周 愛，張佳麗，董文興，吳英捷，林思佳，尹龍飛

（臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000）

0 引言

煙酰胺單核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種具有生物活性并廣泛存在于自然中的核苷酸。NMN有α和β兩種化學結構，β-異構體是其活性形式。NMN是一種人體內重要的輔助因子，主要在電子轉移反應中起作用［1］。NMN還是一種具有延緩衰老作用的天然化合物，是人體細胞中的一種內源性物質［2］。美國哈佛大學醫(yī)學院David Sinclair教授發(fā)現(xiàn)NMN能夠有效轉化成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD），并通過動物實驗證明了NMN具有抗衰老、延長壽命的功效［3］。面對新冠病毒全球肆虐，西達塞納醫(yī)學中心的Robert Huizenga利用NMN雞尾酒療法能明顯改善新冠肺炎患者體內出現(xiàn)的細胞因子風暴［4］。根據近幾年NMN在市場的風向顯示，它在醫(yī)藥美容行業(yè)和食品科技方面具有很高的應用前景。2017年，基因港首次推出了生物合成的NMN-艾沐茵。大量研究表明，NMN 對阿爾茨海默病［5］、帕金森病［6］、退行性疾?。?-8］、代謝性疾病和肥胖?。?］等具有一定的治療作用。Irie等［10］研究表明，NMN在人體內具有良好的耐受性，這為其將來在臨床上的研究打開了藍圖。

近年來，NMN的高效合成方式引來了科學界和工業(yè)界的眾多關注?，F(xiàn)已知可以通過化學法或生物法來合成NMN。化學合成NMN需要保護和脫保護過程，它還使用了對環(huán)境有污染性的溶劑，并且其合成的NMN中只有2/3具有生物活性的異構體［11］。與化學合成不同的是，NMN的生物合成具有高立體選擇性、溫和的反應條件、低副產品數(shù)等優(yōu)點。對于生物法發(fā)酵途徑，可以使用廉價的原料，如核糖、肌酸和煙酰胺等，在底物存在的情況下通過過表達合成NMN的酶來實現(xiàn)NMN的高效合成。事實上，酶催化法和發(fā)酵法具有一些相同的酶轉化步驟。目前，NMN雖然能通過化學合成生產，但其成本較高且轉化率不高，因此現(xiàn)有合成技術不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產。本綜述主要討論了生物法生產NMN的最新進展，重點討論了參與這些過程的關鍵酶，并對其市場應用價值和未來應用前景等進行了深度分析與展望。

1 化學合成

雖然現(xiàn)有報道的NMN的化學合成方法較多，但是化學合成存在對環(huán)境有極大污染、產率低、生產成本高等不利因素，影響著其大規(guī)模發(fā)展。目前NMN的化學合成方法主要有4種：

（1）煙酸乙酯與四乙酰核糖經過縮合，再通過脫乙?；⒘姿峄桶苯獾闹饕に嚥襟E，制備得到β-NMN［12］。

（2）在酸催化劑存在下，煙酰胺核糖與縮酮化試劑反應以保護煙酰胺核糖，然后磷酸化，經分離作用脫保護得到β-NMN［13］。

（3）Lee等以四乙酰核糖經氫溴酸溴代，與煙酰胺發(fā)生取代制得，再經氨氣脫乙?；?，用三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化后經樹脂層析法純化得β-NMN，總收率達到57%［14］。

（4）改進了以煙酸乙酯與四乙酰核糖為起始原料，經縮合、脫乙?；?、磷酸化、氨解反應，其NMN總收率約為64%。雖然此方法的原料容易得到、收率高且過程中的中間產物無須純化，但該方法是使用交換樹脂后處理的，工藝成本較高［15］。

2 生物合成

生物合成法因得益于其所用的催化劑反應條件溫和安全、對環(huán)境基本無污染、分離過程較為簡單、轉化率和對映選擇性較高等優(yōu)點，所以其更加優(yōu)于化學合成方法并成為近年來生物領域研究的熱點。

