賀水花 ，宋毅，李海平 ，曹慧敏 ，楊玲*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

2021年，全球大約有5.37億20—79歲的成年人患有糖尿?。?］，糖尿病已成為當今嚴重和常見的慢性疾病之一。近年來，從中草藥資源中尋找降糖效果好，且對機體無副作用的新型天然植物α-葡萄糖苷酶抑制劑逐漸成為研究熱點之一［2-4］。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制小腸內(nèi)糖苷酶活性，延遲消化攝入的碳水化合物從而減少葡萄糖的吸收來控制血糖水平［3］。研究α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制機制，對于α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)及應(yīng)用具有重要的理論和實踐意義。

藥桑作為一種藥食同源性植物［5］，是維吾爾族的民間降血糖藥物［6-7］。郝蒙蒙等［8］研究發(fā)現(xiàn)藥桑葉中提取的粗黃酮、粗多糖和粗生物堿均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且粗生物堿及高濃度的粗多糖抑制活性較強；王賀［9］優(yōu)化了藥桑葉生物活性物質(zhì)提取純化工藝的6個單因素條件，按優(yōu)化工藝所提取純化的粗生物堿、粗多糖和粗黃酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性表現(xiàn)為粗生物堿>粗多糖，與郝蒙蒙的研究結(jié)果一致。查閱文獻，目前尚未有關(guān)于藥桑葉的α-葡萄糖苷酶動力學(xué)機制研究，本試驗基于α-葡萄糖苷酶-pNPG體外反應(yīng)體系探究了藥桑葉提取物不同活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制效果，并采用萊恩威弗-伯克(Lineweaver-Burk)模型對抑制活性較好的部位進行具體的酶動力學(xué)研究，將為藥桑葉的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥用開發(fā)提供試驗數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉采自新疆和田（79°92'E，37°12'N），由塔里木大學(xué)邱愛軍副教授鑒定為藥桑(Morus nigraL.)的植物葉。

阿卡波糖片(50 mg/片)，德國拜耳醫(yī)藥有限公司；α-葡萄糖苷酶（酵母源），江蘇瑞陽生物科技有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)、對硝基苯酚（p-Nitrophenol，PNP），上海麥克林生化科技有限公司；所有萃取使用的有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標分析儀(配有405 nm濾光片)，南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋(配有384個EP管插孔)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；CP224C電子天平，美國奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥桑葉各活性部位的制備

將采集的藥桑葉自然陰干后取5 kg碾碎，80%乙醇室溫浸提，間歇性攪拌，浸提3次，每次24 h，將所得濾液濃縮，真空冷凍干燥得到粘稠狀藥桑葉粗浸膏；取1 kg粗浸膏混懸于5 L蒸餾水中，按混懸液∶萃取劑為1∶1的比例，根據(jù)萃取劑極性由小到大的次序?qū)⒒鞈乙阂来屋腿?次，得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和剩余水相部位，真空冷凍干燥各萃取部位備用。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶的抑制活性篩選

結(jié)合微孔板法［10］，參照王賀［9］研究方法，以pNPG為底物的酶-抑制劑篩選模型略加改動，測定藥桑葉不同活性萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。本試驗設(shè)置空白組、實驗組以及背景組，其中實驗組包括阿卡波糖對照組，每組6孔。為使試驗結(jié)果更為可靠，調(diào)整各組濃度使其抑制率曲線均通過50%。剩余水相部位，粗浸膏，正丁醇萃取部位，阿卡波糖濃度梯度均為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL；乙酸乙酯萃取部位，石油醚萃取部位濃度梯度均為0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL。按照表1準確移取0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8)，適宜濃度梯度樣品（使抑制率曲線過IC50為宜），1.25 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液于1.5 mL EP管中后震蕩混勻，37℃溫育15 min后加入2 mmol/L pNPG，反應(yīng)20 min，加入0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。移取200 mL反應(yīng)終止液至96微孔板中于405 nm［11］處測定各吸光度值（A）。每個處理組各重復(fù)3次，取各組吸光度平均值代入公式（1）計算α-葡萄糖苷酶抑制率：

