胡曉波，王 麟，李小娟

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

民以食為天，食以安為先，食品安全是關(guān)乎人民健康的重大基本民生問題。在食品的整個流通過程中，除了自身影響因素外，食品的質(zhì)量和安全與外部環(huán)境因素（如時間、溫度、濕度、光照和機(jī)械應(yīng)力等）密切相關(guān)[1]，其中溫度又是導(dǎo)致食物腐敗最不可預(yù)測的因素，有效監(jiān)測食品流通過程中的溫度變化至關(guān)重要[2]。時間-溫度指示劑（time-temperature indicator，TTI）作為一種具有顯示作用的智能標(biāo)簽，能通過化學(xué)反應(yīng)或者物理變化在時間和溫度上的累積效應(yīng)[3]，監(jiān)控和記錄食品從生產(chǎn)、運(yùn)輸?shù)戒N售各環(huán)節(jié)的溫度歷史，動態(tài)顯示食品的剩余保質(zhì)期，為食品生產(chǎn)者、物流管理者以及消費(fèi)者提供準(zhǔn)確檢測和評估食品品質(zhì)的方法[4-7]。

根據(jù)反應(yīng)原理和指示方法的不同，TTI通常分為擴(kuò)散型、聚合物型和酶型等[8-9]。其中，酶型TTI基于酶與底物之間的反應(yīng)進(jìn)行，通過改變酶的類型、起始pH值等就可以改變酶型TTI體系和活化能以適應(yīng)不同的產(chǎn)品，易于控制且性能穩(wěn)定、成本低廉，具有更高的準(zhǔn)確性和適用性[10-12]。根據(jù)TTI中酶的存在形態(tài)不同，可將其分為液態(tài)酶型TTI和固態(tài)酶型TTI，液態(tài)酶型TTI中酶不穩(wěn)定，易失活，限制了其商業(yè)化應(yīng)用[13]。因此，基于固定化酶技術(shù)對酶進(jìn)行固定化，再利用酶促反應(yīng)構(gòu)建而成的固態(tài)酶型TTI成為一個新的研究方向[3,10,14]。

本研究首先利用淀粉酶中氨基酸殘基與銅離子之間的相互作用，對淀粉酶進(jìn)行固定化，制備淀粉酶@Cu無機(jī)雜化納米花[14-16]，研究淀粉酶質(zhì)量濃度對納米花形貌結(jié)構(gòu)的影響，篩選出花形最好納米花[17]，并測試納米花中淀粉酶的生物活性及保存穩(wěn)定性。然后以可溶性淀粉為底物，碘液為指示劑，改變淀粉酶@Cu納米花的用量，制備出6種配方的淀粉酶納米花型TTI[18-22]，觀察其在不同溫度下的顏色變化過程，確定吸光度隨時間變化的動力學(xué)參數(shù)，計(jì)算出TTI的活化能。根據(jù)TTI與食品匹配原則，確定該系列TTI活化能指示范圍，以期為實(shí)時監(jiān)控食品的質(zhì)量變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可溶性淀粉、淀粉酶 上海市阿拉丁生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氯化鉀、硫酸銅、鹽酸、碘、碘化鉀天津市永大化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平 德國Sartorius公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝科技股份有限公司；TU-1950紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Quanta 250 FEG場發(fā)射掃描電鏡 美國FEI公司；D8 Advance X射線衍射儀 德國Bruker公司；Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；STA 2500同步熱分析儀 德國Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉酶@Cu雜化納米花的制備

稱取10.64 g Na2HPO4·12 H2O、1.39 g KH2PO4、0.40 g氯化鉀、16.01 g氯化鈉，加水配制成2 L pH 7.4的磷酸緩沖溶液。將6.67 mL 120 mmol/L的硫酸銅溶液和500 mL淀粉酶緩沖溶液混合均勻，其中淀粉酶質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1、0.2 mg/mL和0.5 mg/mL。25 ℃水浴中靜置3 d后進(jìn)行離心，沉淀用高純水進(jìn)行洗滌，冷凍干燥得到淀粉酶@Cu無機(jī)雜化納米花材料，分別標(biāo)記為NF-1、NF-2、NF-3、NF-4、NF-5和NF-6。