2.1 酶促法

目前公開報道采用酶催化生產β-煙酰胺單核苷酸的生物合成法有：

（1）以煙酰胺核糖（Nicotinamide Riboside,NR）為起始底物，在煙酰胺核苷激酶（Nicotinamide Riboside Kinase,NRK）的作用下將NR和ATP催化生成NMN和二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate,ADP）［16］，如圖 1 所示。

圖1 NRK催化NR合成NMN

（2）以煙酰胺（Nicotinamide,NAM）為起始底物，在煙酰胺磷酸核糖轉移酶（Nicotinamide Phosphoribosyltransferase,NAMPT）的作用下將NAM和磷酸核糖焦磷酸（Phosphoribosyl Pyrophosphate,PRPP）催化生成NMN和焦磷酸［17-18］，如圖2所示。

圖2 NAMPT催化PRPP合成NMN

此方法中使用到的NAMPT是一個關鍵酶，它已經被廣泛研究。NAMPT在哺乳動物中被廣泛表達，但大多數(shù)細菌缺乏NAMPT基因［19］。研究表明：來自哺乳動物和細菌的10種NAMPTs的活性與其細胞內蛋白表達水平大致相關；來自Chitinophaga pinensis的NAMPT在E.coli中的表達水平最高，表現(xiàn)出最高的NAM轉化活性［20］。NAMPT是NAD生物合成途徑中的限速酶，它可以影響細胞中的NAD濃度的相對平衡［21］。相比之下，具有高活性的NAMPT更適合用于NMN的工業(yè)生產。方法中用到的PRPP是合成NMN的重要原料，而PRPP不僅非常昂貴而且不穩(wěn)定，所以直接使用它作為工業(yè)應用的底物是不可行的。現(xiàn)有研究表明：可以把簡單的相對廉價的底物（如核糖、腺苷和葡萄糖）轉化為PRPP，進而合成NMN。

2.1.1 核糖轉化為PRPP

生產PRPP的一個比較經濟的方法是通過兩步催化步驟，將作為起始材料的核糖轉化為PRPP。第一步，使用ATP作為磷酸基團的供體，利用核糖激酶（Riboside Kinase,RK）催化核糖生成核酮糖-5-磷酸（R5P）；第二步，利用磷酰焦磷酸合成酶（PRS）將ATP的二磷酸基團轉移到R5P的C1-羥基上，誘導PRPP的產生。據報道，E.coli核糖激酶的酶學特性已被廣泛研究，它的活性主要受陽離子（如鉀離子和鎂離子）的影響［22］。在優(yōu)化條件下，其常數(shù)Kcat/KM可高達3.48×108，這一數(shù)據表明E.coli的RK可以用高效的方式轉化出 D-核糖［23］。

根據對磷酸鹽離子活性的要求及二磷酸基團供體的特異性和異生調節(jié)機制，PRSs可分為三個亞組［24-26］。第一類PRSs是被調查研究最多的，它可以被Mg2+和磷酸鹽激活，但被二磷酸腺苷（ADP）競爭性和異生性抑制［27］。來自Bacillus subtilis、E.coli和人類的I類PRSs的三維結構已被解析。所有這些結構顯示，PRS的功能形式是一個六聚體，每個亞單位由兩個結構域組成［28-30］。ATP和R5P在一個亞單位的兩個結構域的界面上與催化活性部位相結合，ADP與六聚體的三個亞基之間的界面上的異生位點相結合，從而降低了酶對活性位點上的ATP和R5P的親和力，導致其活性受到抑制。盡管Bacillus subtilis、E.coli和人類的PRSs的晶體結構相似，但它們的酶學特性是不同的。人類的PRS對于R5P和ATP具有較高的結合親和力，但最大的親和力是來自枯草桿菌的PRS［31-32］。

