王重鈺，倪桂蓮，翟 暉，陳 浩，陳嘉宜，朱孫煒，吳仲敏，胡偉玲

（1.臺州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 臺州 318000；2.臨海市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 臨海 317000）

0 引言

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（Post-Traumatic Stress Disorder,PTSD）是生物個體在遭受意外突發(fā)的重大創(chuàng)傷性事件后，延遲發(fā)生且持續(xù)呈現(xiàn)的精神心理疾病，其核心癥狀表現(xiàn)為對創(chuàng)傷事件的闖入性再體驗、對創(chuàng)傷相關(guān)線索的持續(xù)回避及對周邊環(huán)境的過度警覺等，給個體造成極大的痛苦［1］。已有的研究顯示：PTSD的發(fā)生與海馬組織IL-6、BDNF含量的改變密切相關(guān)，高水平IL-6介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）的低水平表達導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的再生抑制，可能是PTSD發(fā)生的重要機制之一［2］。然而，有關(guān)PTSD的發(fā)病機制至今尚不明確，在臨床上缺乏根治藥物。槲皮素（Quercetin，QUE）是一種黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，同時參與焦慮、抑郁樣行為的調(diào)節(jié)［3-4］，但至今鮮見有關(guān)QUE改善PTSD樣行為的相關(guān)研究報道。本文在傳統(tǒng)的連續(xù)單一應(yīng)激（SPS）刺激造模基礎(chǔ)上聯(lián)合足底電刺激（S）方法制作PTSD大鼠模型，觀察QUE對模型大鼠PTSD樣行為的調(diào)節(jié)作用以及海馬IL-6和BDNF表達的影響，為揭示中藥防治PTSD的中樞機制以及尋求藥物干預(yù)的精準靶點提供可借鑒的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物、試劑和儀器設(shè)備

QUE（貨號：Q8010）由 Solarbio 公司提供；免抗大鼠 BDNF（貨號：A1307）由 ABclonal公司提供；免疫印跡相關(guān)試劑以及ELISA試劑盒均由Elabscience公司提供；RIPA裂解液和BCA試劑盒由碧云天生物技術(shù)有限公司提供；曠場實驗、高架十字迷宮實驗設(shè)備由上海吉量軟件科技有限公司提供。

1.2 實驗動物及分組

健康成年SD大鼠，雄性，6周齡，SPF級，體重（180±30）g，由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號為20210421Aazz0619999987，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2021-0013。大鼠每籠5只飼養(yǎng)（濕度：40%±60%，12 h黑暗/白晝交替循環(huán)，自由飲水進食），適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后采用完全隨機方法分成對照組、PTSD組、QUE組，每組30只。本實驗經(jīng)過臺州學(xué)院動物倫理委員會批準。

1.3 大鼠PTSD模型構(gòu)建及干預(yù)方法

采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊相結(jié)合方法構(gòu)建PTSD大鼠模型，具體流程為：①束縛：將大鼠固定于定制的大鼠固定器內(nèi)2 h。②強迫游泳：將大鼠放入圓形有機玻璃缸中，缸內(nèi)盛水，水深40 cm，水溫25℃，持續(xù)游泳20 min。③麻醉：將大鼠置于密閉且裝有乙醚浸濕棉球的玻璃缸內(nèi)，至大鼠失去知覺后取出。④電擊：大鼠蘇醒30 min后，把大鼠放于自制的電擊箱內(nèi)，適應(yīng)196 s后給予足底電擊，電擊電流為0.8 mA，每次持續(xù)通電10 s，間歇10 s，共計15個循環(huán)周期。上述操作結(jié)束后將大鼠放回原鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。

造模完成后，QUE組大鼠灌服QUE（50 mg/kg，溶于生理鹽水）；對照組和模型組大鼠灌服生理鹽水，各組給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，分別在實驗的第7 d和第14 d觀察干預(yù)效果。

1.4 曠場實驗

在造模后的第7和14 d分別進行曠場實驗。曠場箱的底面有16個方格，其中位于底面中心的4個正方格為中央格，位于中央格四周的12個正方格為外周格。實驗時將大鼠放在底面正中格中央，攝像頭安放在中央格正中上方，自動記錄大鼠在曠場箱5 min內(nèi)的探索次數(shù)，探索次數(shù)=后肢直立次數(shù)+穿越中央格次數(shù)。

