宋皓月， 舒 文

（上海市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，上海 201620）

棒狀桿菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，大多為條件致病菌。結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌因可產(chǎn)生結(jié)核硬脂酸（10-甲基十八烷酸）而有別于其他棒狀桿菌[1]，臨床較為少見(jiàn)。近年來(lái)，隨著分離、鑒定水平的提高，國(guó)外已有關(guān)于結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌引起肉芽腫性乳腺炎的報(bào)道[2-3]，但我國(guó)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)分離自肉芽腫性乳腺炎患者膿液樣本的結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌的耐藥性和毒力因子攜帶情況進(jìn)行分析，為臨床診治此類(lèi)少見(jiàn)菌感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集1株上海市第一人民醫(yī)院分離自無(wú)菌環(huán)境下穿刺抽取的乳腺膿液樣本的棒狀桿菌。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎鏈球菌（ATCC 49619）購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 方法

將穿刺所得乳腺膿液樣本接種于血瓊脂平板（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司），35 ℃5% CO2培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。將膿液樣本分別注入需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶（美國(guó)BD公司）培養(yǎng)5 d，采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)所得微生物進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行全基因組測(cè)序。采用紙片擴(kuò)散法和E-試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)所得微生物進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)；E-試驗(yàn)紙條購(gòu)自杭州康泰公司，相關(guān)藥物敏感性紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星、利福平、利奈唑胺、亞胺培南、美羅培南藥物敏感性結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSI）M45-A文件[4]標(biāo)準(zhǔn)解讀；青霉素、四環(huán)素藥物敏感性結(jié)果參照2021年歐洲藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）[5]標(biāo)準(zhǔn)解讀；頭孢類(lèi)藥物敏感性結(jié)果參照CLSI M100文件[6]中鏈球菌屬的標(biāo)準(zhǔn)解讀，慶大霉素、左氧氟沙星藥物敏感性結(jié)果參照CLSI M100文件[6]中金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)解讀。

2 結(jié)果

2.1 微生物培養(yǎng)結(jié)果

穿刺所得膿液樣本于血瓊脂平板35 ℃ 5%CO2環(huán)境培養(yǎng)48 h后，可見(jiàn)白色、乳酪樣、無(wú)溶血的小菌落（圖1）。該菌于厭氧環(huán)境中可生長(zhǎng)。膿液樣本在需氧和厭氧的血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5 d未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。

圖1 膿液樣本培養(yǎng)48 h菌落形態(tài)

2.2 革蘭染色結(jié)果

挑取培養(yǎng)所得菌落，革蘭染色后于鏡下觀察，可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性短桿菌，排布散亂，呈并列或V字形排列。見(jiàn)圖2。

圖2 培養(yǎng)陽(yáng)性菌落革蘭染色鏡下形態(tài)（×1 000）

2.3 菌株鑒定結(jié)果

MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果顯示，根據(jù)特征峰解讀，該菌株為結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌（置信度99.9%）。見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌MALDI-TOF MS 質(zhì)譜圖

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

該結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌在MH瓊脂平板不生長(zhǎng)，藥物敏感性分析結(jié)果顯示，該菌株對(duì)紅霉素、克林霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、磷霉素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)左氧氟沙星表現(xiàn)為中介，對(duì)其他抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌藥物敏感性分析結(jié)果

2.5 耐藥基因和毒力因子分析結(jié)果

全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，該結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌攜帶多種耐藥基因和毒力因子。耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaTEM、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因erm（X）、氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因gyrA和gyrB、利福平耐藥基因rpoB和rbpA、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因TlyA和rpsL、鏈霉素耐藥基因rpsL和gidB。毒力因子包括鐵離子調(diào)控蛋白DtxR、（p）ppGpp合成相關(guān)蛋白R(shí)elA、雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)TcrX和PhoP、菌毛組分蛋白SpaE和SpaF。

3 討論

一般情況下，結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌在人體皮膚和黏膜表面作為一種正常定植菌存在。有研究結(jié)果顯示，該菌可能導(dǎo)致炎癥性乳房疾病、胰腺脂膜炎、慢性鼻竇炎和手術(shù)部位感染等[7]。本研究中，乳腺穿刺膿液在需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)5 d仍為陰性，與相關(guān)文獻(xiàn)[8]結(jié)果一致?？赡芘c結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌的親脂性有關(guān)，血培養(yǎng)瓶中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為大豆酪蛋白消化肉湯，不能為該菌株的生長(zhǎng)提供豐富的脂質(zhì)，不利于其生長(zhǎng)。

本研究中的結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌分離自1例肉芽腫性乳腺炎患者乳腺膿液樣本。目前，肉芽腫性乳腺炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，可能與自身免疫、細(xì)菌或病毒感染等有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，棒狀桿菌屬可能參與了超敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)了肉芽腫的形成[9-10]。

常規(guī)實(shí)驗(yàn)室理化檢測(cè)鑒定棒狀桿菌屬存在一定困難，需要使用MALDI-TOF-MS或其他更為先進(jìn)的鑒定方法。本研究在分離菌株后，采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，置信度為99.9%。

