陳紅雨,徐世駿,孫振國,張浩,余燕,馬金友

（1.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)453003;2.華蘭生物工程股份有限公司,河南 新鄉(xiāng) 453003）

綠茶是我國重要的經(jīng)濟作物之一,產(chǎn)量居世界首位.主要的有機成分為茶多酚（20%～35%）、咖啡堿（3%～5%）、蛋白質(zhì)（20%～30%）、糖類（20%～25%）以及少量氨基酸等[1].研究表明,綠茶在免疫系統(tǒng)中具有多種功效.它可以通過間接上調(diào)抗氧化酶的活性或直接作為助氧化劑促使氫過氧化物、羥基以及超氧陰離子的形成而發(fā)揮抗氧化功能[2-3];有報道表明,綠茶粉和茶多酚作為飼料添加劑均可以顯著提高蛋雞血清中超氧化物歧化酶和谷胱苷肽過氧化物酶活性[4];綠茶還能使肉雞肝臟中的總抗氧化能力增強[5].綠茶還是天然的免疫調(diào)節(jié)劑.L- 茶氨酸被腸道吸收后的產(chǎn)物乙胺能夠促進(jìn)受病原攻擊后T 淋巴細(xì)胞的增殖[6].日糧中添加不同劑量的茶多酚可以顯著提高肉雞的胸腺指數(shù)、血清中免疫球蛋白IgG 含量以及T- 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與白細(xì)胞吞噬率[7-8].飼糧中添加英山云霧綠茶多糖綴合物提高了胸腺和法氏囊質(zhì)量和血清中IgA 和IgG 濃度[9].此外,綠茶還具有廣譜抗菌能力,它能通過干擾病原菌的代謝過程抑制自然界大多數(shù)病原細(xì)菌[5].

綠茶作為一種有著悠久歷史的飲料,其安全性毋庸置疑.然而,近年來陸續(xù)有報道指出,綠茶及綠茶提取物可能會對動物和人類產(chǎn)生毒害作用.綠茶中的咖啡因被列入國家管制精神藥品范圍.EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）作為綠茶中含量最豐富且活性最強的物質(zhì),其急性、亞急性、亞慢性、慢性毒性試驗以及臨床病例都有報道[11].EGCG 單次腹腔注射為100～125 mg/kg 可造成肝毒性,為150～200 mg/kg 造成部分大鼠死亡.為500 mg/kg EGCG 在反復(fù)飼喂禁食的狗導(dǎo)致部分死亡,經(jīng)檢查顯示肝壞死[12].給CF-1 小鼠禁食灌胃2 d 為750 mg/kg EGCG 即造成嚴(yán)重的肝毒性[13].而且,綠茶衍生制劑的實驗室研究也揭示了高劑量綠茶制劑的毒性作用.比格犬口服TeavigoTM為500 mg/kg 可引起近端小管壞死和血清膽紅素升高.給大鼠灌胃為2 000 mg/kg TeavigoTM可導(dǎo)致80%的死亡率[12].可見,綠茶發(fā)揮活性的劑量離其毒性劑量并不遙遠(yuǎn)[11].

目前,為了避免浪費,大量制茶過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品如茶碎等被用來當(dāng)作飼料添加劑[14].所以,綠茶作為養(yǎng)殖業(yè)飼料添加劑探索其合適的添加量很有必要.目前對于綠茶負(fù)面作用的研究都是在嚙齒動物和犬上進(jìn)行,而對于雛雞的研究鮮有報道.肝臟是動物體內(nèi)以代謝為主的器官,也是重要的解毒器官.因此,本研究在雛雞飼養(yǎng)過程中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綠茶碎水提物,研究其對肝臟的損害作用,以期在養(yǎng)雞業(yè)中添加綠茶碎提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠茶碎購自河南信陽,雛雞購買于新鄉(xiāng)市古固寨孵化場.

1.2 動物飼養(yǎng)與取材

60 只1 d 齡健康817 雛雞分六組,每組10 只,分別為對照組（C 組）,自由飲水?dāng)z食;T1 組,自由攝食,每天自由飲用10%綠茶碎水提物;T2-T5 組,自由飲水?dāng)z食,但每天清晨分別灌服含量1 mL/50 g 體質(zhì)量10.00%、5.00%、2.50%和1.25%綠茶碎水提物,每天觀察各組雛雞的精神狀態(tài)和攝食飲水情況.雛雞若死亡,立馬取肝臟,PBS 沖洗后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中保存?zhèn)溆? 飼喂7 d 后, 全部雛雞腹腔注射戊巴比妥鈉（1μg/1g）麻醉后,頸椎脫臼法處死,取肝臟,PBS 洗去血污后固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中備用.

1.3 試驗方法

1.3.1 石蠟切片、HE 染色將固定好的組織進(jìn)行石蠟包埋,用石蠟切片機切成4 μm 切片,切片脫蠟復(fù)水后經(jīng)過蘇木精- 伊紅染色,尼康顯微攝影系統(tǒng)拍照并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察.