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系 μL

1.3.3 標準曲線的繪制

以α-葡萄糖苷酶-pNPG酶促體系有色產(chǎn)物PNP作標準曲線，分別取濃度為0 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL、80 μmol/mL、100 μmol/mL、200 μmol/mL、300 μmol/mL、400 μmol/mL、1 000 μmol/mL PNP溶液各 50 μL，加入 0.2 mol/L 的 Na2CO3400 μL，渦漩混勻，在405 nm下測定吸光度值，縱坐標為吸光度值，橫坐標為PNP濃度，分析可得線性回歸方程。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制作用動力學(xué)實驗

1.3.4.1 酶促反應(yīng)初速率時間范圍測定

按照1.3.2的方法測定2.0 mmol/L pNPG溶液在不同酶活力（0.8 U/mL、1.0 U/mL、1.2 U/mL、1.4 U/mL、1.6 U/mL、1.8 U/mL、2.0 U/mL）條件下的酶促反應(yīng)初速率。測定方法為每隔2 min測定一次反應(yīng)體系吸光度值，以酶反應(yīng)時間為橫坐標，PNP的吸光度值為縱坐標，使用Origin軟件進行擬合得到酶反應(yīng)進程曲線，擬合曲線中產(chǎn)物PNP勻速增加階段對應(yīng)的時間范圍即為酶的初速率時間范圍。

1.3.4.2 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶抑制類型的研究

在1.3.4.1測定的初速率時間范圍內(nèi)，考察剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶活力的影響，以酶活力為橫坐標，反應(yīng)初速率為縱坐標作圖，根據(jù)抑制動力學(xué)曲線特點判斷其可逆或不可逆抑制類型［12］。反應(yīng)體系中各物質(zhì)濃度為剩余水相部位0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，pNPG 2.0 mmol/L，α-葡萄糖苷酶0.8 U/mL、1.0 U/mL、1.2 U/mL、1.4 U/mL、1.6 U/mL、1.8 U/mL。

測定樣品濃度為0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，α-葡萄糖苷酶活力為1.8 U/mL，pNPG濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L、16 mmol/L的反應(yīng)初速率。以pNPG濃度的倒數(shù)為橫坐標，反應(yīng)初速率的倒數(shù)為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk曲線，通過二次作圖，得出剩余水相部位與α-葡萄糖苷酶的解離常數(shù)為KSI（抑制劑濃度與斜率作圖，所得直線與橫坐標交點的絕對值）及剩余水相部位與α-葡萄糖苷酶-底物復(fù)合物的解離常數(shù)為KII（抑制劑濃度與截距作圖，所得直線與橫坐標交點的絕對值），根據(jù)Lineweaver-Burk曲線特征及KSI、KⅡ大小判斷其具體抑制類型，分析其抑制作用機制。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Origin 2018及SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析及作圖，得到相應(yīng)的半抑制濃度（IC50），顯著性檢驗采用單因素方差分析（Duncan）法，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PNP標準曲線

使用Origin作圖并得到線性回歸方程y=0.054+0.855x，r2=0.999 4，如圖1所示。

圖1 PNP標準曲線

2.2 藥桑葉各活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性篩選

由圖2分析可知，藥桑葉各活性部位對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，在實驗濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度升高，抑制效果增強。

圖2 藥桑葉各活性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

由圖3可知，以IC50（抑制50%酶活性所需的抑制劑濃度，IC50值越小，抑制作用越強）為評判標準，藥桑葉不同活性部位的半抑制率表現(xiàn)為阿卡波糖萃取部位（0.214±0.020）mg/mL>剩余水相部位（0.394±0.030）mg/mL>正丁醇萃取部位(0.527±0.02)mg/mL>粗浸膏(0.532±0.038)mg/mL>石油醚萃取部位(0.736±0.051)mg/mL>乙酸乙酯萃取部位(1.17±0.051)mg/mL；除正丁醇萃取部位與粗浸膏無顯著差異外，其余各組抑制活性均差異顯著。其中，剩余水相部位的抑制活性最強，但弱于阿卡波糖。