因棒狀桿菌尚無(wú)明確、全面的藥物敏感性判斷折點(diǎn)，本研究聯(lián)用多種標(biāo)準(zhǔn)，以進(jìn)行更合理的結(jié)果判讀，結(jié)果顯示，分離的菌株對(duì)紅霉素、克林霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、磷霉素均耐藥，對(duì)左氧氟沙星中介，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)（青霉素、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、亞胺培南、美羅培南）和慶大霉素、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺等均表現(xiàn)為敏感，與相關(guān)文獻(xiàn)[8]結(jié)果基本一致。本研究全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該菌攜帶6種耐藥基因。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥相關(guān)的核糖體甲基化酶基因erm主要分為A、B、C、X型，本研究分離菌株為X型，多見(jiàn)于雙歧桿菌和棒桿菌屬；X型主要作用機(jī)制是使大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可酰胺類(lèi)藥物作用的核糖體蛋白甲基化，菌株表現(xiàn)出對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥[11-12]，本研究的藥物敏感性分析結(jié)果與其相符。氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因gyrA、gyrB的耐藥決定區(qū)出現(xiàn)突變，編碼蛋白與喹諾酮藥物結(jié)合能力下降，是菌株對(duì)喹諾酮耐藥的主要原因[13]。本研究分離菌株對(duì)左氧氟沙星中介，其耐藥機(jī)制還有待于進(jìn)一步探究。此外，本研究還檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因TEM、利福平耐藥基因rpoB和rbpA、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因TlyA，但均未表現(xiàn)出相應(yīng)藥物的耐藥性，這可能與相應(yīng)的基因未被激活，不能產(chǎn)生相關(guān)活性蛋白有關(guān)[12，14-15]。本研究分離菌株對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑和磷霉素表現(xiàn)為耐藥，但未檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因，可能存點(diǎn)突變或膜通透性[2]改變等其他未檢出的耐藥機(jī)制。本研究分離菌株攜帶鏈霉素耐藥基因rpsL和gidB，但缺乏相關(guān)判讀標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法判斷其藥物敏感性[16-17]。臨床耐藥情況與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果不完全相符的原因可能為：（1）本研究藥物敏感性分析為體外試驗(yàn)，與臨床實(shí)際可能存在一定差異；（2）棒狀桿菌屬藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)目前仍不完善，很多抗菌藥物仍無(wú)判讀標(biāo)準(zhǔn)，本研究中部分抗菌藥物參考了其他菌屬的判讀標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果可能存在一定的偏差。

本研究全基因組測(cè)序檢出6種毒力因子，包括DtxR、RelA、TcrX、PhoP、SpaE、SpaF。DtxR是鐵離子依賴(lài)的毒素調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)參與細(xì)菌的鐵離子負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)保護(hù)細(xì)菌，避免其氧化受損[18]。RelA作為核糖體蛋白，可以催化合成（p）ppGpp，抑制RNA的合成，誘導(dǎo)其降解途徑，并參與調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的基因表達(dá)[19]。TcrX與TcrY為雙組分系統(tǒng)，TcrY通過(guò)四股螺旋束形成二聚體，自身發(fā)生磷酸化將磷酸基傳遞給TcrX，兩者間的相互作用可能與某種信號(hào)的傳遞相關(guān)[20-21]。PhoP和PhoQ同樣為雙組分系統(tǒng)，由感應(yīng)蛋白PhoP和反應(yīng)調(diào)控蛋白PhoQ共同組成，菌體借此感知外界微環(huán)境中H+、抗菌肽、Mg2+的變化，直接或間接協(xié)調(diào)數(shù)百個(gè)毒力基因的表達(dá)，以抵御宿主免疫系統(tǒng)的捕殺，與致病力密切相關(guān)[22]。本研究2種雙組分結(jié)構(gòu)均只檢出單一結(jié)構(gòu)，可能與檢測(cè)方法的局限性有關(guān)。SpaE和SpaF均為SpaD型菌毛小亞單位組分，屬于菌體表面菌毛結(jié)構(gòu)，菌體借此黏附錨定于細(xì)胞壁表面，使菌體與宿主緊密結(jié)合，從而產(chǎn)生致病力[23]。相關(guān)毒力因子共同作用，使結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌侵入人體，導(dǎo)致感染。

綜上所述，結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌引起的肉芽腫性乳腺炎在我國(guó)罕見(jiàn)，可能與該菌具有親脂性，表現(xiàn)為在普通血平板生長(zhǎng)緩慢、血培養(yǎng)瓶中不能生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，以及鑒定方法的限制有一定的關(guān)系。本研究從分子水平初步分析了該菌的耐藥基因和毒力因子攜帶情況，并分析了其與表型的吻合度，可為該菌引起的感染性疾病的診治提供參考。建議臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)此類(lèi)罕見(jiàn)致病菌多加關(guān)注，根據(jù)其生物學(xué)特性，選擇合適的培養(yǎng)方式和鑒定方法，以提高檢出率。