1.3.2 淀粉酶@Cu雜化納米花中淀粉酶含量計(jì)算

為了測定納米花中淀粉酶的含量，對干燥的淀粉酶@Cu雜化納米花進(jìn)行煅燒，使用STA-2500同步熱分析儀測定其熱失重曲線，其中納米花中淀粉酶的質(zhì)量損失溫度為100～800 ℃。淀粉酶在納米花中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式（1）計(jì)算：

式中：W為淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；G0為淀粉酶質(zhì)量；GN為納米花質(zhì)量。

1.3.3 淀粉酶@Cu雜化納米花活性測試

可溶性淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法：準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為1.0～3.0 mg/mL的淀粉標(biāo)準(zhǔn)系列，分別將1.0 mL上述淀粉標(biāo)準(zhǔn)液與2.0 mL 1 g/L碘液混合，測試溶液在580 nm波長處的吸光度，以淀粉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，擬合出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程。向1.2 mL 2 mg/mL可溶性淀粉溶液中加入干燥的淀粉酶@Cu納米花，保證納米花中淀粉酶的質(zhì)量為1 mg，溶液在50 ℃反應(yīng)30 min，加入0.3 mL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，再加入1.5 mL 1 g/L碘液，測定上清液在580 nm波長處吸光度。作為對比，用1 mg淀粉酶代替納米花，用同樣方法測定天然淀粉酶活性。在該實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘降解1 mg淀粉所消耗的酶量定義為一個酶活力單位（U），每毫克淀粉酶中所含有的酶活力單位數(shù)定義為比活力（U/mg），由式（2）計(jì)算：

式中：S為酶的比活力/（U/mg）；m0為初始淀粉質(zhì)量（2.4 mg）；mt為反應(yīng)終止后溶液中剩余的淀粉質(zhì)量（由淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算）；me為納米花中淀粉酶含量（1 mg）；t為反應(yīng)時間（30 min）。

1.3.4 淀粉酶@Cu雜化納米花穩(wěn)定性測試

將天然淀粉酶和淀粉酶@Cu納米花分別溶于pH 7.4磷酸緩沖溶液中，溶液室溫下長時間放置，利用紫外-可見分光光度計(jì)測定淀粉酶和淀粉酶@Cu納米花生物活性隨放置時間的變化情況。

1.3.5 淀粉酶納米花型TTI的制備

1.3.5.1 可溶性淀粉溶液質(zhì)量濃度的確定

分別配制質(zhì)量濃度為10、20、30、40 g/L和50 g/L的可溶性淀粉溶液，各取15 mL與4.5 mL碘液（1 g/L）、40 mg淀粉酶@Cu納米花混合，測體系在580 nm波長處的初始吸光度，在4 ℃下保存，每隔24 h測反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.5.2 碘液質(zhì)量濃度的確定

分別配制質(zhì)量濃度為0.5、0.75、1、1.25 g/L和1.5 g/L的碘液，各取4.5 mL與15 mL可溶性淀粉溶液（40 g/L）、40 mg淀粉酶@Cu納米花混合，測體系在580 nm波長處的初始吸光度后4 ℃保存，每隔24 h測反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.5.3 TTI的制備

確定出淀粉溶液和碘液的最佳質(zhì)量濃度后，將15 mL可溶性淀粉溶液和4.5 mL碘液混合均勻，分別加入10、20、30、40、50、60 mg的淀粉酶@Cu納米花，制備出6種配方的TTI，分別標(biāo)號為1#TTI、2#TTI、2#TTI、3#TTI、4#TTI、5#TTI和6#TTI。

1.3.6 TTI體系顏色變化及動力學(xué)參數(shù)的確定

將6種配方的TTI溶液分別放置在5、15、25、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，每隔一段時間進(jìn)行拍照，并測試溶液在580 nm波長處吸光度，繪制吸光度隨時間變化的曲線。利用Origin軟件對TTI的吸光度-時間曲線進(jìn)行擬合，得到TTI在不同溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)。根據(jù)Arrhenius方程[23]，求得TTI反應(yīng)體系的活化能，從而確定出淀粉酶納米花型TTI的適用范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶@Cu納米花的制備

