曹 陽 胡月 劉 彬

（黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學院，黑龍江 牡丹江 157000）

1.植物內(nèi)生菌的定義

內(nèi)生菌一詞是由植物病理學之父De Bary在1866年首先提出，是指生活在植物組織內(nèi)的微生物，用以區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌。現(xiàn)在被定義為能夠在植物內(nèi)部定殖而不引起宿主致病的微生物。內(nèi)生菌種類豐富，包括細菌、真菌、放線菌。內(nèi)生菌在控制病原菌，促進植物生長，新化合物的合成等方面有很好的應用。

2.植物內(nèi)生菌多樣性

植物不是單一微生物的宿主，而是同時宿主許多不同的有機體，它們統(tǒng)稱為內(nèi)生微生物組。內(nèi)生微生物組是多樣的，包括內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌以及內(nèi)生放線菌。宿主植物不同，其內(nèi)生菌的種類和數(shù)量也存在差異，同一宿主植物在不同組織中內(nèi)生菌的分布及其豐度也有所差異。很多內(nèi)生菌雖然在形態(tài)學上沒有較大差異，但是其內(nèi)生菌的遺傳型卻不盡相同，從而豐富了內(nèi)生菌的多樣性。目前研究較多植物物種有小麥、大豆、棉花，馬鈴薯等。已分離出的內(nèi)生真菌，大多數(shù)的內(nèi)生真菌是子囊菌類。而分離的內(nèi)生細菌已經(jīng)超過了129種，有50多個屬，主要有芽孢桿菌屬、單胞菌屬、泛生菌屬、假單胞菌屬等。植物內(nèi)生放線菌主要的種類為鏈霉菌屬等。地球上內(nèi)生菌的種類100萬左右，然而目前記載的植物內(nèi)生菌尚不足1/10，植物內(nèi)生菌的研究任重而道遠。

3.植物生防內(nèi)生菌分離

植物生防內(nèi)生菌的分離篩選過程：（1）在病害壓力地區(qū)對健康植物進行取樣。（2）利用人工培養(yǎng)基從表面無菌組織中分離。（3）利用核糖體基因?qū)Ψ蛛x物進行分子鑒定。（4）定殖效率和大規(guī)模生產(chǎn)試驗可以減少潛在分離菌的數(shù)量，以及發(fā)現(xiàn)潛在的病原體。（5）溫室內(nèi)進行植物內(nèi)生菌對植物的篩選試驗。（6）成功的分離菌可以在大田條件下進行大規(guī)模試驗，以評估田間的一致性。（7）潛在的生防內(nèi)生菌可以進入工業(yè)階段或大規(guī)模生產(chǎn)和銷售。

許多研究人員通過分離可培養(yǎng)微生物并測試其潛在的生防功能，尋找潛在的生防菌。通常采用體外對抗試驗，通過測定抑制目標病原體生長的能力，即直接抗菌活性尋找潛在生防菌。從生境中尋找健康的植物，從植物上分離出新的內(nèi)生菌，它們可以與病原體相互作用，為了檢驗從一些環(huán)境中分離出來的內(nèi)生菌更有可能適應這些特定的環(huán)境條件（例如，溫度、紫外線輻射、競爭生物等），之后可以進行小規(guī)模的田間試驗，以評估疾病癥狀的發(fā)展，并優(yōu)化時間點和應用方法。

從植物中篩選出的內(nèi)生微生物對寄主植物的適應性特別好，因為它們至少在其生命周期的一部分在植物組織內(nèi)部定居，而不會造成任何直接的、明顯的負面影響，國內(nèi)外學者對內(nèi)生菌分離篩選并進行相關(guān)的應用進行了全面而深入的研究。革蘭氏陽性蠟樣芽孢桿菌REN3和REN4從水稻根際和根中分離得到，實驗證明具有促進水稻生長和抑制水稻病原真菌生長的特性。一種拮抗枝孢菌的分離物從一種產(chǎn)孢菌的黑曲霉菌落中分離出來，在田間被證明與殺菌劑一樣有效控制蘋果疥瘡。有研究表明從工業(yè)和城市污水灌溉玉米根際土壤和根系中分離的可培養(yǎng)根際和內(nèi)生細菌對重金屬和鹽分的抗性和植物生長促進（PGP）特性，結(jié)果表明，大量細菌分離株（包括內(nèi)生細菌和根際細菌）對重金屬具有耐受能力。

4.植物內(nèi)生菌功能

4.1 增強植物抗病性

內(nèi)生菌能夠增強植物宿主對病原生物的抗性，保護宿主免受危害。近年來，隨著內(nèi)生菌研究領域的不斷深入，內(nèi)生菌作為潛在的生防資源方面成為了國內(nèi)外研究的熱點。內(nèi)生菌增強植物的抗病性可能機理主要表現(xiàn)在以下幾個方面：激活自身防御系統(tǒng)誘導抗性；重寄生作用; 通過抗菌物質(zhì)直接抑制；爭奪空間和營養(yǎng)。通常，不同內(nèi)生菌的生防機制有所差異，或單獨發(fā)揮作用或幾個機制同時作用。通過獲取營養(yǎng)物質(zhì)（氮、磷和必需礦物質(zhì)）或調(diào)節(jié)植物激素水平促進生長也可以改善植物的整體健康，從而保護植物免受疾病。

4.1.1誘導抗性

誘導抗性是植物防御機制共同作用的結(jié)果。為了使植物不受病原侵染，大量的防御反應被激活，包括加強結(jié)構(gòu)性障礙，抗微生物代謝物的生產(chǎn)，合成和分泌的抗病原體的蛋白質(zhì)，包括防御酶與抗菌蛋白。誘導植物反應的內(nèi)生植物衍生化合物，能夠識別外來特定的微生物成分。一旦認定這些化合物是潛在的有害微生物，就會誘導防御反應。植物對病原菌和內(nèi)生菌的反應比較表明兩者的識別方式相同，但在誘導防御反應方面有所不同。因此，誘導抗性很可能是內(nèi)生菌在疾病控制中最重要的機制之一。這些能夠誘導植物產(chǎn)生抗性的化合物，有些在所有內(nèi)生菌中都是普遍性的，如細胞壁成分幾丁質(zhì)和β-葡聚糖，而有些則是具有有特異性的化合物，包括分泌蛋白、某些脂類和專門的代謝物、具有激素作用的分子和揮發(fā)性化合物。感染和定植過程中分泌的酶，如木聚糖酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶，可被宿主直接識別或通過其降解產(chǎn)物誘導防御反應。在致病和內(nèi)生定殖過程中分泌的真菌效應蛋白，如一些富含半胱氨酸的小分子蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)防御反應和生理來促進與宿主植物的相容性。

典型的系統(tǒng)抗性主要分為兩種類型，系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和誘導性系統(tǒng)抗性（ISR）。大量研究表明，生防菌通過刺激植物自身的ISR反應來增強植物抵抗病原菌的能力。而ISR反應主要特征是植株體內(nèi)活性氧變化，這與植物自身SOD、POD和CAT等相關(guān)抗逆酶活力息息相關(guān)。Mahunu等研究結(jié)果表明植物酸聯(lián)合酵母菌降低了由青霉菌引起的蘋果病害，并增加了CAT，POD，PPO防御酶活性。孫潤紅等研究了生防菌枯草芽胞桿菌YB-05對小麥抗病性相關(guān)防御酶的誘導作用，結(jié)果表明，小麥經(jīng)生防菌處理后，葉片和根部與植物防御抗病相關(guān)的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比對照組高。

4.1.2 重寄生作用

重寄生是指包含了一系列情況的連續(xù)體，從宿主存活并從宿主細胞內(nèi)獲取營養(yǎng)的生物營養(yǎng)相互作用，到寄生體殺死宿主以死亡細胞生存的死性營養(yǎng)相互作用。因為在培養(yǎng)皿中比在植物上更容易觀察到寄生的跡象，所以證實真菌寄生行為的研究通常是在體外進行的。借助各種顯微鏡技術(shù)，可以看到寄生體和寄主之間的直接相互作用。真菌可以直接接觸，滲透進被寄生的菌絲，纏繞在菌絲周圍，最終導致獵物菌絲的破壞。Donayre和Dalisay研究了一種從牧草中分離出來的內(nèi)生真菌Geotrichum sp.對水稻紋枯病菌的寄生作用。國內(nèi)有研究者檢測了從蘆葦中分離出來的內(nèi)生真菌，可以對抗土壤傳播的病原菌，在顯微鏡下可觀察到菌絲纏繞在病原菌菌絲周圍，細胞質(zhì)降解。

4.1.3 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)

抗生素指的是生防菌直接產(chǎn)生的對病原體的有抑制作用的化合物。人們已經(jīng)鑒定和開發(fā)了一些生防菌代謝物，并研究了一系列不同化合物對植物病原的抑制活性。從內(nèi)生菌中分離出了大量具有抗菌活性的天然產(chǎn)物，包括生物堿、黃酮類、甾體、萜類、多酮類以及揮發(fā)性有機化合物，其中萜類和多酮類是目前對內(nèi)生真菌抗菌活性研究最多的代謝物，代謝產(chǎn)物可以在植物體內(nèi)從內(nèi)生菌轉(zhuǎn)移到病原感染的部位。目前研究較多的是關(guān)于內(nèi)生菌生產(chǎn)特定代謝物的能力和內(nèi)生菌培養(yǎng)物或粗提物對病原體的抑制作用。

4.1.4 爭奪空間和營養(yǎng)

有益內(nèi)生菌和致病菌爭奪營養(yǎng)和空間，也是一種可能的機制，通過其棲息的內(nèi)生植物可以防止宿主的侵染病原體。內(nèi)生菌可以在局部或系統(tǒng)地、細胞間或細胞內(nèi)定植不同的植物組織。通過快速定植和清除可用的營養(yǎng)物質(zhì)，它們占據(jù)了原本可能被病原微生物利用的生態(tài)位，從而在滿足自身的營養(yǎng)條件需求的情況下，又減少了病原菌入侵的可能性。有研究發(fā)現(xiàn)從可可樹葉片上分離的內(nèi)生菌葉面施用到幼苗上可以局部減輕葉片上疫霉菌的病害癥狀，這些表明競爭是一種機制。然而，體外對抗試驗也顯示了所選菌株產(chǎn)生的代謝物，表明競爭可能不是唯一的機制。

