田 元，屈小娟，劉建書，劉玉鳳，趙玉珍，陳麗英，韓曉玲*

(1.西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 710000；2.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安 710003；3.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及人民飲食結(jié)構(gòu)的改變，高血糖、高血壓、高血脂等疾病發(fā)病率日益上升。在醫(yī)學(xué)上，當空腹血糖≥7 mmol/L時可判定為糖尿病[1]。目前，全球4位糖尿病患者中，中國患者即占1人，中國成人糖尿病患病率居世界第1位[2-3]，糖尿病及其并發(fā)癥嚴重危害著國民生命健康。

基于此，西安力邦制藥有限公司聯(lián)合陜西功能食品工程中心有限公司，依據(jù)中醫(yī)糖尿病發(fā)病理論，合作開發(fā)了舒諾顆粒保健食品，該產(chǎn)品以一定量的玉米須、枸杞子、葛根、生地黃、黃芪、五味子、西洋參、富鉻酵母及其他輔料加工制成。經(jīng)功能試驗證明該產(chǎn)品能降血糖，可起到輔助預(yù)防和治療糖尿病的作用。

舒諾顆粒配方中：①黃芪[4-7]：可增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，抑制腦干神經(jīng)元的細胞凋亡，顯著改善高血糖和氧化應(yīng)激引起的中樞神經(jīng)損傷；還可以防治糖尿病視網(wǎng)膜、心腦血管和腎臟病變等并發(fā)癥；②西洋參[8-9]：通過保護和恢復(fù)胰島β細胞，增加胰島素敏感性等多種方式，促進胰島素分泌；③枸杞子[10]：可保護胰島功能，改善胰島素抵抗，預(yù)防及控制糖尿病并發(fā)癥發(fā)生。此外，因產(chǎn)品中含葛根素、粗多糖、皂苷等多種生理活性物質(zhì)，這些成分協(xié)同作用，具有輔助降血糖的功能。

因此，本研究對舒諾顆粒中黃芪、西洋參、枸杞子進行定性鑒別，將葛根素、粗多糖、皂苷作為該產(chǎn)品的功效成分，采用薄層色譜法(TLC)鑒定黃芪、西洋參、枸杞子，高效液相色譜法(HPLC)測定葛根素含量，紫外可見分光光度法測定粗多糖、總皂苷含量，并制定葛根素、粗多糖、總皂苷的含量限度，以期為舒諾顆粒質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

舒諾顆粒(陜西功能食品工程中心有限公司生產(chǎn)，批號：20171001、20171002、20171003，規(guī)格：6 g/袋)；舒諾顆粒陰性樣品(分別缺少黃芪、西洋參、枸杞子，按舒諾顆粒制備工藝自制)；糖化酶(上?；菡\生物科技有限公司)；人參皂苷Rb1(批號：110704-201726，純度91.1%)、人參皂苷Re(批號：110754-201626，純度97.4%)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201731，純度93.6%)、擬人參皂苷F11(批號：110841-201607)、西洋參對照藥材(批號：120997-201309)、黃芪甲苷對照品(批號：110781-201717，純度：96.9%)、枸杞子對照藥材(批號：121072-201611)、葛根素(批號：110752-201615，純度95.4%)、D-葡萄糖對照品(批號：110833-201707，純度99.9%)購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G254薄層色譜板、硅膠G薄層色譜板均購自青島圣浦林環(huán)?？萍加邢薰?；實驗用水為超純水，甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 儀器

離心機(德國sigma 型號：3-30KS)；高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司 型號：Agilent 1260)；電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司 型號：BSA224S)；數(shù)顯水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司 型號：HH4)；超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司 型號：KQ3200E)；紫外分析光度計(上海光譜儀器有限公司 型號：SP-756P)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法