蛋白質(zhì)-無機(jī)雜化納米花是一種新型固定化酶材料，實(shí)驗(yàn)中利用淀粉酶和硫酸銅制備了淀粉酶-無機(jī)雜化納米花NF-1、NF-2、NF-3、NF-4、NF-5和NF-6，用掃描電鏡對其形貌進(jìn)行表征。從圖1可知，在制備納米花過程中，溶液中淀粉酶質(zhì)量濃度較低時，得到的納米花NF-1、NF-2和NF-3花狀結(jié)構(gòu)不完整，存在大量碎片，這是因?yàn)榈矸勖纲|(zhì)量濃度較低時，溶液中晶體成核位點(diǎn)較少，影響晶體生長；納米花NF-4和NF-5出現(xiàn)完整的花狀結(jié)構(gòu)，但形貌不統(tǒng)一，仍有碎片存在；淀粉酶質(zhì)量濃度增大到0.5 mg/mL時，溶液中存在大量成核位點(diǎn)，納米花NF-6中沒有碎片存在，只有完整的花狀結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果說明在形成納米花過程中，淀粉酶質(zhì)量濃度直接影響納米花的形貌結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)選用NF-6進(jìn)行下步研究。

圖1 淀粉酶與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)物掃描電鏡圖（×5 000）Fig. 1 SEM of the reaction product between amylase and copper sulfate (× 5 000)

通過X射線衍射對納米花NF-6的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，如圖2a所示。NF-6分別在9.09°、12.89°、20.92°、29.45°、33.64°、37.21°、41.86°和53.52°處出現(xiàn)強(qiáng)的特征衍射峰，與Cu3(PO4)2·3H2O的標(biāo)準(zhǔn)卡片（JPSCD 00-022-0548，圖2b）一致，說明納米花NF-6具有高結(jié)晶度，且其結(jié)構(gòu)中的無機(jī)組分是Cu3(PO4)2·3H2O。

圖2 納米花NF-6（a）和Cu3(PO4)2·3H2O（b）的X射線衍射圖Fig. 2 XRD pattern of NF-6 and Cu3(PO4)2·3H2O

利用紅外光譜儀測定納米花NF-6的紅外吸收光譜，如圖3所示。NF-6在600～500 cm-1和1 100～940 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，這是P—O振動和O—P＝O彎曲造成，證明納米花中含有磷酸基團(tuán)；在1 600～1 400 cm-1出現(xiàn)酰胺鍵的特征吸收峰，在3 000～2 800 cm-1出現(xiàn)—CH2—和—CH3伸縮振動吸收峰，在3 500 cm-1處出現(xiàn)O—H強(qiáng)的寬吸收峰，說明納米花中含有淀粉酶。

圖3 NF-6的紅外吸收光譜圖Fig. 3 Infrared absorption spectrum of NF-6

2.2 淀粉酶@Cu納米花活性分析

通過熱重分析研究淀粉酶@Cu雜化納米花中淀粉酶含量，如圖4所示。從納米花的熱失重曲線可知，從室溫到100 ℃質(zhì)量損失6.06%，100～800 ℃范圍內(nèi)質(zhì)量損失19.58%，即納米花中結(jié)晶水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.06%，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.58%，而Cu3(PO4)2仍作為無機(jī)組分存在于納米花中。

圖4 納米花NF-6的熱重分析譜圖Fig. 4 TGA spectrum of NF-6

將干燥的天然淀粉酶和淀粉酶@Cu納米花NF-6分別加入到可溶性淀粉溶液中，反應(yīng)結(jié)束后添加碘液并進(jìn)行紫外-可見分光光度計(jì)測試。利用可溶性淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝1.009 2x+0.012 6（R2＝0.997 6），計(jì)算出天然淀粉酶比活力為18.24 U/mg，NF-6中淀粉酶比活力為62.36 U/mg。將天然淀粉酶的活性定義為100%，可計(jì)算出NF-6的相對活性為342%，說明淀粉酶固定化后其活性提高到3.42 倍，這主要是因?yàn)榧{米花比表面積大，能增大酶與底物之間的傳質(zhì)，提高酶的生物活性。

實(shí)驗(yàn)配制相同淀粉酶質(zhì)量濃度的天然淀粉酶和淀粉酶@Cu納米花NF-6溶液，將溶液放置室溫下，以起始天然淀粉酶活性作為參照，測定淀粉酶及納米花中淀粉酶在不同時間下的相對活性。從圖5可知，隨著放置時間的延長，天然淀粉酶和納米花中淀粉酶相對活性逐漸減低，但納米花中淀粉酶相對活性降低速度較慢。7 d后，天然淀粉酶的相對活性為21.5%，而納米花中淀粉酶相對活性為187%，明顯高于天然淀粉酶活性。這是因?yàn)榧{米花結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)淀粉酶，使其保存穩(wěn)定性提高，失活速度減慢。

圖5 天然淀粉酶和NF-6中淀粉酶不同時間下的相對活性Fig. 5 Relative activities of native amylase and NF-6 after different storage times

以上結(jié)果說明淀粉酶能與硫酸銅之間相互作用，形成淀粉酶@Cu納米花材料，該材料能顯著提高淀粉酶的生物活性及保存穩(wěn)定性，使其更穩(wěn)定，降低淀粉酶的使用成本。

2.3 淀粉酶納米花型TTI底物質(zhì)量濃度的確定

淀粉酶納米花型TTI是基于淀粉酶與底物之間的酶促反應(yīng)進(jìn)行，研究底物質(zhì)量濃度對TTI指示效果的影響。固定TTI中淀粉酶@Cu納米花NF-6加入量40 mg、可溶性淀粉溶液加入量15 mL、碘液加入量4.5 mL，分別改變可溶性淀粉溶液和碘液質(zhì)量濃度，討論4 ℃條件下其質(zhì)量濃度對TTI體系在580 nm波長處吸光度的影響。從圖6a可知，淀粉質(zhì)量濃度越大，起始吸光度就越大，但5個質(zhì)量濃度下吸光度的降低速度基本一致，先快后慢慢趨于平穩(wěn)。這是由于酶反應(yīng)的速率與底物質(zhì)量濃度有關(guān)，底物質(zhì)量濃度越大，反應(yīng)速率就越快。隨著淀粉酶不斷水解淀粉，溶液最終趨于無色透明，吸光度趨近于0。其中淀粉質(zhì)量濃度為40 g/L時，其初始吸光度與50 g/L相差不大，但明顯大于其他質(zhì)量濃度，為后續(xù)的吸光度降低提供了空間，即整個過程中吸光度的變化幅度會比較大。從圖6b可知，隨著碘質(zhì)量濃度的增加，起始吸光度明顯增加，反應(yīng)時間變長。當(dāng)?shù)庖嘿|(zhì)量濃度為0.5、0.75 g/L和1.0 g/L時，TTI體系吸光度降低到0時所需時間分別約為72、96 h和120 h；當(dāng)?shù)庖嘿|(zhì)量濃度達(dá)到1.25 g/L和1.5 g/L時，5 d后TTI體系仍有顏色，吸光度較高，不利于觀察TTI顏色變化。時間已達(dá)到所需的6 d。綜合考慮，將該TTI中的淀粉質(zhì)量濃度確定為40 g/L，碘液質(zhì)量濃度確定為1.0 g/L。

圖6 可溶性淀粉質(zhì)量濃度（a）和碘液質(zhì)量濃度（b）對TTI體系在580 nm波長處吸光度的影響Fig. 6 Effect of concentration of soluble starch (a) and concentration of iodine (b) on A580 nm of the TTI system

2.4 淀粉酶納米花型TTI顏色變化過程

在淀粉酶作用下，淀粉發(fā)生水解反應(yīng)，聚合度或相對分子質(zhì)量逐漸降低，導(dǎo)致其與碘作用形成的包合物發(fā)生褪色，由藍(lán)色變成無色，且褪色速度與溫度和時間有關(guān)[24]。實(shí)驗(yàn)觀察5、15、25 ℃和35 ℃條件下淀粉酶納米花型TTI的顏色隨時間的變化過程。從圖7可知，6種配方的TTI在放置過程中溶液顏色產(chǎn)生從深藍(lán)色-藍(lán)色-淺藍(lán)色-無色的明顯變化，且溫度越高，變色速度越快。TTI的顏色與食品質(zhì)量正相關(guān)[25]，當(dāng)TTI呈現(xiàn)深藍(lán)色時，此時食品比較新鮮，可以放心食用；當(dāng)TTI褪色成無色時，此時食品已發(fā)生腐敗變質(zhì)，不能再食用。

圖7 不同溫度下各TTI顏色隨時間的變化過程Fig. 7 Color change of TTIs at different temperatures

2.5 淀粉酶納米花型TTI動力學(xué)參數(shù)確定

反應(yīng)過程中淀粉酶納米花型TTI在580 nm波長處吸光度發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測了6種配方的TTI在5、15、25 ℃和35 ℃條件下吸光度隨時間的變化，并繪制出吸光度隨時間變化的曲線，如圖8所示。利用Origin軟件采用式（3）對吸光度-時間曲線進(jìn)行指數(shù)函數(shù)擬合。

式中：X為TTI體系的吸光度；t為反應(yīng)時間/h；a、k及b為擬合函數(shù)參數(shù)。

由此得到淀粉酶納米花型TTI在不同溫度條件下的反應(yīng)速率k，如表1所示。

圖8 不同溫度下各TTI吸光度隨時間的變化曲線Fig. 8 Absorbance versus time curves of TTIs at different temperatures

表1 各TTI擬合曲線參數(shù)及相應(yīng)lnk值Table 1 Fitting parameters and lnk values for TTIs

從表1可以看出，不同溫度條件下的擬合曲線方程相關(guān)系數(shù)R2都在0.96以上，說明6種TTI在不同溫度條件下吸光度與時間的指數(shù)相關(guān)性顯著。

2.6 淀粉酶納米花型TTI活化能計(jì)算

酶促反應(yīng)中反應(yīng)溫度對反應(yīng)速率的影響遵循Arrhenius方程[23]：

式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)/h-1；k0為指前因子/h-1，對于指定反應(yīng)是一個常數(shù)；Ea為活化能/（kJ/mol）；T為熱力學(xué)溫度/K；R為摩爾氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））。

以lnk對1/T作圖，若兩者呈明顯線性關(guān)系，則說明不同溫度下的反應(yīng)速率符合Arrhenius方程，可利用Arrhenius方程計(jì)算出反應(yīng)的活化能。根據(jù)表1中不同溫度條件下相應(yīng)的lnk值，繪制lnk與1/T的關(guān)系曲線，如圖9所示。利用Origin軟件對各曲線進(jìn)行線性擬合，得到擬合方程，根據(jù)Arrhenius方程可以求得各自的活化能Ea和指前因子k0，如表2所示。

圖9 各TTI的lnk與1/T的擬合直線Fig. 9 Fitting curves of lnk against 1/T for TTIs

表2 各TTI的動力參數(shù)Table 2 Kinetic parameters for TTIs

由擬合參數(shù)可以看出，lnk和1/T的相關(guān)性R2在0.93以上，線性關(guān)系比較顯著，6種配方的TTI活化能分別為14.84、21.00、28.85、33.03、32.55 kJ/mol和32.83 kJ/mol。根據(jù)TTI與食品匹配原則，當(dāng)TTI活化能與食品腐敗活化能相差25 kJ/mol時，該TTI便可應(yīng)用于該產(chǎn)品[26-27]。因此6種配方的TTI可以指示的產(chǎn)品活化能范圍分別為0～39、0～46、3～53、8～58、7～57 kJ/mol和7～57 kJ/mol，適用于監(jiān)測由擴(kuò)散控制、酶反應(yīng)、脂肪氧化等原因[28-31]引起腐敗變質(zhì)的食品質(zhì)量變化。

3 結(jié) 論

基于酶與金屬離子間的相互作用，成功制備了淀粉酶@Cu納米花，其中淀粉酶質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，納米花的形貌結(jié)構(gòu)最完整，該納米花能顯著提高淀粉酶的生物活性和保存穩(wěn)定性。選用可溶性淀粉溶液為底物，碘液為指示劑，加入淀粉酶@Cu納米花，制備出6種配方的淀粉酶納米花型TTI，觀察了TTI由深藍(lán)色到無色的變化過程，研究了不同溫度下TTI的吸光度隨時間的變化曲線。通過動力學(xué)參數(shù)研究，計(jì)算出6種TTI的活化能分別是14.84、21.00、28.85、33.03、32.55 kJ/mol和32.83 kJ/mol，適用于監(jiān)測由擴(kuò)散控制、酶反應(yīng)、脂肪氧化等原因引起腐敗變質(zhì)的食品質(zhì)量變化。