官凌燕 吳志勇 邱佩綿

血紅蛋白病是具有遺傳性的溶血性疾病，也是人類(lèi)最常見(jiàn)的孟德?tīng)栠z傳病之一，分為異常血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）和地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)地貧）兩大類(lèi)。異常Hb 和地貧均是由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，前者導(dǎo)致珠蛋白肽鏈分子結(jié)構(gòu)異常，而后者導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成不足或者不能夠合成［1］。血紅蛋白E 病是一種β-地中海貧血樣的血紅蛋白病，它的表型可從無(wú)癥狀到嚴(yán)重癥狀，屬于β+-地貧［2］。血紅蛋白E 病存在明顯的地域性差異，在東南亞和我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)［3-4］。國(guó)內(nèi)對(duì)血紅蛋白E 病系統(tǒng)、詳細(xì)的大規(guī)模血液學(xué)特征與基因型的研究資料極少［5］，現(xiàn)階段也未見(jiàn)關(guān)于惠州地區(qū)血紅蛋白E 病血液學(xué)特征的詳細(xì)報(bào)道。本研究通過(guò)大數(shù)據(jù)分析惠州地區(qū)血紅蛋白E 病患者的基因型與血液學(xué)特征，為疾病篩查和產(chǎn)前診斷以及遺傳咨詢(xún)提供臨床參考資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年4 月至2021 年10 月在惠州市中心人民醫(yī)院和惠州市第一婦幼保健院進(jìn)行地貧基因檢測(cè)的標(biāo)本共114 902 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：選擇經(jīng)檢測(cè)確診為Hb E 病的546 例患者作為研究對(duì)象。其中男246 例，平均年齡（28.96±8.52）歲；女300 例，平均年齡（26.72±6.57）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除年齡＜2 歲的患者。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，所有受試者或其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑

日本希森美康公司XE-5000 血細(xì)胞分析儀，法國(guó)Sebia 公司Capillarys 2 型全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀，廣州達(dá)安基因股份有限公司Smart32 型核酸提取儀，美國(guó)BIO-RAD 公司S1000 PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)Luminex 公司Magpix 多功能液態(tài)懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)，廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司HB-2012A 醫(yī)用核酸分子雜交儀。血常規(guī)及電泳試劑均為儀器配套；全基因組DNA 提取試劑盒、地中海貧血（α/β型）基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于廣州達(dá)安基因股份有限公司；α-和β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

采集待檢者的靜脈血兩管（2 mL/管），一管以EDTA-K2抗凝，用于血常規(guī)分析和地貧基因分析；一管以ACD 抗凝，用于血紅蛋白電泳分析。

1.3.2 血液學(xué)分析

使用XE-5000 血細(xì)胞分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞參數(shù)，主要觀察指標(biāo)為血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）；使用Capillarys 2 型全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀分析血紅蛋白組分及含量，主要觀察指標(biāo)為血紅蛋白A2（hemoglobin A2，Hb A2）、血紅蛋白F（hemoglobin F，Hb F）和異常血紅蛋白E（hemoglobin E，Hb E）。

1.3.3 DNA 提取

使用Smart32 型核酸提取儀配套使用全基因組DNA 提取試劑盒提取全血DNA。

1.3.4 地貧基因分析

獲取的全血DNA 使用地中海貧血（α/β 型）基因檢測(cè)試劑盒與α-和β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒，分別采用PCR-流式熒光雜交技術(shù)與導(dǎo)流雜交技術(shù)進(jìn)行地貧基因分析，檢測(cè)中國(guó)人常見(jiàn)的3 種缺失型α 地貧（--SEA、-α3.7、-α4.2）和3 種非缺失型α 地貧（αCSα、αQSα、αWSα）以及17 種β 地貧［CD14-15、CD17、CD26（βE）、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、-28、-29、-30、-32、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、Initiation codon、Cap+40-43］，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)和儀器操作使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用n或（%）表示；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惠州客家地區(qū)Hb E 病的發(fā)生率及基因型分布

在114 902 例外周血地貧基因檢測(cè)樣本中，共檢測(cè)出Hb E 546 例，人群發(fā)生率為0.475%（546/114 902）。研究中共檢出15 種基因型，其中以Hb E 雜合子分布居多，占84.80%，Hb E 合并SEA 雜合子次之，占7.88%。見(jiàn)表1。

表1 惠州客家地區(qū)Hb E 病的發(fā)生率及基因型分布Table 1 The incidence and genotype distribution of Hb E disease in Huizhou Hakka area

