楊鎧文，羅保發(fā)，黃益龍，馬寄耀，朱紅麗，何波

盤源性腰痛(discogenic low back pain,DLBP)主要是指椎間盤內(nèi)部結(jié)構(gòu)和代謝功能出現(xiàn)異常，刺激椎間盤內(nèi)疼痛感受器，但不伴神經(jīng)根性癥狀的腰椎間盤退行性疾病[1-3]。DLBP的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，目前仍無確切的病因和發(fā)病機(jī)制。MRI是評價DLBP最常用的檢查方法，但大多數(shù)臨床醫(yī)師和放射科診斷醫(yī)師將觀察重點放在椎間盤上，而忽視了椎旁肌對脊柱穩(wěn)定性的作用。有研究表明，DLBP患者的椎旁肌肉可能會發(fā)生肌肉萎縮和功能障礙等改變[4]，而其導(dǎo)致的脊柱失穩(wěn)可能進(jìn)一步惡化DLBP。因此，評估椎旁肌功能改變有重要意義。T2-mapping是一種新的MR定量技術(shù)，以橫向磁化弛豫時間(T2)為測量指標(biāo)，可定量分析組織成分、水分代謝、乳酸代謝、脂肪浸潤和其它生化指標(biāo)[5-7]。BOLD-MRI是評估神經(jīng)系統(tǒng)功能的常用技術(shù)[8]，測得的R2*(1/T2*)值代表了周圍組織血液中脫氧血紅蛋白和氧合血紅蛋白的比值[8-9]，可反映組織血氧代謝能力及血流灌注的變化情況[10]，因此可用于評估肌肉結(jié)構(gòu)和微循環(huán)狀況。本研究通過行為學(xué)分析來評價大鼠的腰痛程度，影像學(xué)方法來評估大鼠椎旁肌功能改變和微循環(huán)狀況，組織學(xué)檢查來評價椎旁肌肌纖維情況，以及分子生物學(xué)方法評價椎旁肌中炎癥因子的表達(dá)情況，旨在探究磁共振BOLD和T2-mapping成像技術(shù)定量評價椎旁肌功能改變的潛在價值。

材料與方法

1.實驗動物的分組和模型制備

選取清潔級健康雌性SD大鼠36只，體重200～250 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(許可證號：SYXK(滇)K2020-0006 )。將所有大鼠隨機(jī)分為2組：正常組(18只)和腰痛組(18只)。

綜合相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]以及本課題組前期申請的盤源性腰痛大鼠模型的發(fā)明專利(申請(專利)號：CN202011637571.8)，向大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，隨后以大鼠左側(cè)髂嵴平齊于第5腰椎(L5)為定位標(biāo)志，在X線透視的引導(dǎo)下，使用26G針頭以側(cè)后入路方式平行于椎體下緣的方向穿刺L4-5及L5-6椎間盤，向椎間盤內(nèi)注射2.5 μL無菌磷酸緩沖溶液，建立大鼠DLBP模型。造模后1、3和6個月逐批處死大鼠，每批12只(腰痛組6只，正常組6只)，用于組織學(xué)和分子生物學(xué)評價。

2.行為學(xué)評價

分別于造模后1天、1周、2周、1個月、3個月和6個月時進(jìn)行行為學(xué)測試。采用步態(tài)實驗觀察大鼠行走步態(tài)和后肢使用情況并根據(jù)Chatani等[15]的方法進(jìn)行評分。根據(jù)Shi等[16]提出的丙酮實驗和熱板實驗方法，觀察大鼠在椎間盤損傷后對冷熱刺激的敏感程度。采用Millecamps等[17]建議的方法進(jìn)行懸尾實驗，記錄5 min內(nèi)大鼠的彎腰時間，用于評估大鼠的軸向不適感和身體機(jī)能降低程度。