據報道，PRS的酶學特性也會受到突變的影響。人類的PRS中提到的D52H、N114S和L129I通過增加對ADP的抗性而導致其過度活躍［33-34］。與此結果一致的是，淀粉酶中的N120S和L135I（對應于人類PRS中的N114S和L129I）也對ADP進行抵抗，從而減輕了ADP引起的抑制程度［30］。值得注意的是，PRS的抑制劑ADP是核糖到R5P的生物合成過程中的副產品。因此，抗ADP的PRS可能具有巨大的潛力，可以在一系列反應中把核糖轉化為PRPP［35］。

2.1.2 腺苷轉化為PRPP

一專利［36］報道了一種以腺苷為起始材料并通過串聯(lián)催化合成PRPP的方法，第一步，腺苷首先被腺苷激酶（Adenosine Kinase,ADK）轉化為一磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate,AMP）；然后，通過AMP和無機焦磷酸合成PRPP和腺嘌呤（A），這一生物轉化過程是由腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（Adenine Phosphoribosyltransferase,APRT）催化的；最后，在NAMPT和NAM的存在下，合成的PRPP被轉化為NMN。ADK屬于糖激酶的磷酸果糖激酶B（PfkB）家族。事實上，上面描述的RK也屬于PfkB家族。這個家族的成員有3個保守的序列圖案，它們的活動需要五價元素的存在［37］。第二步，APRT催化正向和反向反應，其中AMP的合成是正向反應［38］，高濃度水平的AMP可以增加PRPP的合成速率，因為它是正向反應的競爭性抑制劑［39］。Huyet等［40］證明，人類APRT中的Tyr105是調節(jié)該反應兩個方向的動力學活性的關鍵性氨基酸殘基，因為Tyr105Phe突變體增加了對AMP的抑制作用，從而降低了該酶對正向反應的催化效率。然而，該專利中使用了來自E.coli的野生型APRT，其NMN產量高達19 g/L。由于NAMPT消耗了PRPP，促進了APRT催化反方向的反應，從而導致具有雙向活性的野生型APRT催化反應的NMN產量和理論高產量之間的不一致。

2.1.3 通過葡萄糖合成PRPP

葡萄糖是一種廣泛應用于工業(yè)的糖類，如果它的生物催化效率足夠高，它就有可能成為合成PRPP的理想材料。Shinichiro等［20］報道了一種生產NMN的方法，其中PRPP是由E.coli從葡萄糖中發(fā)酵產生的，它過表達了其磷酸戊糖途徑的七個內源基因。磷酸戊糖途徑分為兩個階段：氧化階段和非氧化階段。葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）在氧化階段被轉化為R5P和二氧化碳；然后在非氧化階段，一個分子的5-核酮糖被轉化為一個分子的R5P和兩個分子的5-木酮糖。其中非氧化階段產生的R5P是改良版磷酸戊糖途徑的目標產品，它可用于等摩爾合成PRPP，那么利用磷酸戊糖途徑的非氧化階段可以獲得PRPP的前體物質——R5P。因此，PRPP在這個E.coli工程菌中得到了有效的制備。研究顯示：51.6%的葡萄糖（在培養(yǎng)基中含量為21 g/L）通過磷酸戊糖途徑被用來合成NMN，產量為6.79 g/L。

2.1.4 應用ATP再生系統(tǒng)進行NMN的生物合成

上述的酶促法合成NMN都需要ATP作為底物，并且在有ATP存在的情況下，NAMPT可以通過自磷酸化激活［41］。引入與聚磷酸激酶（Polyphosphate Kinase,PPK）有關的ATP再生系統(tǒng)，能夠大幅減少ATP的消耗，實現(xiàn)低成本生產NMN［42］。ATP再生系統(tǒng)包括兩部分：其一是需要ATP參與的生物酶反應系統(tǒng)；其二是ATP生物合成系統(tǒng)，二者缺一不可。在反應過程中，ATP降解產生的ADP（或AMP）通過其他反應體系再生成ATP，從而使ATP能夠再生并用于生物合成。用能夠再生ATP的廉價底物來替代反應物中昂貴的ATP，能夠進一步降低生產成本以達到高效生產目標［43］。PPK可催化無機聚磷酸鹽（Poly P）和ATP之間的可逆轉化［44］，且由于Poly P容易獲得且價格低廉，因此以PPK為基礎的ATP再生系統(tǒng)受到業(yè)內更多的關注［45］。