1.3.2 Masson 染色試驗 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后按試劑盒說明進(jìn)行操作（Masson 染色采用試劑盒購自南京建成科技有限公司）.

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察

T1 組和C 組雛雞生存比較如圖1所示.

圖1 T1 組和C 組雛雞生存比較Fig.1 Comparison of chick survival in T1 group and C group

T1 組雛雞,第1 天和第2 天精神亢奮,第3 天開始精神沉郁,腹瀉,采食量和飲水量明顯減少,第4 天有個別雛雞死亡,隨后每天雛雞死亡數(shù)量逐漸增加,直至第7 天雛雞全部死亡.T2 組雛雞1～7 d 精神狀態(tài)良好,采食量和飲水量正常,第4 天出現(xiàn)輕微腹瀉,直到第7 天仍腹瀉,但存活率為100%.C 組和T3-T5 組雛雞,1～7 d 精神狀態(tài)良好,采食量和飲水量正常,存活率為100%.

2.2 綠茶碎水提物對雛雞肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

不同處理組雛雞肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示.

圖2 不同處理組雛雞肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Liver histological structure of chickens in different treatment groups

由圖2可知,與空白組相比,T1 組雛雞肝臟中央靜脈充血且血液中淋巴細(xì)胞急劇增多,肝索結(jié)構(gòu)紊亂、肝竇不明顯,低倍鏡下觀察到大片淡粉色區(qū)域,高倍鏡觀察為胞質(zhì)淡染、胞核消失,為壞死灶;T2 組雛雞肝臟肝索和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰,但出現(xiàn)個別肝細(xì)胞水腫和局灶性壞死;T3、T4 和T5 組雛雞肝臟沒有明顯變化.

2.3 綠茶碎水提物對雛雞肝臟纖維增生的影響

肝臟Masson 染色如圖3所示.

圖3 肝臟Masson 染色Fig.3 Masson staining of the liver

由圖3可知,與空白組雛雞肝臟相比,T1 組肝索中有大量染成藍(lán)色的纖維增生,T2 組肝小葉有輕微纖維增生,T3、T4 和T5 組肝臟無顯著變化.

3 結(jié)論與討論

在臨床觀察中,空白組和低質(zhì)量分?jǐn)?shù)綠茶碎水提物組對雛雞無顯著影響,高質(zhì)量分?jǐn)?shù)且大劑量會導(dǎo)致雛雞精神先興奮后萎靡,腹瀉甚至死亡,這可能和綠茶碎水提物中的一些成分有關(guān).先前的研究已經(jīng)報道,咖啡因的一些代謝產(chǎn)物可以通過血腦屏障,不但影響動物精神狀況,甚至還會對動物多個系統(tǒng)產(chǎn)生不同的毒性作用,例如,可以引起心率失常、無規(guī)則的肌肉活動、骨質(zhì)疏松癥、增加心臟病患者的心臟病發(fā)機率等[15].有研究用含曲茗綠茶量為10.9 g/kg、9.0 g/kg 灌胃小鼠,在20 min 后,小鼠均出現(xiàn)活動減少,呆滯,閉眼,萎靡不食,抽搐,強直震顫等表現(xiàn),并在3～10 h 左右出現(xiàn)死亡高峰期,10～14 h 出現(xiàn)第二個死亡高峰期[16].臨床上發(fā)現(xiàn)口服高劑量綠茶多酚提取物也出現(xiàn)副作用,例如肝中毒、惡心、腹痛和腹瀉等,已被美國食品和藥物管理局確認(rèn)為肝毒性靶點[11].

在肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)觀察中,T1、T2 組雛雞相比于對照組肝臟發(fā)生了損傷, 說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綠茶碎水提物有肝毒性,這與肝臟是綠茶毒性靶點的研究結(jié)果一致[11].也有研究顯示,每日單劑量EGCG1 500mg/kg可使雄性CF-1 小鼠血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）增加138 倍,降低存活率85%.每日一次EGCG 可增加肝毒性反應(yīng).每日兩次750 mg/kg EGCG 劑量,血漿ALT 水平增加184 倍.口服EGCG 后觀察到中度至重度肝壞死.EGCG 的肝毒性與氧化應(yīng)激有關(guān),包括肝臟脂質(zhì)過氧化（增加5 倍）、血漿8- 異前列腺素（增加9.5 倍）以及肝臟金屬硫蛋白和c- 組蛋白2AX 表達(dá)增加.EGCG 還能增加血漿白細(xì)胞介素-6 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1 的含量[13].