1.5 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮由一個開放臂和一個閉合臂彼此十字交接相連而成，離地面約40 cm，二臂交接區(qū)為中心平臺。實驗開始時，將大鼠放于中心平臺中央，頭朝向閉臂區(qū)，觀察5 min內(nèi)大鼠進入開臂區(qū)和閉臂區(qū)的累計次數(shù)和時間，分析大鼠進入開臂區(qū)的次數(shù)和在開臂區(qū)的停留時間分別占進入開、閉臂區(qū)總次數(shù)和在開、閉臂區(qū)停留總時間的百分比。用焦慮指數(shù)衡量大鼠的焦慮程度，焦慮指數(shù)=1?（1/2）×（進入開臂區(qū)的次數(shù)/進入開、閉臂區(qū)的總次數(shù)）+（1/2）×（在開臂區(qū)的停留時間/在開、閉臂區(qū)停留的總時間）。

1.6 海馬組織Nissl、HE染色

隨機取每組5只大鼠，經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉后，開胸經(jīng)左心室向主動脈內(nèi)插管，快速灌注生理鹽水150 mL，接著灌注多聚甲醛作腦組織內(nèi)固定，固定結(jié)束后立即開顱取腦；選擇海馬區(qū)域作石蠟包埋，石蠟切片機連續(xù)切片，每張片厚5 μm，切片分2套，1套做Nissl染色，另1套做HE染色，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 海馬組織BDNF蛋白水平檢測

行為學(xué)測試結(jié)束后，每組另取5只大鼠，深麻醉后，斷頭取新鮮海馬組織，冰浴提取總蛋白，按BCA檢測試劑盒要求測定蛋白濃度。取30 μg樣品蛋白，常規(guī)完成電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入BDNF一抗或GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色劑曝光，以BDNF條帶的灰度值與對應(yīng)的GAPDH條帶灰度值比值代表BDNF蛋白的相對表達量。

1.8 海馬組織IL-6含量檢測

取各組余下的5只大鼠，依上述方法提取新鮮海馬組織，稱重后將海馬組織移入玻璃勻漿器中進行充分研磨，得到組織勻漿液，經(jīng)離心后吸取上清液。后續(xù)的檢測步驟按照IL-6 ELISA檢測試劑盒流程要求進行IL-6含量測定。

1.9 海馬組織IL-6含量和BDNF蛋白水平與行為學(xué)指標值之間的相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)分析方法，分析各組大鼠海馬組織IL-6、BDNF含量和大鼠探索次數(shù)以及焦慮指數(shù)之間的相關(guān)性，用相關(guān)系數(shù)（r）表示對應(yīng)數(shù)值之間的相關(guān)程度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)值以均數(shù)±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析或重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)性分析方法分析海馬組織IL-6含量和BDNF蛋白水平與行為學(xué)指標值之間的相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)r值表示兩個參數(shù)的相關(guān)性，r的絕對值越接近1表示兩者相關(guān)性越強。

2 結(jié)果

2.1 QUE對大鼠PTSD樣行為的調(diào)節(jié)作用

2.1.1 QUE對大鼠探索能力的影響

如圖1所示，PTSD 7 d組和14 d組大鼠在曠場箱內(nèi)的直立次數(shù)（圖1A）、穿越中央格次數(shù)（圖1B）和探索次數(shù)（圖1C）均明顯少于同時段Control組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；QUE組大鼠在曠場箱內(nèi)的直立次數(shù)（圖1A）和探索次數(shù)（圖1C）明顯多于PTSD組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；穿越中央格次數(shù)（圖1B）略多于PTSD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 QUE對PTSD大鼠大鼠探索能力的影響（n=15）

2.1.2 QUE對大鼠焦慮樣行為的影響

如圖2所示，PTSD 7 d組和14 d組大鼠在開臂內(nèi)停留時間百分比（圖2A）、進入開臂次數(shù)百分比（圖 2B）均明顯低于同時段 Control組（P<0.01），而焦慮指數(shù)（圖 2C）明顯高于同時段 Control組（P<0.01）；和PTSD組相比，QUE組大鼠在開臂內(nèi)停留時間百分比（圖2A）、進入開臂次數(shù)百分比（圖2B）均顯著增加（P<0.01），焦慮指數(shù)（圖 2C）則明顯降低（P<0.01）。