2.2 血液學(xué)特征

2.2.1 輕型Hb E 病患者的血液學(xué)參數(shù)

按基因突變類(lèi)型分為3 組，分別為αα/αα，βE/ βN組、α+/αα，βE/ βN組和α0/αα，βE/ βN組。其535 例輕型Hb E 病患者均表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血，Hb E 含量隨著合并α-珠蛋白基因突變個(gè)數(shù)的增多而減少。見(jiàn)表2。

表2 535 例輕型Hb E 病患者的血液學(xué)參數(shù)（±s）Table 2 The hematological parameters of 535 patients with mild Hb E disease（±s）

表2 535 例輕型Hb E 病患者的血液學(xué)參數(shù)（±s）Table 2 The hematological parameters of 535 patients with mild Hb E disease（±s）

注：α+/αα：1 個(gè)α-珠蛋白基因發(fā)生突變；α0/αα：2 個(gè)α-珠蛋白基因發(fā)生突變。

基因型αα/αα，βE/βN α+/αα，βE/βN α0/αα，βE/βN n 463 28 44 Hb（g/L）129.53±17.82 127.09±20.56 123.46±19.91 MCV（fL）76.91±4.42 79.84±5.73 69.52±5.93 MCH（pg）25.37±1.68 26.15±2.23 22.05±2.11 Hb A2（%）3.42±0.39 3.63±0.42 3.66±0.42 Hb E（%）24.17±2.85 22.42±2.28 16.18±2.03

2.2.2 中重型Hb E 病患者的血液學(xué)特征

Hb E 合并Hb H 病，均表現(xiàn)為輕度貧血，未檢出異常Hb H，Hb A2含量小于3.5%，Hb E 含量在10%左右。Hb E 復(fù)合β-28表現(xiàn)為輕至中度貧血，Hb A2含量均大于5%，Hb E 含量在50%左右，而Hb E 復(fù)合β-28合并α-地貧時(shí)表現(xiàn)為輕度貧血。Hb E 復(fù)合βCD41-42與Hb E 復(fù)合βIVS-Ⅱ-654均表現(xiàn)為重型β-地貧，Hb F 明顯升高，含量大于50%。11例中重型Hb E 病患者的血液學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 11 例中重型Hb E 病患者的血液學(xué)特征Table 3 The hematological characteristics of 11 patients with intermediate or major Hb E disease

2.3 三組Hb E 病患者之間的血液學(xué)參數(shù)比較

采用單因素方差分析對(duì)表2 中的3 組基因型患者的血液學(xué)參數(shù)進(jìn)行兩兩比較，具各組間的Hb 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。其余各血液學(xué)參數(shù)比較的箱線圖見(jiàn)圖1。各組間的MCV 與Hb E 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，各組Hb E 含量的原始數(shù)據(jù)分布最集中。

表4 3 組Hb E 病患者之間的血液學(xué)參數(shù)比較分析Table 4 Comparison and analysis of hematological parameters in three groups of Hb E patients

圖1 3 組Hb E 病患者之間的血液學(xué)參數(shù)比較分析Figure 1 Comparison and analysis of hematological parameters in three groups of Hb E patients

3 討論

血紅蛋白E 病是一種β-地中海貧血樣的血紅蛋白病，它的致病機(jī)制是β-珠蛋白基因的第26位密碼子發(fā)生基因突變，致使谷氨酸（Glutamic acid，Glu）變成賴(lài)氨酸（Lysine，Lys），由于堿基替代，β-珠蛋白基因mRNA 的前體在加工過(guò)程出現(xiàn)了異常，從而導(dǎo)致β-珠蛋白肽鏈合成不足且血紅蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生異常［6］。有研究報(bào)道，雖然我國(guó)的異常Hb 多對(duì)人體無(wú)影響，但若Hb E 合并β-地貧可表現(xiàn)為中重度貧血，再合并α-地貧時(shí)可減輕相應(yīng)癥狀［7］。

