王涵 何牧野 曾行,2 楊敏一 孟珠 楊柳 王春仁

0 引言

胃癌作為胃黏膜上皮病變引起的惡性腫瘤，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。根據(jù)國(guó)際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)發(fā)表的研究結(jié)果：2018年全球胃癌新發(fā)病例約103萬例，排在全球惡性腫瘤第6位[1]；死亡病例約78萬例，排在全球惡性腫瘤第2位[2]。在我國(guó)，胃癌的防控形勢(shì)更為嚴(yán)峻。我國(guó)胃癌的發(fā)病率目前在所有惡性腫瘤中占第2位，死亡率高居第3位，我國(guó)每年胃癌約占全球胃癌新發(fā)病例的一半，居全球首位[3-4]。內(nèi)窺鏡下胃黏膜切除手術(shù)(endoscopic mucosal resection,EMR)和胃黏膜剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection,ESD)是早期胃癌和胃良性腫瘤切除的微創(chuàng)手術(shù)，不僅可達(dá)到根治早期胃癌的目的，且具有創(chuàng)傷小、對(duì)患者生存質(zhì)量影響小等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸取代部分傳統(tǒng)外科手術(shù)。但是采用這兩種方式，尤其是ESD術(shù)后產(chǎn)生的胃潰瘍較普通潰瘍更大更深，術(shù)后易出血及穿孔，裸露的創(chuàng)面在胃酸和胃蛋白酶的作用下，愈合時(shí)間也較長(zhǎng)，容易形成疤痕組織[5-8]，如何在ESD術(shù)后快速修復(fù)胃黏膜也是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。

海藻酸鹽是由(1-4)-β-交聯(lián)的D-甘露糖醛酸和(1-4)-α-交聯(lián)的古洛糖醛酸組成的長(zhǎng)鏈聚合物，是最具代表性的海洋多糖材料。它作為一種天然的生物材料，具有良好的生物相容性，已廣泛用作皮膚燒傷涂敷料、醫(yī)用黏合劑、組織工程支架等[12-14]。在消化系統(tǒng)領(lǐng)域，海藻酸鈉溶液被用作治療胃潰瘍消化道出血的止血?jiǎng)?.6%的海藻酸鈉稀釋液也被注射用于ESD手術(shù)中的黏膜抬舉[15]。但是到目前為止，海藻酸鹽基凝膠劑型還從未被用作ESD術(shù)后胃黏膜創(chuàng)面的修復(fù)及再生材料。

本研究中新型的海藻酸鹽基胃黏膜保護(hù)膠包括膠體液及固定液兩部分。其中，膠體液以海藻酸鹽為主要成分，添加多聚賴氨酸及葡聚糖；固定液為水溶性鈣溶液。該保護(hù)膠通過胃窺鏡噴涂后兩種組分可在生理?xiàng)l件下形成固體凝膠膜，作為胃黏膜的保護(hù)膠覆蓋到胃黏膜表面。作為在胃這一特殊環(huán)境下使用的醫(yī)療器械，胃黏膜保護(hù)膠需要適用于胃的酸性環(huán)境，在酸性條件依舊能保持其形態(tài)完整且力學(xué)強(qiáng)度滿足要求，因此本研究將對(duì)該材料進(jìn)行在同一pH值不同固化時(shí)間和不同pH值同一時(shí)間固化后的最大拉伸力測(cè)試，通過其力學(xué)性能的變化反映其所成的膠體的強(qiáng)度；通過抗酶解性能、組織黏附力、酸屏障實(shí)驗(yàn)對(duì)其耐胃蛋白酶消化能力、對(duì)胃黏膜組織的黏附力及對(duì)胃酸的抵御能力進(jìn)行考察；并通過觸變性能實(shí)驗(yàn)考察其通過胃窺鏡直接噴涂的可能性。該研究將為這一產(chǎn)品的臨床使用提供參考。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胃黏膜保護(hù)膠(杭州英健生物科技有限公司，中國(guó))；新鮮豬胃(河北奧博牧業(yè)有限公司，中國(guó))。

1.1.2 試劑

鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；胃蛋白酶(北京酷來搏科技有限公司，中國(guó))；生理鹽水(恒寧醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))；DMEM培養(yǎng)基(Corning，美國(guó))。

1.2 儀器

干燥箱(GRX-9023A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；電子天平(XSE205DU，梅特勒-托利多集團(tuán)，瑞士)；恒溫培養(yǎng)箱[ZHWY-103B，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，美國(guó)]；紫外分光光度計(jì)(U-3310，日立，日本)；蠕動(dòng)泵(BT100-1L，保定蘭格恒流泵有限公司，中國(guó))；旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(VT-550，德國(guó)哈克公司，德國(guó))；萬能材料試驗(yàn)機(jī)(3382，ITW 集團(tuán)英斯特朗公司，美國(guó))；pH計(jì)(FE28-standard，梅特勒-托利多集團(tuán)，瑞士)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1 酸敏感性實(shí)驗(yàn)