圖1 感興趣區(qū)層面選擇及各肌肉定量參數(shù)值的測量方法。a)在腰椎矢狀面T2WI圖像上，選取L4-5、L5-6椎間盤中心層面作為感興趣層面(白線)；b)L4-5椎間盤橫層面橫軸面T2-mapping圖像，使用Functool軟件沿雙側(cè)椎旁肌肉(多裂肌、豎脊肌和腰大肌)邊緣勾畫ROI，避開肉眼可見的脂肪組織；c)軟件自動將勾畫的ROI復(fù)制到橫軸面BOLD定量參數(shù)偽彩圖上，即可獲得各條肌肉的T2和R2*值。

表1 磁共振掃描序列和參數(shù)

3.影像學(xué)評價

MRI掃描：于造模后1、3和6個月時進(jìn)行影像學(xué)評價。使用GE Discovery MR750w 3.0T磁共振儀和16通道縱向放置老鼠線圈(上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司)。使用1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射的方法麻醉大鼠，大鼠取仰臥位，腰椎置于線圈中央。分別采用常規(guī)序列(T2WI)和功能成像序列(T2-mapping、BOLD)進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)詳見表1。

MRI后處理：使用GE AW4.4工作站和Functool軟件進(jìn)行后處理。選擇L4-5和L5-6椎間盤中心層面，用描點法勾勒出穿刺側(cè)(左側(cè))和健側(cè)(右側(cè))的椎旁肌(多裂肌、豎脊肌和腰大肌)，共12個ROI，軟件自動計算出各ROI的T2和R2*值，計算12個ROI的平均值作為椎旁肌肉的T2和R2*值；其中，T2-mapping的色階范圍為19～81，BOLD MR圖像上色階范圍為28～202，置信度均為0.05(圖1)。

4.組織學(xué)和分子生物學(xué)評價

造模后1、3和6個月時，在MRI檢查后將大鼠行安樂死，每個時間點腰痛組和正常組各6只，于L4-5和L5-6椎間隙水平在穿刺側(cè)(左側(cè))和健側(cè)(右側(cè))椎旁肌組織處取材。其中的一部分組織使用10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，進(jìn)行免疫熒光染色，檢測椎旁肌內(nèi)肌球蛋白重鏈基因MYH1和MYH7的表達(dá)情況，在熒光顯微鏡下觀察和采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0軟件對實驗圖像進(jìn)行分析；其它椎旁肌肉組織采用ELISA法測量TNF-α濃度，根據(jù)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作，分析腰痛組和正常組1、3和6個月時椎旁肌內(nèi)TNF-α的實際濃度。

5.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗；當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，采用曼-惠特尼U檢驗。顯著性水準(zhǔn) α=0.05。

結(jié) 果

1.大鼠行為學(xué)指標(biāo)

正常組和腰痛組大鼠步態(tài)實驗、丙酮實驗、熱板實驗和懸尾實驗結(jié)果見圖2。步態(tài)實驗結(jié)果顯示，術(shù)后6個月時腰痛組大鼠的步態(tài)評分顯著增高，與正常組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.345，P=0.019)。丙酮和熱板實驗結(jié)果顯示，造模后1天至1個月時，腰痛組大鼠在冷、熱刺激下的縮爪時間閾值均下降，但與正常組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；在造模后第3和6個月時則表現(xiàn)為顯著下降，且與正常組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。懸尾實驗結(jié)果顯示，造模后1天至1個月時，腰痛組大鼠的彎腰時間與正常組相比無顯著變化(P>0.05)；于造模后3和6個月時彎腰時間顯著增加，且均與正常組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.696，P=0.022；t=-2.698，P=0.022)。

2.T2-mapping分析

兩組大鼠不同時間點腰椎旁肌肉T2值測量結(jié)果見圖3a。腰痛組大鼠椎旁肌肉的T2值隨著造模后時間的延長呈進(jìn)行性下降，在造模后1個月時與正常組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在造模后3個月(Z=-3.853，P<0.001)和6個月(Z=-5.296，P<0.001)時顯著低于正常組(圖3b～c)。各時間點穿刺側(cè)(左側(cè))與健側(cè)(右側(cè))椎旁肌T2值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 兩組大鼠不同時間點行為學(xué)指標(biāo)點線圖(星號為正常組與腰痛組比較，P<0.05)。a)步態(tài)實驗，腰痛組大鼠造模后步態(tài)評分呈先降低、后增高的表現(xiàn)；b)丙酮實驗，冷刺激縮爪時間閾值腰痛組大鼠于造模后3和6個月時顯著低于正常組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；c)熱板實驗，腰痛組大鼠熱刺激縮爪時間閾值低于正常組，于造模后3和6個月時具有顯著差異；d)懸尾實驗，腰痛組大鼠于造模后3和6個月時彎腰時間顯著大于正常組。

圖3 正常組和腰痛組T2-mapping表現(xiàn)。a)不同時間點兩組大鼠腰椎旁肌肉T2值柱形圖，顯示腰痛組在造模后3和6個月時的T2值顯著低于正常組(*P<0.05)；b)正常組大鼠造模后6個月腰椎旁肌肉的T2-mapping偽彩圖，椎旁肌以藍(lán)色為主；c)腰痛組大鼠造模后6個月腰椎旁肌肉的T2-mapping偽彩圖，椎旁肌偏向綠、黃色，表明其T2值低于正常組。注：肌肉顏色藍(lán)-綠-黃-紅表示T2信號從高到低變化。圖4正常組和腰痛組BOLD-MRI表現(xiàn)。a)不同時間點兩組大鼠腰椎旁肌肉R2*值柱形圖，顯示腰痛組于造模后6個月時的R2*值顯著高于正常組(*P<0.05)；b)正常組大鼠造模后6個月腰椎旁肌肉的BOLD偽彩圖，椎旁肌以藍(lán)色為主；c)腰痛組大鼠造模后6個月腰椎旁肌肉的BOLD偽彩圖，椎旁肌偏向綠色，表明其R2*值高于正常組。注：肌肉顏色藍(lán)-綠-黃-紅表示R2*信號從低到高變化。

3.BOLD-MRI分析

兩組大鼠不同時間點腰椎旁肌肉R2*值的測量結(jié)果見圖4a。腰痛組椎旁肌R2*值隨著造模后時間的延長呈進(jìn)行性上升，在造模后1和3個月時與正常組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在造模后6個月時顯著高于正常組(圖4b～c)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.319，P<0.001)。各時間點穿刺側(cè)(左側(cè))和健側(cè)(右側(cè))椎旁肌R2*值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4.組織學(xué)結(jié)果

兩組大鼠各時間點椎旁肌免疫熒光染色結(jié)果的柱形圖見圖5a～b，免疫熒光染色圖見圖6～7。在造模后1和3個月時腰痛組大鼠椎旁肌肌球蛋白重鏈基因MYH1和MYH7的表達(dá)水平與正常組接近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后6個月時腰痛組的肌球蛋白重鏈基因MYH1表達(dá)明顯增高(Z=-2.882，P=0.004)， MYH7表達(dá)水平明顯減低(Z=-2.882，P=0.004)。各時間點穿刺側(cè)(左側(cè))和健側(cè)(右側(cè))椎旁肌的MYH1和MYH7表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

圖5 兩組大鼠椎旁肌組織學(xué)和分子生物學(xué)指標(biāo)測量結(jié)果的柱形圖(*P<0.05)。a)兩組大鼠造模后各時間點椎旁肌肌球蛋白重鏈基因MYH1表達(dá)水平(熒光強(qiáng)度)比較，腰痛組在造模后6個月時顯著高于正常組；b)兩組大鼠各時間點椎旁肌肌球蛋白重鏈基因MYH7水平(熒光強(qiáng)度)比較，腰痛組在造模后6個月時顯著低于正常組；c)兩組大鼠各時間點椎旁肌中TNF-α含量比較，腰痛組在造模后1個月時顯著高于正常組。