圖2 QUE對PTSD大鼠焦慮樣行為的影響（n=15）

2.2 QUE對海馬組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，海馬組織HE染色（圖3A）結(jié)果顯示，Control組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)清楚，神經(jīng)元輪廓清晰，排列規(guī)則，染色均勻，胞體飽滿，尼氏小體豐富,核仁深染、清晰，核膜完整；PTSD組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元數(shù)量減少，排列紊亂，細胞染色不均，外形不規(guī)則，核固縮現(xiàn)象明顯；QUE組大鼠神經(jīng)元數(shù)量較PTSD組增加，神經(jīng)元排列趨向整齊，核固縮現(xiàn)象減少。Nissl結(jié)果（圖3B）顯示，PTSD組大鼠海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏小體顯著減少，出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，QUE組大鼠海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏小體增多，空泡樣結(jié)構(gòu)減少。

圖3 大鼠海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和分布（標尺=50 μm，n=5）

2.3 QUE對海馬組織IL-6含量的影響

如圖4所示，ELISA檢測結(jié)果顯示，實驗第7、14 d時PTSD組大鼠海馬組織IL-6含量（pg/mL，均數(shù)±標準差，n=5）均較同時段Control組顯著升高（P<0.01）；QUE組IL-6含量均低于同時段 PTSD組（P<0.01）,且 14 d組低于 7 d組（P<0.05）。

圖4 各組大鼠海馬組織IL-6含量

2.4 QUE對海馬組織BDNF蛋白水平的影響

如圖5所示，實驗在第7、14 d時，PTSD組大鼠海馬組織BDNF蛋白水平均低于同時段Control組（P<0.01）；QUE組大鼠海馬組織BDNF蛋白水平顯著高于同時段PTSD組（P<0.01）。

圖5 大鼠海馬組織BDNF蛋白表達水平（免疫印跡，均數(shù)±標準差，n=5）

2.5 海馬組織IL-6含量和BDNF蛋白水平與行為學(xué)指標值之間存在顯著相關(guān)

Pearson相關(guān)性分析如圖6所示，海馬組織IL-6含量與PTSD大鼠的探索次數(shù)之間（圖6A）呈負相關(guān)（r=-0.72，P<0.01），與焦慮指數(shù)之間呈正相關(guān)（圖 6B，r=0.72，P<0.01）；BDNF 蛋白水平與探索次數(shù)之間呈正相關(guān)（圖 6C，r=0.74，P<0.01），與焦慮指數(shù)之間呈負相關(guān)（圖 6D，r=-0.80，P<0.01）。從圖中可以看出，海馬組織IL-6含量和BDNF蛋白水平與PTSD大鼠行為變化之間存在顯著相關(guān)。

圖6 海馬組織IL-6、BDNF水平與大鼠探索次數(shù)和焦慮指數(shù)之間的相關(guān)性（n=15）

3 討論

本實驗中的PTSD大鼠模型采用連續(xù)單一應(yīng)激（Single Prolonged Stress,SPS）刺激與足底電刺激（S）相結(jié)合的方法進行構(gòu)建，在造模后第7、14 d分別采用曠場實驗和高架十字迷宮實驗檢測大鼠PTSD樣行為變化，驗證造模效果，并通過給予槲皮素（QUE）連續(xù)灌胃干預(yù)，觀察QUE對大鼠PTSD樣行為的改善效應(yīng)及其相關(guān)的海馬機制。結(jié)果表明：QUE對大鼠PTSD樣行為有明顯調(diào)節(jié)作用，包括增強大鼠的探索能力，減輕大鼠焦慮樣情緒等，提示QUE可能具有良好的抗PTSD潛能。

