苗文佳， 谷 昊， 李 剛

（國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 北京市兒科研究所血液疾病研究室，北京 100045）

出血性疾病是止血功能障礙引起自發(fā)或輕微外傷后出血不止或反復(fù)出血的一組疾病，兒童期較為常見，約占兒科血液病的30%[1]。血小板功能異常所致先天性出血性疾病較為罕見，臨床上主要分為血小板無力癥（Glanzmann thrombasthenia，GT）、巨大血小板綜合征（Bernard-Soulier syndrome，BSS）、貯存池病。光學(xué)比濁法（light transmittance aggregometry，LTA）是血小板功能檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，主要通過各種生理性致聚劑誘導(dǎo)血小板聚集來檢測(cè)血小板最大聚集率（maximum aggregation rate，MAR）。血栓彈力圖（thromboelastography，TEG）是一種新型的床旁檢測(cè)血液黏彈性的方法，可綜合評(píng)價(jià)全血凝溶狀態(tài)，其參數(shù)血栓最大振幅（maximum amplitude，MA）可用來評(píng)價(jià)血小板聚集功能。目前，關(guān)于通過MAR、MA來鑒別GT和BSS的研究較少。本研究通過比較不同致聚劑誘導(dǎo)的MAR和MA值在GT和BSS中的差異，分析2項(xiàng)指標(biāo)在伴血小板功能障礙的先天性出血性疾病中的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年7月—2021年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心確診為先天性出血性疾病的患兒57例，其中男36例、女21例，年齡5.5（2.3～8.1）歲，包括GT患兒24例（GT組）、BSS患兒13例（BSS組）和凝血因子缺乏癥患兒20例（對(duì)照組）。3個(gè)組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的MAR<55%和MA值<52 mm作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，審批號(hào)為[2021]-E-244-R。

1.2 主要儀器與試劑

美國(guó)Helena公司AggRAM血小板聚集儀和配套誘導(dǎo)劑[5 μmol/L ADP、2.5 μg/mL膠原蛋白（collagen，Col）、500 μg/mL花生四烯酸（arachidonic acid，AA）、1.5 mg/mL瑞斯托霉素（Ristocetin，Risto）]。美國(guó)Haemoscope公司TEG5000血栓彈力圖儀和配套分析軟件 。

1.3 樣本采集和處理

采集所有患兒空腹靜脈血4 mL，枸櫞酸鈉抗凝，用于血小板聚集試驗(yàn)。先將血液樣本200×g離心10 min，分離富血小板血漿；再1 500×g離心15 min，提取乏血小板血漿。用乏血小板血漿調(diào)整富血小板血漿中的血小板數(shù)量至（200～250）×109/L待測(cè)[5]。采用全血樣本直接上機(jī)分析TEG。所有血液樣本確保表觀無溶血、乳糜、黃疸。

1.4 方法

將AggRAM血小板聚集儀預(yù)熱20 min，至恒溫（37 ℃）后進(jìn)行光路定標(biāo)。將乏血小板血漿作為空白對(duì)照，測(cè)定透光度；在富血小板血漿中加入小磁珠和致聚劑，待血小板聚集濁度出現(xiàn)變化，形成血小板聚集曲線5 min后，記錄MAR。將20 μL氯化鈣加入測(cè)試杯，再將用340 μL高嶺土激活的血液樣本緩緩加入測(cè)試杯中，記錄MA值，2 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件和GraphPadPrism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間配對(duì)比較采用非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)價(jià)MAR與MA值的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血小板聚集功能比較

GT組ADP、Col、AA誘導(dǎo)的MAR和MA值均低于對(duì)照組和BSS組（P<0.01），Risto誘導(dǎo)的MAR低于對(duì)照組（P<0.01）。BSS組Risto誘導(dǎo)的MAR低于對(duì)照組和GT組（P<0.01），AA誘導(dǎo)的MAR與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組血小板聚集功能結(jié)果比較

表1 各組血小板聚集功能比較

2.2 各組不同致聚劑誘導(dǎo)的MAR與MA值相關(guān)性分析

各組不同致聚劑誘導(dǎo)的MAR與MA值均無相關(guān)性（P>0.05）。見表2。

表2 各組4種致聚劑誘導(dǎo)的MAR與MA值的相關(guān)性分析

3 討論

GT和BSS均為兒童常染色體隱性遺傳的先天性出血性疾病，臨床上BSS較GT更為罕見，發(fā)病率不足1/100萬[6]。血小板聚集試驗(yàn)是診斷GT和BSS重要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目。不同種類、濃度致聚劑體外誘導(dǎo)原理在不同疾病中存在差異，本研究選用4種致聚劑進(jìn)行血小板聚集試驗(yàn)：Risto介導(dǎo)血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb受體與血管性血友病因子相互作用；AA經(jīng)環(huán)氧化酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)檠ㄍ锳2；Col需預(yù)先誘導(dǎo)血小板釋放ADP，ADP通過作用人體細(xì)胞膜表面特異性受體來激活磷脂酶C，促進(jìn)體內(nèi)鈣離子的釋放，引發(fā)第一時(shí)相血小板聚集。采用TEG參數(shù)MA值評(píng)價(jià)纖維蛋白原和血小板通過GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合后血凝塊最大強(qiáng)度和穩(wěn)定性，可間接反映血小板聚集功能。