圖6 兩組大鼠各時間點椎旁肌肌球蛋白重鏈基因MYH1免疫熒光檢查顯微鏡下圖像(×20)，顯示造模后6個月時腰痛組的肌球蛋白重鏈基因MYH1表達(dá)水平較正常組明顯增高，紅光表示肌細(xì)胞，藍(lán)光表示細(xì)胞核，紅光的亮度與MYH1的表達(dá)水平成正比。 圖7兩組大鼠各時間點椎旁肌肌球蛋白重鏈基因MYH7免疫熒光檢查顯微鏡下圖像(×20)，顯示造模后6個月時腰痛組的肌球蛋白重鏈基因MYH7表達(dá)水平較正常組明顯減低，紅光表示肌細(xì)胞，藍(lán)光表示細(xì)胞核，紅光的亮度與MYH1的表達(dá)水平成正比。

5.分子生物學(xué)結(jié)果

兩組大鼠各時間點椎旁肌TNF-α表達(dá)水平的ELISA實驗結(jié)果柱狀圖見圖5c。造模后1個月，與正常組相比，腰痛組大鼠椎旁肌中的TNF-α表達(dá)水平顯著增高(t=-10.279，P<0.001)，且達(dá)到高峰；造模后3月和6個月，腰痛組TNF-α表達(dá)水平較造模后1個月逐漸降低，且與正常組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后各時間點穿刺側(cè)(左側(cè))和健側(cè)(右側(cè))椎旁肌內(nèi)TNF-α的表達(dá)水平均無顯著差異(P>0.05)。

討 論

本研究中采用新的MRI定量技術(shù)T2-mapping和BOLD對DLBP大鼠的椎旁肌功能改變進(jìn)行評估，結(jié)果顯示椎間盤發(fā)生退變后，DLBP大鼠出現(xiàn)步態(tài)障礙、對冷熱刺激痛覺過敏和彎腰時間延長等行為學(xué)改變；同時椎旁肌的R2*值增加、T2值減小。手術(shù)結(jié)果可能與DLBP大鼠椎旁肌中出現(xiàn)慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)換及TNF-α含量增加有關(guān)。而這些肌肉改變能通過T2-mapping和BOLD成像進(jìn)行無創(chuàng)性定量評估，他們可為診斷盤源性腰痛提供重要的參考依據(jù)并指導(dǎo)臨床早期干預(yù)。

T2-mapping是通過計算橫向磁化弛豫時間(T2)來檢測組織內(nèi)微量水分子含量的變化，可從分子水平反映組織生化和代謝信息[5-6,18]，目前主要應(yīng)用于椎間盤基質(zhì)成分的變化及關(guān)節(jié)軟骨的研究[7,19-20]。BOLD-MRI是一種對微小血管敏感的無創(chuàng)性成像方法[21]，當(dāng)人體血管中去氧血紅蛋白含量增加的時候，血管內(nèi)及其周圍水分子的T2或T2*信號減低，即增加了鄰近水分子的橫向弛豫率R2(1/T2)和R2*(1/T2*)[22]。其測得的R2*(1/T2*)值可反映組織的血氧代謝能力及血流灌注的情況[10]，可用于評估肌肉的結(jié)構(gòu)和微循環(huán)狀況。

本研究結(jié)果顯示腰痛組大鼠椎旁肌的R2*值隨著造模后時間的延長呈進(jìn)行性增高，T2值則逐漸減小，并于造模后6個月時顯著低于正常組(Z=-5.296，P<0.001)。本課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)腰痛患者椎旁肌R2*值增加、T2值減小，與本實驗結(jié)果相同[23]。同時行為學(xué)檢查結(jié)果顯示，腰痛組大鼠由于腰痛，步態(tài)出現(xiàn)明顯障礙，彎腰時間延長，并出現(xiàn)對冷、熱刺激的痛覺過敏。提示腰痛大鼠的行為變化與椎旁肌退變密切相關(guān)，這可能是由于椎間盤退變造成椎旁肌微循環(huán)灌注減低，使其R2*值增高，同時椎旁肌內(nèi)結(jié)締組織增多[24]，使細(xì)胞水交換受到抑制，使其T2值降低，為保護(hù)受損組織，肌肉產(chǎn)生的反射性抑制導(dǎo)致疼痛和脊柱失穩(wěn)。

在盤源性腰痛發(fā)展過程中，TNF-α作為主要的促炎癥細(xì)胞因子，可加速椎間盤組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致椎間盤組織退變[25]；使背根神經(jīng)生長因子濃度增加，神經(jīng)末梢P物質(zhì)釋放，導(dǎo)致腰痛發(fā)生[26]。進(jìn)而引起椎旁肌肉微循環(huán)受損，椎旁肌的血流量和含氧量減少，椎旁肌內(nèi)有更多的去氧血紅蛋白，表現(xiàn)為在BOLD成像上R2*值相應(yīng)的增加。同時血流灌注的減低導(dǎo)致微血管密度和通透性減低，使水分子由肌間隙向血管內(nèi)遷移，因此T2-mapping成像時局部T2值減小。本模型中腰痛組大鼠椎旁肌內(nèi)TNF-α含量于造模后1個月時顯著升高(t=-10.279，P<0.001)，隨后逐漸下降(P>0.05)。此結(jié)果與既往的大鼠椎間盤損傷模型的研究結(jié)果類似，如Miyagi等[27]發(fā)現(xiàn)在穿刺大鼠L5-6椎間盤造模后的1天至1周內(nèi)椎間盤的TNF-α含量顯著升高，自造模后第2周時開始下降，提示炎癥可引起椎旁肌血供降低，并且參與了早期疼痛的誘發(fā)機(jī)制。

本研究中免疫熒光染色結(jié)果顯示造模后6個月時腰痛組大鼠椎旁肌內(nèi)肌球蛋白重鏈基因MYH1表達(dá)增高(Z=-2.882，P=0.004)、MYH7表達(dá)減低(Z=-2.882，P=0.004)，提示椎旁肌中出現(xiàn)慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)換，而肌纖維轉(zhuǎn)換會導(dǎo)致肌肉微循環(huán)灌注減低[28]；同時脫氧血紅蛋白的增加可導(dǎo)致肌肉T2值降低[29]；而慢肌纖維可容納更多的組織水，從而延長T2弛豫時間[30]，這些都可以被T2-mapping成像檢測到。而且，有研究表明TNF-α也可能參與了椎旁肌肌纖維的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)肌肉纖維的降解和成肌細(xì)胞的分化[31-33]。

本研究的不足之處：首先，大鼠雖然是經(jīng)典的用于模擬人類腰痛患者的實驗動物，但是動物與人類之間有不小的種屬差異，仍無法完全充分地模擬真實的腰椎間盤退變。其次，TNF-α參與盤源性腰痛模型的作用機(jī)制目前尚不清楚，且有其它炎癥因子需要驗證。另外，本實驗樣本量尚小，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證。

綜上所述，炎癥因子TNF-α可能參與椎間盤退變，并與椎旁肌內(nèi)肌纖維的轉(zhuǎn)化有關(guān)，從而可影響DLBP大鼠的行為學(xué)改變。T2-mapping及BOLD成像技術(shù)可無創(chuàng)性反映DLBP大鼠椎旁肌肉內(nèi)的炎癥反應(yīng)和肌纖維轉(zhuǎn)化，對DLBP患者椎旁肌的功能評價及指導(dǎo)DLBP的預(yù)防和治療具有一定的潛在價值。