在肝臟Masson 染色試驗中,T1 組肝臟出現(xiàn)大片纖維增生,T2 組有輕微纖維增生,說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綠茶碎水提物造成雛雞肝臟纖維的增生.肝纖維增生是肝細(xì)胞壞死并發(fā)生炎癥刺激時,肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增殖和降解失衡的病理過程,導(dǎo)致肝臟中纖維結(jié)締組織異常沉積,它包括了肝細(xì)胞的凋亡、間充質(zhì)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)中I 型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的沉積等[17-18].據(jù)推測,當(dāng)肝細(xì)胞經(jīng)歷凋亡時,產(chǎn)生凋亡小體,這些凋亡小體被肝巨噬細(xì)胞,HSC（星狀細(xì)胞）和肝細(xì)胞吞沒,導(dǎo)致各種趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,例如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2（MIP-2）和TGF-β,這反過來又激活HSC 并導(dǎo)致肝纖維增生.正常肝臟對損傷的初始反應(yīng)是肝細(xì)胞再生,如果肝臟細(xì)胞再生被阻斷將導(dǎo)致肝臟纖維化[19-21].在游離脂肪酸、內(nèi)毒素和高血糖等毒性作用下,肝細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素P450ⅡE1 的表達(dá)升高,肝細(xì)胞內(nèi)自由基顯著增加,自由基可以氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì),從而改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和流動性,也可以使亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)膜上的多聚不飽和脂肪酸過氧化,細(xì)胞部分功能喪失甚至死亡,肝臟發(fā)生損傷.脂質(zhì)過氧化終結(jié)產(chǎn)物丙二醛（MDA）與HSC 的NH2交聯(lián)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞（ENC）的分泌,同時MDA 可與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白交聯(lián),活化HSC 自分泌和旁分泌TGF-β 和PDGF 因子而引起肝纖維化的啟動,促進(jìn)膠原纖維的合成、沉積、肝纖維增生形成[17].在世界范圍內(nèi),器官組織纖維增生是引起疾病致殘、致死的一個主要原因,主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多,實質(zhì)細(xì)胞減少,持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退,乃至衰竭,嚴(yán)重威脅動物健康和生命.盡管EGCG 歷來被認(rèn)為是一種抗氧化劑,在體外具有很強的自由基清除活性,但越來越多的數(shù)據(jù)表明,EGCG 的一些生物活性是由于氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)[22]. 添加超氧化物歧化酶可以穩(wěn)定EGCG,防止EGCG 介導(dǎo)的活性氧的形成,從而抑制了這種作用,這表明它主要是由EGCG 介導(dǎo)的活性氧的形成而不是EGCG 本身驅(qū)動的.Galati 等[23]發(fā)現(xiàn)EGCG 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能在EGCG 的毒性潛能中發(fā)揮作用.在用EGCG 處理新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞后,通過熒光增加測量觀察到細(xì)胞毒性和活性氧形成的時間依賴性增加.發(fā)現(xiàn)高劑量EGCG 具有毒性特征,尤其是肝毒性,并闡明其毒性特征歸于其促氧化作用.由此推斷高劑量綠茶碎水提物對雛雞肝臟產(chǎn)生促氧化作用,從而產(chǎn)生更多的自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死,脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA 引起一系列反應(yīng),肝細(xì)胞膠原纖維增生,肝臟纖維增生引起雛雞疾病乃至死亡.

有研究表明,EGCG 在大鼠中未觀察到的不良反應(yīng)水平的最高劑量為每日500mg/kg.該值與預(yù)先喂食的狗的無不良反應(yīng)水平相同[12].楊賢強等[24]急性毒性試驗結(jié)果顯示小鼠灌胃茶多酚的半數(shù)致死量含量LD50＝2 496±326 mg/kg.按照2 400 mg/kg 進(jìn)行計量換算,小鼠和成人之比為9.01∶1,雛雞和成人之比為2 或3∶1,這里取2∶1,而且茶葉干質(zhì)量中茶多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%[25],得出雛雞的半數(shù)致死量含量LD50≈2 220 mg/kg.按照EGCG 灌服大鼠的安全劑量每日500mg/kg 來計算,大鼠和成人劑量換算比為6.3∶1,表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）,約占總兒茶素的59%,兒茶素約占多酚總量的70%～80%[26];所以,雛雞飲用綠茶的安全劑量約為每日1 401mg/kg 換算后, 本試驗采用的劑量為:T2 組為每日2 220mg/kg,T3 組為每日1 110 mg/kg,T4 組為每日555mg/kg,T5 組為每日277.5mg/kg.本研究結(jié)果顯示T2 組和T3 組肝臟病變存在明顯差異,T2 組肝臟病理學(xué)觀察有肝毒性,T3 組與空白組結(jié)果更接近,說明EGCG 發(fā)揮活性的劑量離其毒性劑量并不遙遠(yuǎn),因此雛雞飼養(yǎng)中添加含綠茶副產(chǎn)品的劑量應(yīng)低于2 220 mg/kg.此研究為生產(chǎn)中安全添加綠茶副產(chǎn)品提供了參考.