(1) 不同pH值鹽酸溶液固定同一時(shí)間最大拉伸力。將9 mL膠體液倒入直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，加入固定液10 mL固化2～3 min成膜，倒掉固化液；再加入pH為1.0、2.0、3.0、4.0的鹽酸溶液10 mL繼續(xù)固化30 min，倒掉多余液體，將樣品裁成2 cm×2 cm片材，不同pH值條件下取5片片材采用萬能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)定片材斷裂時(shí)的拉伸力。

(2) pH=1.0鹽酸溶液固定不同時(shí)間最大拉伸力。參照(1)的方法用固定液固化膠體成膜，再加入pH為1.0的鹽酸溶液10 mL分別固化15 min、30 min、60 min、120 min和180 min。將樣品裁成2 cm×2 cm片材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5片片材測(cè)定膜斷裂時(shí)的拉伸力。

1.3.2 抗酶降解實(shí)驗(yàn)

參照中國(guó)藥典方法[9]，準(zhǔn)備含胃蛋白酶及不含胃蛋白酶的人工胃液。將在pH為1.2的鹽酸溶液中固化30 min的膠體膜制成直徑為16 mm的圓片樣品。37℃在上述溶液中分別浸泡5片測(cè)試樣品，每隔兩天換液。分別測(cè)定3 d、1周、2周時(shí)材料的剩余質(zhì)量百分比，計(jì)算降解率。以SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若兩組樣本方差齊性且符合正態(tài)分布，選擇兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若方差不齊選用兩樣本秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P>0.05表示兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.3 組織黏附力實(shí)驗(yàn)

取市售新鮮豬胃[10]置37 ℃生理鹽水中切開并將胃內(nèi)壁清洗干凈，清洗的胃在2 h內(nèi)使用。剪取5 cm×5 cm面積的胃組織，固定于聚乙烯薄膜上，切除胃的黏膜層形成1 cm×1 cm的創(chuàng)面。將0.5 mL胃黏膜保護(hù)膠膠體液均勻涂布于胃黏膜創(chuàng)面及附近正常黏膜上，然后噴灑固定液，5 min后用15 mL生理鹽水沖洗掉多余的固定液。胃組織在恒溫培養(yǎng)箱(相對(duì)濕度92.5%，溫度37℃)中放置20 min后固定于角度為60°的沖洗斜槽上，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速為20 mL/min，用0.1 mol/L鹽酸沖洗5 min，沖洗液收集于已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿中；另取相同面積的胃組織同法操作并收集沖洗液。在70 ℃烘干，稱重。組織黏附力用黏附百分率表示，平行測(cè)試8個(gè)樣品。計(jì)算方法如下:

胃組織黏附百分率(%) ={[M-(G-g-m)]/

M}×100%

式中：M為胃黏膜保護(hù)膠的質(zhì)量；g為空蒸發(fā)皿質(zhì)量；G為蒸發(fā)皿與烘干后殘?jiān)傎|(zhì)量；m為同體積沖洗液所含固體物質(zhì)的質(zhì)量(空白對(duì)照)。

1.3.4 觸變性能實(shí)驗(yàn)

在旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)中加入40 mL的樣品或?qū)φ掌凡⒃?0 r/min和200 r/min 轉(zhuǎn)速下的黏度進(jìn)行計(jì)算。假塑比值=高轉(zhuǎn)速下的黏度/低轉(zhuǎn)速下的黏度。其中樣品組為胃黏膜保護(hù)膠，對(duì)照組為2%的羧甲基纖維素。

1.3.5 酸屏障作用實(shí)驗(yàn)

配制濃度為37.0%、18.5%、9.3%、4.6%的鹽酸溶液。如圖1所示，在24孔板中加入1 mL無血清培養(yǎng)基；樣品組的Transwell小室中加入0.2 mL的胃黏膜保護(hù)膠，對(duì)照組不做處理，然后每組中加入25 μL不同濃度的鹽酸溶液，每組做3個(gè)復(fù)孔，用pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)基的pH值變化。

圖1 酸屏障作用實(shí)驗(yàn)示意圖Figure 1 Schematic diagram of acid barrier test

2 結(jié)果

2.1 酸敏感性實(shí)驗(yàn)

不同pH值(pH=1.0、2.0、3.0、4.0)條件下固定30 min，pH值為1.0時(shí)最大拉伸力最大，隨pH值的升高拉伸力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，結(jié)果見表1；當(dāng)pH=1.0時(shí)，隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)，膠體膜的最大拉伸力升高，力學(xué)性能改善，結(jié)果見表2。

表1 不同pH值鹽酸溶液固定同一時(shí)間最大拉伸力變化(n=5)Table 1 The maximum tensile force of HCl solutions fixed at different pH values changes at the same time(n=5)

表2 pH 為1.0的鹽酸溶液固定不同時(shí)間最大拉伸力變化(n=5)Table 2 The maximum tensile force of HCl solution with pH 1.0 fixed at different time(n=5)

2.2 抗酶降解實(shí)驗(yàn)

以SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組樣本方差齊性且符合正態(tài)分布，選擇兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。3 d、1周、2周時(shí)兩組間的降解率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明該胃黏膜保護(hù)膠具有抗酶解性能，結(jié)果見表3。