GT和BSS均為血小板的膜糖蛋白缺陷，但機(jī)制不盡相同。GT為GPⅡb/Ⅲa基因突變導(dǎo)致的蛋白復(fù)合物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)和功能障礙，可使除Risto外的生理性致聚劑誘導(dǎo)的血小板聚集水平大大減低。本研究中，GT組Risto誘導(dǎo)的MAR處于參考區(qū)間（55%～90%）內(nèi)，其他3種致聚劑誘導(dǎo)的MAR均顯著降低，與相關(guān)研究結(jié)果[7]一致。李健等[8]提出，MA值聯(lián)合血小板聚集試驗(yàn)和流式血小板功能分析可鑒別診斷GT，與本研究GT組MA值低于對(duì)照組和BSS組的結(jié)果基本相符。BSS是由GPⅠb/Ⅴ/Ⅸ復(fù)合物基因缺陷導(dǎo)致的，患者血小板不能黏附于受損血管壁。有研究發(fā)現(xiàn)，BSS患兒血小板體積巨大、數(shù)量少，反應(yīng)體系濁度變化不能完全反映血小板聚集水平[9]，與本研究結(jié)果不一致。對(duì)于血小板數(shù)量不足的樣本，本研究采取增加采血量、降低離心力和僅收集富血小板血漿上層血漿等方法來保證反應(yīng)體系血小板數(shù)量滿足需求，減少因血小板數(shù)量不足所致的結(jié)果偏差。

本研究中，BSS組MA值基本處于參考區(qū)間（52～70 mm）內(nèi)，提示MA值評(píng)價(jià)血小板黏附功能欠佳，與ADLER等[10]MA值無法監(jiān)測(cè)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致的凝血功能障礙的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，BSS組與對(duì)照組AA誘導(dǎo)的MAR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05），后續(xù)將增大樣本量持續(xù)觀察，以確認(rèn)這一差異。有研究結(jié)果顯示，GT患者Risto誘導(dǎo)的MAR為正?；蚺R界正常[11-12]，GT患者與對(duì)照者Risto誘導(dǎo)的MAR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，2個(gè)組雖有差異，但結(jié)果均在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)?？紤]到兒童與成人MAR參考區(qū)間不同，建議各臨床實(shí)驗(yàn)室建立本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目的參考區(qū)間，以有效體現(xiàn)其臨床價(jià)值。

有研究結(jié)果顯示，MAR與MA評(píng)價(jià)血小板聚集功能存在較好的相關(guān)性[13]，但本研究發(fā)現(xiàn)，4種致聚劑誘導(dǎo)的MAR與MA值在各組中均不存在線性關(guān)系。MAR和MA值均受血小板和纖維蛋白原共同作用，原因可能是2種方法的檢測(cè)原理和干擾因素不同，MAR反應(yīng)體系為富血小板血漿，加入致聚劑激活血小板后，GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物暴露出纖維蛋白原受體，并與其結(jié)合，使血小板聚集，利用透光度差異計(jì)算血小板聚集率，反應(yīng)過程中白細(xì)胞和紅細(xì)胞已被基本去除，無法監(jiān)測(cè)到生理狀態(tài)下血小板與各細(xì)胞間的相互作用，如血管壁受損時(shí)血小板的黏附狀態(tài)[14]。LTA檢測(cè)光路僅能識(shí)別5個(gè)及以上血小板聚集后的較大聚集物，對(duì)于體積較小的聚集物濁度變化不易記錄。紅細(xì)胞混雜、標(biāo)本量和血小板數(shù)量減少等分析前因素均可導(dǎo)致懸液透光度發(fā)生變化，對(duì)MAR檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。另外，MA值檢測(cè)體系為全血，借助高敏感懸垂絲動(dòng)態(tài)描繪整個(gè)凝血過程中血凝塊的黏彈力變化，有效分析全血凝溶過程，與MAR比較，對(duì)小顆粒更為敏感[2，15]。LTA檢測(cè)過程中同樣存在諸多干擾因素，全血樣本直接上機(jī)無法觀察溶血、乳糜等外觀狀態(tài)，如果樣本溶血、磷脂暴露、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量異常增多，均可影響MA值檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[16-17]。

綜上所述，MAR和MA值在檢測(cè)血小板功能障礙方面各有優(yōu)勢(shì)和局限性。MAR在診斷和鑒別GT和BSS方面更有優(yōu)勢(shì)，MA診斷BSS則準(zhǔn)確性欠佳。多個(gè)致聚劑聯(lián)合檢測(cè)MAR可更好地反映先天性出血性疾病患兒的血小板功能。作為一項(xiàng)回顧性研究，本研究樣本量較小，尚需更多數(shù)據(jù)來驗(yàn)證MAR和MA值評(píng)價(jià)血小板功能障礙的有效性和臨床價(jià)值。