2.2 發(fā)酵法

國內外科研人員對發(fā)酵法合成NMN也進行了大量的研究。發(fā)酵法過程比較復雜，因為它包含了多種酶的復雜系統(tǒng)。除了反應條件外，催化過程還可能受到其他非目標酶的影響。發(fā)酵法利用NAMPT催化PRPP轉化為NMN，其中的焦磷酸鹽（PPi）是一種副產品。Burgos等［41］證明，PPi的水解有利于反應平衡向NMN的生產方向轉移。通過添加焦磷酸酶（PPase）消除PPi，NMN的產量增加了約50%，可能是因為副產品PPi的降解促進了反應過程［42］。但由于宿主細胞內其余非目標酶的存在，在催化過程中可能會發(fā)生底物、中間產物和NMN合成的最終產物的消除。例如，底物煙酰胺可以被宿主吡嗪酰胺酶/煙酰胺酶1（PNC1）脫氨形成煙酸。研究表明，在pnc1缺失的酵母菌細胞中，NMN的產量明顯較高［46］。

在發(fā)酵法中，有研究表明細胞內的底物轉入和產物轉出是影響NMN產量的另一個關鍵因素［20］，NAM進入到工程菌細胞內是合成NMN所必需的首要條件。在篩選的6個煙酸轉運基因（NiaP）中，來自布氏菌的NiaP表現(xiàn)出對NAM具有最高的吸收活性。在表達NiaP的基因工程菌中，NMN的產量提高約25%。NMN在細胞中會通過NMNAT催化作用轉化為NAD，從而導致其產量下降。因此除了下調NMNAT外，避免這種轉化的另一個策略是將NMN輸出到細胞外。而PRPP和NAM向NMN的轉化是可逆的，這就表明NMN在細胞內的積累可能會阻礙產品在細胞內的形成。然而，在E.coli中NMN并不能高效地輸出到培養(yǎng)基中［35］。Shinichiro等［20］鑒定了一種來自霉菌的新的煙酰胺核苷轉運體（PnuC），它能夠幫助排出細胞內的NMN，使表達轉運體的E.colii工程菌的NMN產量提高了30%，并且大部分NMN被輸出到上清液中。Liu等［47］采用一系列代謝工程策略，包括增加能量供給，提高底物進入細胞的效率等，使得NMN的產量達到496.2 mg/L。

3 展望

鑒于NMN具有抗衰老等功能以及具備安全性較高、熱穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，因此NMN將有十分廣闊的應用前景。NMN在減緩生物體生理機能衰退、延緩衰老等方面有特殊功效；在醫(yī)藥、美容、食品保健及日化領域有廣闊的應用前景；對于帕金森病、阿爾茨海默病及糖尿病等的治療效果極佳［48］。由于目前NMN的合成仍然艱難，其面臨操作復雜、產品純度低、收率低以及成本高昂等問題。在今后研究中，可利用基因工程技術，采用全細胞生物催化方法合成NMN，最終構建出一個完整、高效的β-煙酰胺單核苷酸全細胞催化和分離純化體系，為NMN的產業(yè)化奠定基礎?，F(xiàn)今我國在醫(yī)療健康方面應用NMN的占比較大，而在食品方面的應用卻寥寥無幾。隨著業(yè)內對NMN安全性及效果的進一步探索研究，將會有更多與NMN相關的保健品用于生活中，造福人類。