表3 抗酶降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 3 Results of anti-enzyme degradation test(n=5)

2.3 組織黏附力實(shí)驗(yàn)

胃黏膜保護(hù)膠的黏附率在90%以上，具有較好的組織黏附性，結(jié)果見表4。

表4 組織黏附率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=8)Table 4 Results of tissue adhesion rate test(n=8)

2.4 觸變性能實(shí)驗(yàn)

胃黏膜保護(hù)膠在50 r/min的黏度為0.98 Pa·s；在200 r/min的黏度為0.38 Pa·s，假塑比值為0.39；2%羧甲基纖維素在50 r/min及200 r/min的黏度分別為0.41 Pa·s及0.24 Pa·s；假塑比值為0.58。因此，胃黏膜保護(hù)膠假塑比值低于2%羧甲基纖維素，說明胃黏膜保護(hù)膠具有更好的觸變性。

2.5 酸屏障作用實(shí)驗(yàn)

胃黏膜保護(hù)膠對(duì)不同濃度的鹽酸溶液均有一定的隔離屏蔽作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 胃黏膜保護(hù)膠的酸屏障作用研究結(jié)果(n=3)Table 5 Acid barrier effect results of gastric mucosal protective gel(n=3)

3 討論

目前臨床上對(duì)EMR及ESD術(shù)后黏膜創(chuàng)面的修復(fù)途徑主要有內(nèi)鏡下閉合、藥物治療、生物材料修復(fù)等。內(nèi)鏡下閉合主要利用止血夾、消化道閉合裝置等；術(shù)后應(yīng)用藥物主要有黏膜保護(hù)劑及抑酸藥物等；目前報(bào)道的生物材料有聚乙醇酸膜狀材料、新生羊膜等。這些方法相對(duì)來說操作或使用復(fù)雜且效果有限。生物材料學(xué)科的發(fā)展為這一問題的解決帶來了新的契機(jī)。理想胃黏膜保護(hù)及修復(fù)材料需具有以下特點(diǎn)：能夠在術(shù)中通過管道抵達(dá)創(chuàng)面并迅速粘附；能適應(yīng)胃內(nèi)的特殊環(huán)境，抵御胃酸(pH值為0.9～1.5)腐蝕及胃蛋白酶的消化；能夠牢固覆蓋于創(chuàng)口表面，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，但又不能過于堅(jiān)硬，須順應(yīng)胃部蠕動(dòng)特性；好的生物相容性[11]。

本研究進(jìn)行了一種新型的海藻酸鹽基胃黏膜保護(hù)膠的理化性能研究。一是針對(duì)胃黏膜保護(hù)膠主要應(yīng)用于胃ESD術(shù)后，需要耐酸耐消化酶降解，測(cè)試了在同一pH值不同固化時(shí)間和不同pH值同一時(shí)間固化后的拉伸強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)固化時(shí)間越長(zhǎng)、酸度越高時(shí)最大拉伸力越大；證明了該材料具有酸敏感性，即該材料遇酸發(fā)生相變由液體轉(zhuǎn)化為膠體，并有一定的力學(xué)強(qiáng)度。二是由于手術(shù)中胃內(nèi)特殊的環(huán)境，需要測(cè)試保護(hù)膠在該環(huán)境下的黏附率。針對(duì)這一問題設(shè)計(jì)了黏附實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃黏膜保護(hù)膠的黏附率較高，具有良好黏附性能。三是研究了胃黏膜保護(hù)膠對(duì)在胃蛋白酶條件下降解進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)在有和無胃蛋白酶的條件下該保護(hù)膠的降解率無顯著性差異，該膠體具有抗酶解的性能。四是通過觸變性能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品在較高轉(zhuǎn)速下可以降低黏度，在較低轉(zhuǎn)速下黏度增高，具有觸變性，可避免樣品在注射部位的流動(dòng)性。五是研究了該保護(hù)膠的酸屏障作用，利用Transwell小室設(shè)計(jì)酸屏障模型，證明該保護(hù)膠可以抵御酸的侵襲，對(duì)未愈合創(chuàng)面起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示該保護(hù)膠有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但還需充分對(duì)其生物相容性及有效性[16-18]進(jìn)行研究，證明其安全性和有效性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，海藻酸鹽基胃黏膜保護(hù)膠具有抗酸解及酶解的特性，可在體內(nèi)保持良好的形態(tài)；具有較好的組織黏附性及酸屏障隔離作用，可保護(hù)胃黏膜免受胃酸的刺激；具有良好的觸變性，使其具有可注射性，且保持穩(wěn)定的形態(tài)不易流動(dòng)擴(kuò)散。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證明該胃黏膜保護(hù)膠是一種具有臨床應(yīng)用可能性的醫(yī)療器械產(chǎn)品。同時(shí)，本次研究針對(duì)的海藻酸鹽基生物材料是在胃黏膜創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的首次應(yīng)用，針對(duì)該材料凝膠劑型的研究也為胃黏膜創(chuàng)面保護(hù)及修復(fù)打開了新的思路。