劉啟平,周俊豪,張 寧,韓鵬凱△

(重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院：1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；2.全科醫(yī)學(xué)江南病區(qū) 404000)

在中國(guó)過去的5 000年歷史中記錄了300多次流行病的流行。傳統(tǒng)中草藥在控制這些流行病中起到了巨大的作用，挽救了許多生命。迄今為止，已開發(fā)出數(shù)百種中藥配方用于流行病疫情期間進(jìn)行預(yù)防和治療。目前，新型冠狀病毒引起的傳染性肺炎嚴(yán)重威脅著人民群眾的健康。然而并沒有特定的抗病毒藥物用于治療這種突發(fā)和致命的疾病。疾病流行初期，乃至當(dāng)前的治療方案主要是支持療法和非特異性療法，以減輕患者癥狀。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在中國(guó)流行初期，我國(guó)醫(yī)院收治的患者即開始了中醫(yī)藥治療，中藥在COVID-19的治療中起到了極其重要的作用。不僅是目前的COVID-19，就是2003年傳染性非典型肺炎(SARS)流行時(shí)中醫(yī)藥也取得了良好的療效[1]。我國(guó)COVID-19診療方案明確指出，使用中醫(yī)藥治療COVID-19[2]。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合宣布，中藥可減輕患者發(fā)熱癥狀、糖皮質(zhì)激素用量、并發(fā)癥和控制疾病進(jìn)展。在各版本的COVID-19診療方案中指出，根據(jù)中醫(yī)理論，COVID-19為氣證所致，局限于肺內(nèi)。其基本病機(jī)為濕、熱、毒、瘀。肺濕瘀塞癥基本處方包括麻黃草、苦杏仁、草果、連翹、蒼術(shù)、甘草等。肺毒瘀塞癥基本處方包括苦杏仁、石膏、瓜蔞、大黃、麻黃草、甘草等。肺熱癥基本處方包括麻黃、杏仁、石膏、浙貝母、甘草等。麻杏石甘湯基本處方主要為麻黃、苦杏仁、甘草、石膏等。在抗疫工作中，有學(xué)者根據(jù)患者中醫(yī)癥候在麻杏石甘湯基礎(chǔ)上調(diào)整用藥，利用麻杏石甘湯加減方對(duì)患者施治取得了很好的療效[3-4]。其基本藥方為生石膏、麻黃、桔梗、枇杷葉、杏仁、白術(shù)、茯苓、川貝母、黃芩、桑白皮、炙甘草等。按主證變化不同加減。但目前其作用機(jī)制尚不清楚，進(jìn)一步闡明其機(jī)制有利于更深入認(rèn)識(shí)疾病及更好地治療。

中藥多具有多種成分，通過多種機(jī)制協(xié)同起作用。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來興起的一種基于系統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法，可在分子水平構(gòu)建藥物與疾病的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。貫穿其中的系統(tǒng)生物學(xué)研究與中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的整體系統(tǒng)調(diào)控不謀而合，而其整體性和系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀與辨證論治相一致[5-6]。目前，已有基于此方法的多種藥物、多種疾病的相關(guān)研究[7-9]。實(shí)踐證明，該研究方法對(duì)中藥的成分、作用靶點(diǎn)及通路的篩選具有重要意義。本研究利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上利用分子對(duì)接方法驗(yàn)證了上述結(jié)果的科學(xué)性，旨在為治療COVID-19提供思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)探討麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的作用機(jī)制。

1.2 方法

1.2.1中藥活性成分及靶點(diǎn)基因篩選

在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別輸入基本藥方中的11味中藥名稱，查找各自的有效化學(xué)成分，并依據(jù)口服生物利用度和類藥性兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行篩選目標(biāo)成分，篩選條件為同時(shí)滿足口服生物利用度大于或等于30%、類藥性大于或等于0.18兩個(gè)條件，獲得麻杏石甘湯加減方的活性成分。此數(shù)據(jù)庫(kù)同樣可查詢化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，故在TCMSP平臺(tái)可進(jìn)一步獲得各活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2.2疾病靶點(diǎn)確定

在GeneCard (https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入COVID-19、2019-nCoV、novel coronavirus pneumonia等關(guān)鍵詞，查找COVID-19疾病靶點(diǎn),利用韋恩圖取3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得靶點(diǎn)的并集，然后再使用韋恩圖將麻杏石甘湯加減方活性成分靶點(diǎn)與COVID-19靶點(diǎn)比對(duì)，取其交集作為麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的靶點(diǎn)。

1.2.3構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將獲得的候選靶點(diǎn)通過 Uniprot (https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因，并結(jié)合疾病靶基因?qū)⒑Y選出的成分與靶點(diǎn)基因輸入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)

將上述交集靶基因在String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中進(jìn)行檢索，篩選條件為P<0.05，獲得靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，將其中的網(wǎng)絡(luò)矩陣下載后導(dǎo)入Cytoscape 3.8軟件，使用Cytoscape 3.8軟件將結(jié)果可視化，進(jìn)一步使用其中的CytoNCA插件計(jì)算核心網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5基因本體(GO)富集分析

通過R軟件clusterProfiler包對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，所得通路按P<0.05進(jìn)行篩選，生物學(xué)過程、細(xì)胞定位和分子功能三類，按P值從小至大各取前10位。分析麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的可能相關(guān)功能機(jī)制。

1.2.6京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

通過R軟件clusterProfiler包對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，所得通路按P<0.05進(jìn)行篩選，按P值從小至大取前30位，揭示麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的相關(guān)通路。

1.2.7分子對(duì)接試驗(yàn)方法

通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載藥物有效成分二維結(jié)構(gòu)，然后使用ChemBio3D軟件生成其3D結(jié)構(gòu)。再在PDB(http://www1.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白受體至3D結(jié)構(gòu)文件，然后利用PyMOL軟件去除3D結(jié)構(gòu)中的水分子和小分子配體結(jié)構(gòu)，將上述結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為PDBQT文件，并使用AutoDocktools軟件確定蛋白受體的活性口袋區(qū)域，最后使用vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能為負(fù)表示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，以結(jié)合能小于或等于0時(shí)為受體和配體可自由結(jié)合。一般認(rèn)為，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低發(fā)生的作用可能性越大，結(jié)合能小于0說明配體和受體可自發(fā)結(jié)合[10]。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)

麻杏石甘湯基本藥方活性成分189種，靶點(diǎn)基因330個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)

疾病靶點(diǎn)393個(gè)，中藥化合物與COVID-19共同靶基因22個(gè)，即DPP4、OPRD1、腫瘤壞死因子(TNF)、HMOX1、CYP3A4、PPP3CA、GSTM1、CES1、EGFR、VEGFA、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、POR、PLAT、CRP、MCL1、OPRK1、DRD2、GSTA2、FYN、TBK1、MAP2K1、COMT。見圖1。

圖1 麻杏石甘湯加減方與COVID-19靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

藥物活性成分67個(gè)，潛在靶點(diǎn)22個(gè)。藥物靶基因網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

外周圓形邊緣代表藥物，長(zhǎng)方形代表藥物有效成分，長(zhǎng)方形代表靶基因，長(zhǎng)方形大小代表其連接度。

2.4 PPI及核心網(wǎng)絡(luò)鑒定

PPI有139條邊，22個(gè)節(jié)點(diǎn)。核心網(wǎng)絡(luò)中IL-6、TNF均為連接度最高的節(jié)點(diǎn)。見圖3。

A：網(wǎng)絡(luò)圖；B：核心網(wǎng)絡(luò)。

2.5 生物通路富集分析

生物過程主要涉及絲氨酸調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)外源性物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等，見圖4。麻杏石甘湯加減方治療COVID-19涉及的信號(hào)通路主要為Toll-like受體信號(hào)通路、T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等與炎癥相關(guān)的通路。見圖5。通路的最終靶點(diǎn)之一為IL-6。見圖6。預(yù)測(cè)的靶基因中也有IL-6，二者是相符的。

圖4 GO富集分析氣泡圖

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

圖6 Toll-like受體信號(hào)通路圖

2.6 藥物成分與IL-6蛋白分子對(duì)接

IL-6是其中的核心基因，同時(shí)，IL-6也是參與COVID-19病理生理的中藥炎癥介質(zhì)，所以選用IL-6作為蛋白，分析藥物有效成分與IL-6結(jié)合的能力。麻杏甘石湯加減方中活性化合物與IL-6 有較好的結(jié)合活性，槲皮素、千層紙素A、木犀草素、漢黃芩素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯與IL-6結(jié)合的自由能分別為-7.4、-7.2、-7.4、-7.0 kcal/mol。見表1。

表1 藥物成分與IL-6蛋白分子對(duì)接

3 討 論

COVID-19已形成全球大流行，在全世界引起了嚴(yán)重后果，但目前COVID-19的治療仍然是有限的，迫切需要尋找有效的治療藥物。因此，世界各地科學(xué)家均在積極探索能顯著有效抗擊COVID-19的藥物。目前，還沒有特效藥物治療COVID-19。在中國(guó)的COVID-19治療中，中藥得到了廣泛應(yīng)用，并獲得了良好療效。多項(xiàng)研究回顧性分析了中醫(yī)藥在武漢及其他地區(qū)治療COVID-19的功效，達(dá)成了一個(gè)重要的共識(shí)，即中醫(yī)藥在病毒感染早期和治療階段均有效，并減少了COVID-19輕癥轉(zhuǎn)為重癥及入住重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)的患者數(shù)[11-13]。中醫(yī)藥還常用于協(xié)助ICU患者接受西醫(yī)治療。如患者從ICU轉(zhuǎn)出，中醫(yī)藥在感染恢復(fù)期也顯示出了療效。