2.1.1 黃芪鑒別 (1)樣品溶液制備。黃芪甲苷對照品溶液[11]：以甲醇為溶劑，制成黃芪甲苷濃度為1 mg/mL的溶液。

黃芪藥材溶液[11]：按照2015年版《中國藥典》一部黃芪鑒別中規(guī)定方法制備。

舒諾顆粒供試品溶液、舒諾顆粒陰性對照液(缺黃芪)[11-12]：按照2015版《中國藥典》一部黃芪鑒別中規(guī)定方法制備供試品溶液及陰性對照溶液，過D101型大孔樹脂柱(內(nèi)徑1.2 cm，柱高15 cm)，分別用水50 mL、35% 乙醇50 mL、70% 乙醇80 mL洗脫，收集70% 乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.1 mL溶解，得舒諾顆粒供試品溶液、舒諾顆粒陰性對照液(缺黃芪)。

(2)鑒別方法[11]。按照2015年版《中國藥典》一部中黃芪薄層色譜法規(guī)定鑒別。見圖1。

注：1.黃芪甲苷；2.黃芪藥材；3.20171001號樣品；4.20171002號樣品；5.20171003號樣品；6.陰性對照。

由圖1可知，在薄層色譜中，舒諾顆粒供試品與黃芪甲苷對照品、黃芪對照藥材圖譜相應(yīng)位置、熒光斑點逐一對應(yīng)，清晰可見，且陰性對照無干擾，表明該法具有專一性，可用于舒諾顆粒中黃芪鑒別。

2.1.2 西洋參鑒別 (1)樣品溶液制備?；旌蠈φ掌啡芤?、西洋參對照藥材溶液、西洋參藥材溶液[13]：按照2020年版《中國藥典》一部西洋參鑒別中規(guī)定方法制備。

舒諾顆粒供試品溶液、舒諾顆粒陰性對照溶液(缺西洋參)[13-14]：按照2020年版《中國藥典》一部西洋參鑒別中規(guī)定方法制備供試品溶液及陰性對照溶液，上D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑12 mm，柱高15 cm)，以水50 mL洗脫，棄水液，用35% 乙醇50 mL洗脫，棄洗脫液，繼用70% 乙醇 80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL溶解，得舒諾顆粒供試品溶液、舒諾顆粒陰性對照溶液(缺西洋參)。

(2)鑒別方法。除以三氯甲烷-甲醇-水(31∶14∶5)5～10 ℃ 放置12 h的下層溶液為展開劑外，其余步驟按照2020版《中國藥典》四部中薄層色譜法(通則0502)試驗規(guī)定進行。見圖2。

注：1.混合對照；2.西洋參對照藥材；3.西洋參藥材；4.20171001號樣品；5.20171002號樣品；6.20171003號樣品；7.陰性對照。

由圖2可知，在薄層色譜中，供試品與混合對照品、西洋參對照藥材、西洋參藥材圖譜相應(yīng)位置、熒光斑點逐一對應(yīng)，清晰可見，表明該法具有專一性，可用于舒諾顆粒中西洋參鑒別。

2.1.3 枸杞子鑒別 (1)樣品溶液制備。枸杞子對照藥材溶液、枸杞子藥材溶液[13]：按照2020版《中國藥典》一部枸杞子鑒別中規(guī)定方法制備。

舒諾顆粒供試品溶液、舒諾顆粒陰性對照溶液(缺枸杞子)[13]：取樣1.5 g研制成粉末，加水70 mL，其余步驟按照2020版《中國藥典》一部枸杞子鑒別中規(guī)定方法制備。

(2)鑒別方法。按照2020版《中國藥典》四部中薄層色譜法(通則0502)[13]試驗規(guī)定進行。見圖3。

注：1.枸杞子對照藥材；2.枸杞子藥材；3.20171001號樣品；4.20171002號樣品；5.20171003號樣品；6.陰性對照。

由圖3可知，在薄層色譜中，供試品與枸杞子對照藥材、枸杞子藥材圖譜相應(yīng)位置、熒光斑點逐一對應(yīng)，清晰可見，表明該法具有專一性，可用于舒諾顆粒中枸杞子鑒別。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 葛根素含量測定 (1)樣品溶液制備。標準儲備液：精密稱取葛根素對照品8.14 mg，用30% 乙醇于100 mL量瓶中溶解定容，得每1 mL含77.66 μg葛根素的標準儲備液。

供試品溶液[15]：精密稱取舒諾顆粒0.3 g于具塞錐形瓶中，加入30%的乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

(2)色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。分別取標準儲備液和供試樣溶液按照色譜條件：色譜柱：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(25∶75)；流速：1 mL/min；波長：250 nm，進樣量10 μL，記錄圖譜。見圖4。

由圖4可知，在此色譜條件下，對照品和供試品溶液中被測組分均可達到基線分離，且峰型對稱、分離度好。

(3)方法學(xué)考察。線性關(guān)系考察：分別取標準儲備液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、7 mL于10 mL量瓶中，用 30% 乙醇定容。按“2.2.1(2)”色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，求回歸方程。得葛根素的標準曲線方程為：y=47 597x+33 785(r=0.999 8)，結(jié)果表明，葛根素在7.766～54.362 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖4 葛根素對照品(A)、舒諾顆粒樣品(B)HPLC色譜

檢出限試驗：以信噪比3∶1相應(yīng)濃度為檢出限，測定葛根素的檢出限。結(jié)果得出，葛根素的檢出限為2.33 mg/100 g。

精密度試驗：分別取線性測定中的標3溶液和供試品溶液，各重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素面積的RSD分別為0.01%(n=6)、0.35%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：按照“2.2.1(2)”的色譜條件測定同一批次舒諾顆粒樣品中葛根素含量，平行測定6份，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素平均含量為0.313 6 g/100 g，RSD為0.31%(n=6)，表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗：按照“2.2.1(2)”的色譜條件，分別在相對0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時測定同一批次舒諾顆粒樣品中葛根素含量，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素峰面積的RSD=0.81%，表明室溫條件下供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加標回收率試驗：取已知含量舒諾顆粒(批號：20171001，葛根素含量為0.313 6 g/100 g)0.15 g，各9份，置具塞錐形瓶，分為3組，每組分別加入濃度為77.66 μg/mL的葛根素標準儲備液3 mL、6 mL、9 mL，按照“2.2.1(2)”的色譜條件測定，記錄峰面積，計算加標回收率。見表1。

表1 葛根素回收率試驗結(jié)果

由表1可知，葛根素的平均加樣回收率為101.92%，RSD為2.56%(n=9)，該方法可用于舒諾顆粒中葛根素含量測定。

2.2.2 樣品中葛根素含量測定 按照“2.2.1(1)”項下供試溶液的制備方法，制備3批次(20171001、20171002、20171003)舒諾顆粒供試液各2份，按照“2.2.1(2)”的色譜條件測定，記錄峰面積并計算葛根素含量。見表2。

由表2計算可得，3批次舒諾顆粒平均葛根素含量為：0.304 9 g/100 g，按平均含量的90%設(shè)限，規(guī)定葛根素含量不低于0.27%。

表2 葛根素含量測定結(jié)果

2.3 紫外可見分光光度法

2.3.1 粗多糖測定 (1)樣品溶液制備：標準儲備液：稱取無水葡萄糖對照品10.01 mg，置10 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得每mL含1.00 mg無水葡萄糖標準儲備液。

供試品溶液：精密稱取舒諾顆粒1.6 g，加乙醚100 mL，40 ℃加熱回流1 h，靜置冷卻，棄乙醚液，殘渣水浴揮盡乙醚。加80% 乙醇100 mL，80 ℃加熱回流1 h，過濾，濾渣與濾器用80%熱乙醇多次洗滌，濾渣及濾器置燒瓶中，加水150 mL，100 ℃加熱回流2 h。趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液和洗液。添加30 mg糖化酶于60 ℃、pH=4.5條件下酶解2 h，電爐上加熱至沸，冷卻，過濾，取濾液定容至150 mL。取濾液30 mL，置于250 mL錐形瓶，再加入200 mL無水乙醇，混勻，于4 ℃冰箱靜置4 h以上，以6 000 r/min離心15 min，棄上清液，殘渣用水溶解并定容至50 mL，得供試品溶液。