4.2 促進植物生長

大多數(shù)植物內(nèi)生菌具有直接和間接的機制促進植物生長的作用。在植物的生長過程中，一些內(nèi)生菌的生長代謝會產(chǎn)生植物生長激素、細胞激素，能夠直接對宿主植物的生長起到促進的作用，如吲哚乙酸、細胞分裂素、磷溶解，鉀溶解等，通過生物固氮增強宿主的可攻氮可用性，吲哚乙酸在植物中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過不同水平的吲哚乙酸產(chǎn)生刺激細胞伸長、種子萌發(fā)和幼苗生長。在間接機制中，內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如鐵載體、抗生素、酶這些物質(zhì)能夠間接地促進植物的生長。許多細菌內(nèi)生菌具有產(chǎn)生鐵載體的能力，鐵載體與鐵離子螯合成可溶性復合體，當這些復合物被轉(zhuǎn)移到細胞中時，它們會被水解，鐵被還原從而被植物吸收。纖維素酶和蛋白酶對提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性很重要。

4.3 天然藥物資源

內(nèi)生菌是具生物活性化合物的來源之一，在醫(yī)藥等領域都具有重要的意義。研究證實，內(nèi)生菌與宿主植物在協(xié)同進化過程中，內(nèi)生菌及其次生代謝物能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分。近年來，從植物內(nèi)生菌中分離出的藥用活性成分不斷增加，包括酯類、多糖、二萜類、醌類、黃酮類、生物堿類等物質(zhì)。在1990-2010年期間，已有超過100種抗癌化合物從內(nèi)生真菌中被描述。此外，Govindappa等人從植物組織中分離出鏈格孢菌的凝集素，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌凝集素具有較強的抗糖尿病作用。2017年，Uzor等研究了內(nèi)生真菌黑孢菌中的活性物質(zhì)脫落酸的抗糖尿病作用，結(jié)果表明可以顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖。國內(nèi)文獻報道從烏拉爾藥用植物中分離篩選出多種內(nèi)生菌，體內(nèi)及體外均表現(xiàn)出有抑菌作用，并對小鼠有鎮(zhèn)咳、祛痰作用。這些研究表明，植物內(nèi)生菌在新藥的研發(fā)及技術(shù)方面都具有較大的開發(fā)潛力。

5.內(nèi)生菌在植物上的應用

內(nèi)生菌種類繁多，最常見的有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬、泛菌屬等，這些內(nèi)生菌與植物相互作用中發(fā)揮著有益的作用。利用全基因組測序方法對內(nèi)生菌在植物病原菌生物防治方面的潛力研究表明菌株能產(chǎn)生抗菌素，具有抗菌活性。Contreras-Pérez等在體外生物測定中，內(nèi)生菌株B. toyonensis COPE52顯示出對灰霉病植物病原灰霉病菌的抗真菌作用。此外，菌株COPE52在溫室條件下對藍莓植株的生物量和葉綠素含量均有促進作用。2008年張鐸等利用平板對峙試驗證明內(nèi)生菌BSD-2具有較強的抑菌活性，利用硫酸銨沉淀拮抗物粗提液，并證明該提取物具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、耐蛋白酶性、對氯仿敏感，能夠有效抑制V.dahliae孢子萌發(fā)。2012年王蘭英等從南藥植物砂仁中分離出一株對水稻紋枯病防效作用理想的內(nèi)生菌屬于芽孢桿菌屬的菌株SRJ2-4，發(fā)現(xiàn)該菌株對水稻紋枯病的防效作用在盆栽和田間的防效效果分別是80.7%和79.4%，同時該菌株還能增加水稻的產(chǎn)量，每畝產(chǎn)量為488.79kg。2018年趙媛等以對葉紅景天（Rhodiola subopposita）為研究對象，從根、莖、葉中分離得到24株對葉紅景天內(nèi)生菌，其中有12株菌對蠶豆莢枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄鐮刀菌有不同程度的抑菌作用。2018年陸藍翔等利用組織切片法、組織勻漿法從健康樟樹組織中分離出的巨大芽孢桿菌ZS-3具有一定的抗病促生的作用。

6.展望

一方面從植物內(nèi)生菌體內(nèi)提取的相關(guān)次生代謝產(chǎn)物具有抗菌、促生長、抗病毒、抗氧化等很多功能；另一方面，植物內(nèi)生菌通過生物固氮、調(diào)節(jié)植物激素等作用促進宿主植物的生長和產(chǎn)量增加，有利于病蟲害生物防治、污染土壤的生物修復，有利于減少化學藥劑的使用，促進全球農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。然而，相比發(fā)達國家，我國在植物內(nèi)生菌方面的研究和應用還存在著一定的差距，這就需要我們朝著更深的方向研究和探索。