針或免疫酶探針等,對抗原固定化基質(zhì)膜進行檢測和分析[37]。附子作為溫陽藥的代表藥,具有回陽救逆、補火助陽等功效,屬于溫熱藥物,能促進生物體的能量代謝。建昌幫特色炮制飲片陰附片和陽附片由于炮制方法獨特,備受關(guān)注。棕色脂肪組織參與能量代謝,對生物體的體溫和能量代謝起到重要的作用。凡若楠[38]利用免疫印跡法對特異性蛋白解偶聯(lián)蛋白-1(UCP1)進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽附片能使UCP1表達水平顯著升高,陰附片也可促進UCP1表達。有研究對桑螵蛸生品及炮制品抗氧化作用進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑螵蛸各組超氧化物歧化酶(SOD)蛋白表達水平均較模型組有顯著性差異,其中生品效果更優(yōu),這可能是其所含抗氧化成分為酚類物質(zhì),經(jīng)過加熱處理后含量降低有關(guān)[39]。

(3)熒光定量PCR在中藥炮制研究中的應用 熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過統(tǒng)計學對未知模板進行定量分析[40]。劉芬[41]通過RT-PCR技術(shù)對濕阻中焦證模型空腸組織血管活性腸肽受體2(IPR2)和胃竇部MTLR基因進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)麩炒后蒼術(shù)素含量增加,能明顯糾正VIPR2、MTLR基因的表達水平。藤黃生品有大毒,有研究對胃腸道中AQP3、AQP4的m RNA表達進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)藤黃炮制后可降低AQP3和AQP4的表達,且與劑量呈正相關(guān)[42]。

3 展望

本文從物質(zhì)基礎及系統(tǒng)生物學兩個方面為切入點介紹了新興的分析技術(shù),如在炮制的物質(zhì)基礎研究方面,整理了光譜、色譜及色譜聯(lián)用技術(shù);在系統(tǒng)生物學研究方面,介紹了網(wǎng)絡藥理學、組學技術(shù)及分子生物學等技術(shù)在中藥炮制研究中的應用,但在整理過程中也發(fā)現(xiàn)新技術(shù)在中藥炮制應用中存在的一些問題。

在物質(zhì)基礎研究方面,采用的分析技術(shù)大多單一。中藥成分復雜,在炮制過程中成分差異更大,僅以1種分析技術(shù)去檢測,結(jié)果不夠科學嚴謹。此外,數(shù)據(jù)處理的方法過于簡單,如紅外光譜僅通過肉眼得到一些峰位和結(jié)構(gòu),紫外光譜法僅通過吸光度測定總成分的含量,準確度、專屬性均不高,可進一步整合生物信息學技術(shù),挖掘更多的潛在信息[1]。在系統(tǒng)生物學研究方面,網(wǎng)絡藥理學已經(jīng)廣泛應用于中藥研究的始動預判中,但研究質(zhì)量參差不齊,如一些中藥、疾病數(shù)據(jù)庫更新慢,信息來源單一等。此外,中藥方劑組方因其在使用中的劑量及炮制方法不同而療效不同,而網(wǎng)絡藥理學在對成分篩選的過程中,僅根據(jù)口服利用度或藥代動力學等相關(guān)指標進行篩選,對中藥成分的量效關(guān)系考慮不周。在組學技術(shù)研究中,大多是單一組學技術(shù)的運用,應多組學結(jié)合,更全面地闡明藥物對生物體的影響過程。

中藥炮制學是我國制藥技術(shù)的瑰寶,要運用新的現(xiàn)代分析技術(shù)對炮制的成分及炮制機制進行更深入的挖掘,充分借鑒其他學科的新理論、新方法,將對中藥炮制的研究提升到更高的水平。