(2)測定方法：①繪制標準曲線：精密量取1 mL標準儲備液于10 mL量瓶中，用水定容至刻度，得到含葡萄糖0.10 mg/mL標準溶液。精密量取標準溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL分別置于10 mL的具塞試管中，加水補至2.0 mL，搖勻，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速精密加入5 mL硫酸，搖勻，放置10 min，100 ℃水浴2 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在485 nm處測定吸光度，重復(fù)3次，以吸光度值(A)為縱坐標，葡萄糖的濃度(μg/mL)為橫坐標，進行線性回歸。

②含量測定：準確取供試品溶液1 mL于10 mL具塞試管，按照“2.3.1(2)①”步驟測定吸光度并計算粗多糖含量。

(3)方法學(xué)考察：線性范圍考察：按照“2.3.1(2)”方法繪制標準曲線，得曲線方程為：A=0.046 6×C+0.006 8(r=0.999 6)，結(jié)果表明，葡萄糖在0～15.00 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

檢出限測定：以20次空白測定值的3倍標準偏差除以標準曲線之斜率(即D.L.=3SD/S)計算，可得粗多糖的檢出限。結(jié)果得出，粗多糖的檢出限為0.04 mg/100 g。

精密度試驗：取葡萄糖標準溶液(0.10 mg/mL)0.6 mL，加水補至2 mL，依法測定吸光度值，結(jié)果表明葡萄糖吸光度的RSD為0.10%(n=6)，儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取20171001批次舒諾顆粒1.6 g，共6份，按“2.3.1(1)”方法制備供試品溶液，依法測定，測量并計算粗多糖平均含量。測得粗多糖平均含量為0.968 2 g/100 g，RSD為1.010 9%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時依法測定吸光度，可得各時間樣品吸光度的RSD=1.25%，表明室溫條件下供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加標回收率試驗：取20171001批號舒諾顆粒(粗多糖含量為0.968 2 g/100 g)0.8 g，各9份，分3組，每組分別加入濃度為1.00 mg/mL的葡萄糖標準貯備液4 mL、8 mL、12 mL，按“2.3.1(1)”項下方法制備供試品溶液，依法測定，記錄吸光度，并計算加標回收率。見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

由表3可知，粗多糖的平均加樣回收率為98.27%，RSD為1.22%(n=9)，該方法可用于舒諾顆粒中粗多糖含量測定。

(4)樣品中粗多糖含量測定。分別測定不同生產(chǎn)批號的3批樣品，計算粗多糖含量。見表4。

由表4計算可得，3批次舒諾顆粒平均粗多糖含量為：0.966 g/100 g，按平均含量的90%設(shè)限，規(guī)定粗多糖含量不低于0.87%。

2.3.2 總皂苷測定 (1)樣品溶液制備：標準貯備液[16]：取人參皂苷標準品0.024 2 g，用甲醇溶解定容至10 mL，制成2.36 mg/mL的人參皂苷Re標準液。

表4 粗多糖含量測定結(jié)果

供試品溶液[16]：稱取舒諾顆粒1 g，置于25 mL量瓶中，加適量水超聲30 min，再用水定容至25 mL，搖勻，放置，濾過。吸取上清液1.0 mL進行柱層析。柱層析方法按照2020年版《保健食品理化及衛(wèi)生指標檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》中總皂苷測定方法進行。

(2)測定方法：標準曲線繪制：精密吸取標準貯備液20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL于蒸發(fā)皿中水浴揮干(低于60 ℃)，在已揮干的蒸發(fā)皿中準確加入0.2 mL 5% 香草醛冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動蒸發(fā)皿，使殘渣溶解，加0.8 mL高氯酸，混勻后移入10 mL帶塞刻度離心管中，60 ℃水浴10 min，取出，冰浴冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL搖勻，以1 cm比色池于560 nm波長處與標準管共同進行比色測定。以吸光度為縱坐標，人參皂苷Re濃度(μg/mL)為橫坐標，進行線性回歸。