圖3 藥桑葉各活性部位的半抑制率及顯著性分析

2.3 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制類型

根據(jù)2.2的篩選結(jié)果，剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較好，故針對此活性部位進行酶動力學(xué)研究，來闡明剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制機制。

2.3.1 酶活力初速度時間范圍確定

由圖4可知，0.8～2.0 U/mL酶活力的酶促反應(yīng)各進程曲線在4～14 min進行線性擬合，r2均達到0.999，呈勻速增加狀態(tài)，故確定初速率測定采樣時間范圍為4～14 min。

圖4 不同活力α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)進程曲線

2.3.2 剩余水相部位可逆或不可逆抑制類型的確定

由圖5可知，剩余水相部位濃度為0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL時，α-葡萄糖苷酶活力的抑制動力學(xué)曲線均通過原點，且0.4 mg/mL的剩余水相部位比0.0 mg/mL，0.2 mg/mL對應(yīng)的動力學(xué)曲線的斜率低，反應(yīng)初速率減小，可判斷剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶抑制類型為典型的可逆抑制。

圖5 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶活力的抑制動力學(xué)曲線

2.3.3 剩余水相部位競爭性、非競爭性、反競爭性和混合型抑制類型的確定

由圖6a可知在此實驗條件下，剩余水相部位濃度越高，其對應(yīng)的雙倒數(shù)曲線的橫截距越小，縱截距越大，所有直線在第二象限相交，可判斷該動力學(xué)曲線符合線性混合型抑制動力學(xué)曲線的特點［13］，抑制劑濃度增高，酶反應(yīng)的最大反應(yīng)速率（Vmax）降低（縱截距為），米氏常數(shù)（Km）升高。

由圖6b、圖6c可知，KSI為0.04 mg/mL，KII為0.29 mg/mL，KII>KSI，屬于混合型抑制中的競爭抑制作用大于非競爭抑制作用類型［14］，具體動力學(xué)參數(shù)如表2所示。根據(jù)此種抑制類型的底物-酶-抑制劑機理，分析可知剩余水相部位可同時通過兩種途徑來調(diào)控產(chǎn)物葡萄糖的產(chǎn)量，主要以與游離α-葡萄糖苷酶結(jié)合的方式來抑制α-葡萄糖苷酶對底物pNPG的水解，減少產(chǎn)物葡萄糖的生成；其次剩余水相部位也能與α-葡萄糖苷酶-底物復(fù)合物結(jié)合，延長產(chǎn)物葡萄糖的生成時間，從而可達到延緩血糖升高的目的。

圖6 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶具體抑制類型曲線分析結(jié)果

表2 剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗通過對藥桑葉各活性部位進行較為系統(tǒng)的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，結(jié)果表明：以IC50值為比較標準，對α-葡萄糖苷酶抑制活性大小為阿卡波糖>剩余水相部位>正丁醇萃取部位>粗浸膏>石油醚萃取部位>乙酸乙酯萃取部位；活性較強的剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為線性混合型抑制，且其競爭抑制作用大于非競爭抑制作用，表明藥桑葉剩余水相部位對α-葡萄糖苷酶的親和力比酶的正常底物pNPG大，主要是以與游離α-葡萄糖苷酶結(jié)合的方式來延緩α-葡萄糖苷酶對底物pNPG的水解。本試驗為擴大藥桑藥用部位及其藥用資源的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

前人對藥桑的研究主要集中在藥桑葚、藥桑枝、藥桑葉中的乙酸乙酯相與正丁醇相的研究，通過本試驗初步探究得知藥桑葉醇提浸膏經(jīng)萃取液依次萃取后的剩余水相部位體外α-葡萄糖苷酶抑制效果較好，有必要進一步探究其生物活性物質(zhì)的具體化學(xué)成分，研究主要的α-葡萄糖苷酶抑制活性單體化合物及化合物之間的協(xié)同效應(yīng)，并進行體內(nèi)降血糖實驗，以期制備出純度高、效果佳、用量少的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑。