劉聰聰， 李佳萍， 周宏偉

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310009）

1988年，Tanaka和Hillenkamp將基質(zhì)輔助激光解吸電離時(shí)間飛行質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）應(yīng)用于生物大分子分析，開(kāi)啟了MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域革命性的新篇章[1]。質(zhì)譜技術(shù)給微生物檢驗(yàn)帶來(lái)的最大變革是對(duì)臨床微生物的鑒定能力大大提高，原有鑒定方法需要大量的手工操作，且耗時(shí)較長(zhǎng)，質(zhì)譜技術(shù)能將鑒定時(shí)間從幾個(gè)甚至幾十個(gè)小時(shí)縮短到數(shù)分鐘。值得一提的是，質(zhì)譜技術(shù)對(duì)細(xì)菌超強(qiáng)的鑒定能力使得微生物檢驗(yàn)跨入一個(gè)飛速發(fā)展的新時(shí)代，其對(duì)臨床微生物的鑒定準(zhǔn)確率超過(guò)95%[2-3]。目前，性能得到普遍認(rèn)可的微生物鑒定質(zhì)譜儀主要是德國(guó)布魯克公司和法國(guó)生物梅里埃公司研發(fā)的產(chǎn)品。近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜儀的技術(shù)也趨于成熟，上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司ATSA MicroIDSys MALDI-TOF MS儀是2018年自韓國(guó)引進(jìn)的新一代質(zhì)譜系統(tǒng)，目前在我國(guó)還缺乏全面的臨床微生物鑒定性能評(píng)估。本研究對(duì)該系統(tǒng)在臨床微生物鑒定中的效能進(jìn)行相對(duì)全面的評(píng)估，以期為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2012—2020年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院留存的934株臨床分離株（覆蓋28個(gè)屬，70個(gè)種或種復(fù)合體），包括革蘭陰性菌627株（覆蓋個(gè)18菌屬）、革蘭陽(yáng)性菌264株（覆蓋9個(gè)菌屬）、念珠菌43株（20株熱帶念珠菌、15株白念珠菌、4株季也蒙念珠菌、2株近平滑念珠菌、2株光滑念珠菌），其中包括臨床難鑒定的鏈球菌、奈瑟菌和嗜血桿菌等菌種。另納入5株臨床常用標(biāo)準(zhǔn)菌株，包括大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、流感嗜血桿菌（ATCC 49247）和白念珠菌（ATCC 14053），標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇培養(yǎng) 將所有保存菌株復(fù)蘇后，分別轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基或沙保弱培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司），35 ℃孵育18～24 h，生長(zhǎng)緩慢的菌株適當(dāng)（48 h）延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

1.2.2 菌種鑒定 采用直接涂抹法，同時(shí)使用2套質(zhì)譜系統(tǒng)[ASTA MicroIDSys MALDI-TOF MS儀及配套CoreDB數(shù)據(jù)庫(kù)（簡(jiǎn)稱(chēng)MicroIDSys系統(tǒng)，上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司）和Biotyper MS型系統(tǒng)及配套DB2969數(shù)據(jù)庫(kù)（簡(jiǎn)稱(chēng)Biotyper系統(tǒng)，德國(guó)布魯克·道爾頓公司）]對(duì)臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行菌種鑒定。取少量純培養(yǎng)菌落直接涂抹于靶板，滴加1 μL基質(zhì)液（α-氰基-4-羥基肉桂酸）。自然干燥后上機(jī)分析。當(dāng)某1套或2套系統(tǒng)鑒定失敗，或2套系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致時(shí)，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ，PCR）和基因測(cè)序方法作為參考方法：擴(kuò)增rPorB基因并測(cè)序，比對(duì)不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌；擴(kuò)增hisA基因并測(cè)序，比對(duì)伯克霍爾德菌屬細(xì)菌，擴(kuò)增16S rDNA基因并測(cè)序，比對(duì)其他細(xì)菌；擴(kuò)增ITS基因并測(cè)序，比對(duì)真菌。PCR擴(kuò)增和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測(cè)序結(jié)果與基因文庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)，確定菌種類(lèi)型。