含量測定：準確移取供試品溶液1 mL于10 mL具塞試管，按照“2.3.2(2)”步驟測定吸光度值并計算總皂苷含量。

(3)方法學(xué)考察：線性范圍考察：按照“2.3.2(2)”方法繪制標準曲線，得回歸方程為：y=240.84x-9.6157(R2=0.999 1)，結(jié)果表明，人參皂苷Re在47.20～283.20 μg/mL內(nèi)呈良好線性。

檢出限測定：以20次空白測定值的3倍標準偏差除以標準曲線之斜率(即D.L.=3SD/S)計算，可得總皂苷的檢出限。結(jié)果得出，總皂苷的檢出限為0.17 mg/100 g，檢出限越低，靈敏越度高。

精密度試驗：取人參皂苷標準溶液(2.36 mg/mL)60 μL，依法測定吸光度值，結(jié)果人參皂苷Re吸光度的RSD為0.324 8%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取20171001批次舒諾顆粒1 g，共6份，按“2.3.2(1)”項下方法制備供試品溶液，依法測定，測得總皂苷(以人參皂苷Re計)平均含量為0.324 7 g/100 g，RSD為1.85%，表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時依法測定吸光度，可得各時間樣品吸光度的RSD=1.97%，表明室溫條件下供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加標回收率試驗：取20171001批號舒諾顆粒(總皂苷(以人參皂苷Re計)含量為0.324 7 g/100 g)0.5 g，各9份，置100 mL量瓶中，分為3組，分別精密加入人參皂苷Re標準貯備液(2.36 mg/mL)0.4、0.8、1.2 mL，依法測定吸光度，并計算加標回收率。見表5。

表5 回收率試驗結(jié)果

由表5可知，總皂苷的平均加樣回收率為99.02%，RSD為1.63%(n=9)，該方法可用于舒諾顆粒中總皂苷含量測定。

(4)樣品中總皂苷含量測定。按正文分析方法分別測定不同生產(chǎn)批號的3批樣品，計算含量。見表6。

由表6計算可得，3批次舒諾顆粒平均總皂苷含量為：0.320 3 g/100 g，按平均含量的90%設(shè)限，規(guī)定總皂苷含量不低于0.28%。

3 討論

盡管單成分鑒定、含量測定易于實現(xiàn)，但在復(fù)方制劑中，由于受多種因素干擾，因而成分鑒別、含量檢測方法需根據(jù)實際情況調(diào)整。

表6 總皂苷含量測定結(jié)果

3.1 薄層色譜

采用《中國藥典》方法對黃芪和西洋參進行薄層鑒別試驗時，供試品色譜背景較重，斑點較淡，本研究遂對方法進行了調(diào)整。

(1)黃芪薄層色譜鑒別。與《中國藥典》鑒定方法相比，增加了供試樣品溶液大孔吸附樹脂分離純化步驟，其中70%乙醇洗脫，結(jié)果薄層試驗條帶背景較淺，薄層結(jié)果斑點清晰，分離度好。

(2)西洋參薄層色譜鑒別。與《中國藥典》鑒定方法相比，增加了供試樣品溶液大孔吸附樹脂分離純化步驟，并以三氯甲烷-甲醇-水(31∶14∶5) 5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑，得到的薄層色譜斑點清晰、分離好，且各特征成分Rf值適宜，陰性對照無干擾。

3.2 紫外分光光度計

本研究粗多糖含量測定與保健食品中粗多糖含量測定方法比較，增加了糖化酶水解糊精步驟。最終結(jié)果表明，當糖化酶添加量為30 mg，酶解時間2 h時，糊精酶解完全，去除了干擾，確保了檢測結(jié)果的準確性。

4 結(jié)論

本研究建立了舒諾顆粒中黃芪、西洋參、枸杞子的鑒定方法，以及葛根素、粗多糖、總皂苷的含量測定方法，并規(guī)定葛根素含量不低于0.27%，粗多糖含量不低于0.87%，總皂苷含量不低于0.28%，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了可靠的依據(jù)。