之前有研究認為，海馬腦區(qū)組織結(jié)構(gòu)紊亂和功能異常與PTSD病理進程有密切聯(lián)系。海馬屬大腦邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，與情緒、記憶以及應(yīng)激反應(yīng)緊密關(guān)聯(lián)。大鼠經(jīng)歷創(chuàng)傷應(yīng)激刺激后，海馬神經(jīng)元發(fā)生變性、細胞萎縮、細胞再生減少［5-6］，導(dǎo)致與海馬相關(guān)的空間記憶、應(yīng)激、情感控制和對新奇事物的反應(yīng)處理等過程的缺陷［7］。本文發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元數(shù)量減少，排列紊亂，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，核固縮現(xiàn)象明顯；與上述研究報道相一致。同時，在實驗中還發(fā)現(xiàn)QUE組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量較模型組增加，神經(jīng)元排列趨向整齊，空泡樣結(jié)構(gòu)減少，核固縮現(xiàn)象減輕，說明QUE對PTSD大鼠海馬神經(jīng)元病變有明顯改善作用。

近年來也有研究認為：神經(jīng)炎癥反應(yīng)是引發(fā)抑郁癥、焦慮癥、精神分裂癥、癲癇癥以及阿爾茨海默病等多種神經(jīng)精神疾病的重要誘因，針對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的靶向研究已成為當(dāng)前神經(jīng)精神疾病診治領(lǐng)域的熱點［8］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種神經(jīng)精神疾病中，中樞神經(jīng)內(nèi)多種炎癥細胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α等分泌紊亂，可誘導(dǎo)模型動物出現(xiàn)以無助、運動探索能力下降、焦慮、睡眠障礙、記憶和學(xué)習(xí)障礙為特征的行為缺陷［9］。相關(guān)研究報道，經(jīng)創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)激發(fā)的PTSD大鼠，其海馬小膠質(zhì)細胞被激活，導(dǎo)致了模型大鼠焦慮樣行為的出現(xiàn)，以小膠質(zhì)細胞為靶點，使用米諾環(huán)素（小膠質(zhì)細胞抑制劑）干預(yù)后，海馬炎性細胞因子的產(chǎn)生減少，模型動物的焦慮樣行為明顯減輕。由此，可以認為抑制海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是治療PTSD的有效手段［10］。在本文實驗中，SPS&S引發(fā)大鼠海馬組織炎性細胞因子IL-6含量持續(xù)上升，而QUE連續(xù)灌胃干預(yù)7 d后海馬組織內(nèi)升高的IL-6水平明顯下降，連續(xù)干預(yù)14 d后海馬IL-6水平進一步下降，由此表明QUE的抗PTSD效應(yīng)可能與其抑制海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。而神經(jīng)炎癥反應(yīng)和PTSD樣行為之間有何關(guān)聯(lián)？已有相關(guān)研究證據(jù)表明：神經(jīng)炎癥反應(yīng)所釋放的炎性細胞因子導(dǎo)致了BDNF信號傳導(dǎo)障礙，這和創(chuàng)傷應(yīng)激、抑郁、焦慮等多種神經(jīng)精神癥狀的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)［11］。海馬組織內(nèi)過度炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致BDNF信號通路的損傷，進而抑制BDNF的正常表達，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷和PTSD樣癥狀的出現(xiàn)。本文的結(jié)果顯示：模型大鼠海馬組織內(nèi)BDNF水平在造模后第7 d出現(xiàn)下降，至第14 d時含量進一步降低，而QUE持續(xù)干預(yù)7～14 d后這種下降趨勢得到扭轉(zhuǎn)。因此，可以得出模型大鼠經(jīng)QUE連續(xù)干預(yù)后出現(xiàn)的海馬組織BDNF水平升高可能是QUE抑制海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)的結(jié)果。在實驗中還發(fā)現(xiàn)：海馬組織內(nèi)IL-6、BDNF的水平變化與大鼠探索能力、焦慮水平變化之間存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。海馬IL-6水平的升高引發(fā)大鼠曠場箱內(nèi)探索能力下降，開放臂內(nèi)焦慮指數(shù)升高；而海馬BDNF水平升高時則出現(xiàn)了反向的效果。但是，在PTSD模型動物中海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)和BDNF功能障礙之間到底存在怎樣的因果聯(lián)系，以及二者與PTSD樣行為變化之間的內(nèi)在聯(lián)系仍需做更深入的實驗研究。