1.2.3 結(jié)果判定 MicroIDSys系統(tǒng)鑒定分值>140為鑒定結(jié)果可信；分值110～140為需要重新鑒定；分值<110為鑒定失敗。Biotyper系統(tǒng)鑒定分值>2.000為鑒定至種水平可信；分值1.700～1.999為鑒定屬水平可信；分值<1.700為無(wú)鑒定結(jié)果。

1.3 術(shù)語(yǔ)定義

1.3.1 準(zhǔn)確鑒定 系統(tǒng)鑒定結(jié)果可信，并與參考方法鑒定結(jié)果種水平一致。因某些菌種復(fù)合體內(nèi)各種蛋白指紋圖譜相似度較高，種鑒定正確和復(fù)合體鑒定正確均認(rèn)定為“準(zhǔn)確鑒定”。本研究涉及的菌種復(fù)合體包括：（1）鮑曼不動(dòng)桿菌種復(fù)合體[4]；（2）陰溝腸桿菌種復(fù)合體[5]；（3）洋蔥伯克霍爾德復(fù)合群[6]；（4）緩癥/口腔鏈球菌[7]；（5）蠟樣芽孢復(fù)合群[8]。

1.3.2 鑒定至屬水平 MicroIDSys系統(tǒng)僅提供菌屬名稱(chēng)，Biotyper系統(tǒng)重復(fù)2次試驗(yàn)鑒定結(jié)果均為屬水平可信，結(jié)果與參考方法結(jié)果一致，判定為鑒定至屬水平。

1.3.3 鑒定失敗 MicroIDSys系統(tǒng)提示“鑒定失敗”，Biotyper系統(tǒng)重復(fù)2次試驗(yàn)鑒定結(jié)果分值均<1.700，判定為鑒定失敗。

1.3.4 鑒定錯(cuò)誤 系統(tǒng)認(rèn)為準(zhǔn)確鑒定，但與參考方法鑒定結(jié)果不一致，判定為鑒定失敗。

2 結(jié)果

2.1 2套系統(tǒng)鑒定結(jié)果

MicroIDSys系統(tǒng)和Biotyper系統(tǒng)對(duì)5株標(biāo)準(zhǔn)菌株和43株念珠菌臨床分離株均能準(zhǔn)確鑒定。對(duì)于934株臨床分離株，MicroIDSys系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率為96.1%（898/934），有11株鑒定失敗，有25株鑒定錯(cuò)誤（均鑒定為屬內(nèi)其他菌種）；Biotyper系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率為98.3%（918/934），有6株被鑒定至屬水平，2株溶血色桿菌無(wú)鑒定結(jié)果，8株鑒定錯(cuò)誤。2套系統(tǒng)未準(zhǔn)確鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 MicroIDSys系統(tǒng)和Biotyper系統(tǒng)未準(zhǔn)確鑒定結(jié)果

2.2 2套系統(tǒng)革蘭陰性菌鑒定結(jié)果

對(duì)于627株革蘭陰性菌，MicroIDSys系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率為95.1%（596/627）；有9株鑒定失敗，包括3株變棲克雷伯菌、4株溶血嗜血桿菌、1株腦膜炎奈瑟菌、1株產(chǎn)吲哚黃桿菌；有15株鑒定錯(cuò)誤，其中2株阿氏腸桿菌（陰溝腸桿菌復(fù)合群）被鑒定為神戶(hù)腸桿菌，1株潘氏變形桿菌被鑒定為奇異變形桿菌，2株流感嗜血桿菌被鑒定為副流感嗜血桿菌，8株微黃奈瑟菌被鑒定為淺黃奈瑟氏菌，2株溶血色桿菌被鑒定為紫色色桿菌。Biotyper系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率為98.1%（615/627）；有4株被鑒定至屬水平（2株流感嗜血桿菌和2株微黃奈瑟菌）；2株溶血色桿菌無(wú)鑒定結(jié)果；6株鑒定錯(cuò)誤，其中2株溶血嗜血桿菌被鑒定為流感嗜血桿菌，4株微黃奈瑟菌被鑒定為淺黃奈瑟菌。

2.3 2套系統(tǒng)革蘭陽(yáng)性菌鑒定結(jié)果

對(duì)于264株革蘭陽(yáng)性菌中，MicroIDSys系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率為95.5%（252/264）；有2株假白喉棒狀桿菌鑒定失??；有10株鑒定錯(cuò)誤，其中2株前庭鏈球菌被鑒定為唾液鏈球菌，4株假肺炎鏈球菌有2株被鑒定為肺炎鏈球菌、2株被鑒定為緩癥鏈球，1株鼠李糖乳桿菌被鑒定為副甘酪乳桿菌，3株溶血孿生球菌被鑒定為麻疹孿生球菌。Biotyper系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率98.5%（260/264），有2株被鑒定至屬水平（1株假白喉棒狀桿菌、1株前庭鏈球菌）；2株假肺炎鏈球菌鑒定錯(cuò)誤，被鑒定為肺炎鏈球菌。

3 討論

MicroIDSys系統(tǒng)及配套CoreDB數(shù)據(jù)庫(kù)（包含2 604種細(xì)菌、真菌、分枝桿菌）是從韓國(guó)引進(jìn)的新一代質(zhì)譜系統(tǒng)。有研究結(jié)果顯示，MicroIDSys系統(tǒng)對(duì)5 322株細(xì)菌和酵母菌的鑒定結(jié)果與Biotyper系統(tǒng)的一致性很好，種水平符合率為86.1%，屬水平符合率為98.4%[9]。另有研究結(jié)果顯示， MicroIDSys系統(tǒng)對(duì)酵母菌的鑒定結(jié)果與分子生物學(xué)方法的符合率為95.1%（270/284）[10]；對(duì)厭氧菌的鑒定準(zhǔn)確率為91.6%（340/370）[11]；MicroIDSys系統(tǒng)對(duì)63株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定準(zhǔn)確率為98.4%（62/63），對(duì)167株分枝桿菌臨床分離株的鑒定準(zhǔn)確率為85.6%[12]。JUNG等[13]的研究結(jié)果顯示，MicroIDSys系統(tǒng)對(duì)臨床分離菌株的鑒定準(zhǔn)確率為96.7%（1 988/2 055），VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）的鑒定準(zhǔn)確率為97.3%（1 999/2 055），提示MicroIDSys系統(tǒng)的檢測(cè)性能與VITEK MS相當(dāng)，可用于鑒定細(xì)菌和酵母菌臨床分離株。趙琳娜等[14]評(píng)價(jià)了MicroIDSys系統(tǒng)對(duì)169種常見(jiàn)微生物的鑒定效能，結(jié)果顯示，MicroIDSys系統(tǒng)、Autof MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（鄭州安圖公司）和Biotyper系統(tǒng)種水平鑒定準(zhǔn)確率分別為86.4%（146/169）、91.1%（154/169）和81.7%（138/169），3種質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)常見(jiàn)微生物均有很好的鑒定效能，其中Autof MS在可信水平上的準(zhǔn)確鑒定率較高；但該項(xiàng)研究收集的菌株數(shù)量較少，覆蓋面較小。本研究收集浙江省某三級(jí)甲等綜合性醫(yī)院2012—2020年留存的大量菌株（934株）進(jìn)行驗(yàn)證，其中包括鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬等臨床易混淆的菌株，全面覆蓋臨床常涉及的微生物，結(jié)果顯示，MicroIDSys系統(tǒng)種水平鑒定準(zhǔn)確率為96.1%，提示MicroIDSys系統(tǒng)在臨床微生物鑒定方面具有可靠性。

本研究鑒定失敗的細(xì)菌共11株，其中6株腦膜炎奈瑟菌和10株產(chǎn)吲哚金黃桿菌各有1株鑒定失敗。本研究采用最基本的直接涂抹法，雖節(jié)省時(shí)間，但和甲酸涂抹法、甲酸萃取法相比，可能會(huì)存在涂布薄厚不均或細(xì)胞破壁不理想的情況，在實(shí)際工作中可以根據(jù)菌株特性來(lái)選擇合適的前處理方法，以提升質(zhì)譜系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率。CoreDB數(shù)據(jù)庫(kù)中未包含變棲克雷伯菌，可能是本研究3株變棲克雷伯菌均鑒定失敗的原因。對(duì)于假白喉棒狀桿菌和溶血嗜血桿菌，雖然數(shù)據(jù)庫(kù)中有相關(guān)數(shù)據(jù)，但本研究鑒定失敗，從實(shí)驗(yàn)圖譜來(lái)看，數(shù)據(jù)峰較差，可能與涂布方法和菌株生長(zhǎng)情況有關(guān)，后續(xù)研究將對(duì)這2種細(xì)菌進(jìn)行更多驗(yàn)證，以排除操作不當(dāng)?shù)挠绊憽?/p>

本研究鑒定錯(cuò)誤的細(xì)菌共25株，均為屬內(nèi)鑒定錯(cuò)誤，且大部分是由于MicroIDSys系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)缺少相關(guān)參考菌株數(shù)據(jù)所致。潘氏變形桿菌、微黃奈瑟菌、前庭鏈球菌、假肺炎鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和溶血孿生球菌均都被鑒定為屬內(nèi)其他細(xì)菌，提示對(duì)于此類(lèi)細(xì)菌，需要納入更多參考菌株進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)。本研究部分鑒定錯(cuò)誤的細(xì)菌，如MicroIDSys系統(tǒng)將阿氏腸桿菌（2株）鑒定為神戶(hù)腸桿菌，流感嗜血桿菌（2株）鑒定為副流感嗜血桿菌；Biotyper系統(tǒng)將2株溶血嗜血桿菌鑒定為流感嗜血桿菌，提示對(duì)于同一菌屬中基因同源性較高的菌株，采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定容易混淆。有研究結(jié)果顯示，VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)將50株溶血嗜血桿菌中的21株鑒定為流感嗜血桿菌[15]。將更多參考菌株納入數(shù)據(jù)庫(kù)中，Biotyper系統(tǒng)對(duì)流感嗜血桿菌的鑒定錯(cuò)誤率可由13.1%降低至0[16]。遺憾的是，質(zhì)譜技術(shù)用于奈瑟菌的鑒定并不可靠，UNALAN-ALTINTOP等[17]發(fā)現(xiàn)，Biotyper系統(tǒng)鑒定的3株奈瑟菌經(jīng)過(guò)16S rRNA測(cè)序驗(yàn)證，顯示2株鑒定錯(cuò)誤，僅1株和測(cè)序結(jié)果符合，尤其是淺黃奈瑟菌、深黃色奈瑟菌和Neisseria iguanae親緣關(guān)系十分接近[18]，采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定更為困難。另外，不能區(qū)分假肺炎鏈球菌和肺炎鏈球菌也是質(zhì)譜技術(shù)的局限性之一[19]。對(duì)于這幾類(lèi)容易混淆的菌種，質(zhì)譜鑒定結(jié)果的判讀需要更加慎重，建議用更高質(zhì)量的圖譜更新數(shù)據(jù)庫(kù)，以增強(qiáng)識(shí)別能力，避免遺漏或錯(cuò)誤識(shí)別[20]。本研究中，2套系統(tǒng)均未能準(zhǔn)確鑒定2株溶血色桿菌。近年來(lái)，溶血色桿菌感染人類(lèi)的報(bào)道逐漸增多，該菌對(duì)很多抗菌藥物天然耐藥[21]。在2套系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中均未包含溶血色桿菌相關(guān)信息，Biotyper系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)僅包含紫色色桿菌和鐵杉樹(shù)色桿菌， MicroIDSys系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)僅包含紫色色桿菌。本研究中的2株溶血色桿菌，Biotyper系統(tǒng)無(wú)鑒定結(jié)果，MicroIDSys系統(tǒng)鑒定為紫色色桿菌，在屬水平上有提示意義。

綜上所述，MicroIDSys系統(tǒng)對(duì)臨床常見(jiàn)微生物有較好的鑒定能力，但對(duì)一些少見(jiàn)菌種和容易混淆的細(xì)菌，仍需通過(guò)更新數(shù)據(jù)庫(kù)信息來(lái)提高鑒定準(zhǔn)確率。