本研究對(duì)惠州客家地區(qū)血紅蛋白E 病患者的基因型與血液學(xué)特征進(jìn)行了分析，在114 902 例受檢患者樣本中，共檢出546 例Hb E 病患者，人群發(fā)生率為0.475%，高于廣東信宜地區(qū)（0.398%）［8］和深圳地區(qū)（0.105%）［9］，低于云南地區(qū)（1.1%）［10］。Hb E 雜合子患者表現(xiàn)為輕微小細(xì)胞低色素性貧血，合并α+-地貧時(shí)表型有所緩解，αα/αα，βE/βN組與α+/αα，βE/βN組比較，MCV 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Hb 與MCH 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是由于突變的α-與β-珠蛋白基因?qū)е娄?鏈與β-鏈合成量均減少，得以重新保持相對(duì)平衡造成的；而合并α0-地貧時(shí)表現(xiàn)為明顯的小細(xì)胞低色素性貧血，符合典型α0-地貧的紅細(xì)胞特征，αα/αα，βE/βN組與α0/αα，βE/βN組比較，MCV 與MCH 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于α0-地貧導(dǎo)致α-鏈合成量過(guò)少，而β-鏈相對(duì)過(guò)剩致使α/β-鏈?zhǔn)Ш庠斐傻?。以上研究結(jié)果表明Hb E 雜合子患者合并α+-地貧時(shí)表型有所緩解，而合并α0-地貧時(shí)表型不能被緩解。綜上，Hb E 雜合子患者的紅細(xì)胞特征表現(xiàn)為介于α+-地貧與α0-地貧的特征，如同αQSα，具有低MCV與低MCH 的特征［11］，行血紅蛋白電泳檢測(cè)可以進(jìn)一步鑒別。研究表明［12］，在篩查血紅蛋白E 病上，毛細(xì)管電泳法要優(yōu)于高效液相色譜法，不僅能將Hb E 與Hb A2條帶分離，還能對(duì)其準(zhǔn)確定量。此外，本研究表明，第一，Hb E 雜合子無(wú)論是否合并α+-地貧或α0-地貧，其Hb A2含量均在3.5%這個(gè)臨界值左右（參考范圍2.5%≤Hb A2≤3.5%），與蘇恒學(xué)等［13］的研究一致。第二，異常Hb E 含量隨著合并α-珠蛋白基因突變個(gè)數(shù)的增多而減少，且結(jié)合圖1 可看出各組Hb E 含量的原始數(shù)據(jù)分布較為集中，這是由于突變的α-珠蛋白基因?qū)е娄?鏈合成量減少，造成變異的β-鏈與α-鏈合成減少，即Hb E合成減少。

在本研究的11 例中重型Hb E 病患者中，有2例Hb E 病合并Hb H 病，均表現(xiàn)為輕度貧血，未檢出異常Hb H，但MCV 和MCH 極低，說(shuō)明Hb E 病合并Hb H 病可能是由于3 個(gè)α-珠蛋白基因突變導(dǎo)致α-鏈合成嚴(yán)重不足，而Hb E 病導(dǎo)致β-鏈合成也減少，同時(shí)生成異常Hb E，既緩解了α/β-鏈的嚴(yán)重失衡，在低水平保持相對(duì)平衡，又無(wú)過(guò)多的β-鏈得以合成β 四聚體，即異常Hb H，與官志揚(yáng)等［14］的研究結(jié)果相似。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15］，這種復(fù)合型也稱(chēng)為AE Bart's 病。

值得注意的是，Hb E 復(fù)合β-28本是中間型β-地貧，患有該基因型的患兒在特定的情況下需偶爾輸血［16］，而當(dāng)Hb E 復(fù)合β-28合并α-地貧時(shí)表現(xiàn)為輕度貧血，表明α-地貧可以緩解中間型β-地貧，若診斷出孕婦所懷胎兒的地貧基因?yàn)樵摶蛐?，則可以建議該孕婦繼續(xù)妊娠。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［17-18］，Hb E 復(fù)合βCD41-42以及Hb E 復(fù)合βIVS-Ⅱ-654的患者臨床表型個(gè)體差異大，既可表現(xiàn)為中間型，也可表現(xiàn)為重型，而本研究的這兩例患者均表現(xiàn)為重型β-地貧，依賴(lài)輸血，Hb F 含量明顯升高，大于50%，無(wú)Hb A 和Hb A2合成。

綜上，廣東省惠州市位于我國(guó)南方地區(qū)并且聚集客家人，有高攜帶風(fēng)險(xiǎn)，且人群攜帶率高達(dá)16.82%［19］。而惠州地區(qū)Hb E 病發(fā)生率較高，本研究分析比較了血紅蛋白E 病患者基因型與表型的相關(guān)性，不僅能為疾病篩查提供參考數(shù)據(jù)以及指導(dǎo)臨床醫(yī)生為患者提供遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷，還能完善惠州地區(qū)的地貧防控工作。