盡管中醫(yī)藥在中國(guó)已得到廣泛應(yīng)用，其安全性和有效性在中國(guó)幾乎所有醫(yī)院中均得到了證實(shí)，但其機(jī)制尚不清楚。以往也有相關(guān)研究探討了麻杏石甘湯抗病毒、抗炎的相關(guān)機(jī)制。體外模型研究表明，麻杏石甘湯可直接抑制流感病毒復(fù)制，較利巴韋林具有更好的病毒吸附抑制和宿主細(xì)胞保護(hù)作用[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,麻杏石甘湯能抑制小鼠感染流感病毒后機(jī)體TLR-4-MyD88-TRAF6信號(hào)通路的激活，減輕甲型流感病毒所致的肺損傷[16]。麻杏石甘湯還可改善人體免疫系統(tǒng)，上調(diào)IL-2、IL-4蛋白表達(dá)和分泌水平，并下調(diào)TNF蛋白表達(dá)水平治療病毒性肺炎。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷(ALI)模型的研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯治療改善了大鼠肺微血管通透性和炎性反應(yīng)，提高了LPS暴露后大鼠存活率[17]。此研究還表明，Toll樣受體4抗體(TLR-4)、非受體酪氨酸激酶(SRC)、核因子κB (NF-κB)信號(hào)通路均參與了麻杏石甘湯對(duì)ALI的治療作用。目前，對(duì)COVID-19的發(fā)病機(jī)制已有了一定的認(rèn)識(shí)，有研究表明，COVID-19患者存在多種炎癥因子表達(dá)紊亂，如IL-6、TNF-α等[18]。有研究表明，IL-6與SARS患者肺部炎癥和廣泛肺組織損傷程度呈正相關(guān)[19]；IL-6由TNF、IL-1β刺激產(chǎn)生，檢測(cè)其外周血濃度可用于評(píng)估患者全身炎性反應(yīng)強(qiáng)度[20]。由此可見，IL-6、TNF是COVID-19患者的臨床預(yù)警指標(biāo)。同時(shí)，有研究表明，許多中藥湯劑包括麻杏石甘湯能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、TNF和干擾素(IFN)-γ水平[21-22]。故有理由推測(cè)，IL-6、TNF也是COVID-19的治療靶點(diǎn)。

目前，大型網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和藥物計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了藥理學(xué)的重大進(jìn)展[23]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的藥理機(jī)制及作用靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)和支持。通過GO富集分析可見，分子功能中主要與肽鏈的結(jié)合、氨(基)化物結(jié)合、蛋白磷酸化激酶的活性、生長(zhǎng)因子受體的結(jié)合等有關(guān)，細(xì)胞組分中主要為細(xì)胞膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域膜區(qū)域等，生物學(xué)過程中主要與對(duì)外來化合物的反應(yīng)、激素分泌、激素轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)；通過 KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，主要富集在人巨細(xì)胞病毒感染、低氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、甲流病毒等重要信號(hào)通路。麻杏石甘湯加減方的治療靶點(diǎn)與COVID-19疾病靶點(diǎn)存在多方位交叉，表明藥物可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗COVID-19的作用。也進(jìn)一步說明了其治療COVID-19的通路較多，機(jī)制較復(fù)雜。但從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析中發(fā)現(xiàn)，IL-6是麻杏石甘湯治療COVID-19的一個(gè)靶點(diǎn)基因。而IL-6在COVID-19的病理過程中具有重要作用，COVID-19患者血清IL-6水平升高，隨病情好轉(zhuǎn)IL-6水平下降。本研究結(jié)果顯示，IL-6是麻杏石甘湯加減方治療COVID-19的靶基因，同時(shí)，利用分子對(duì)接方法結(jié)果顯示，藥物中相關(guān)配體與IL-6結(jié)合僅需要較低自由能，可自由結(jié)合為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而對(duì)COVID-19達(dá)到一定的治療作用。

本研究利用分子對(duì)接方法探討了以IL-6為靶蛋白的藥物成分與之結(jié)合能力。以IL-6為靶蛋白的藥物成分為槲皮素、千層紙素A、木犀草素、漢黃芩素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯。分子對(duì)接試驗(yàn)結(jié)果顯示，此4種有效成分均可與靶蛋白IL-6穩(wěn)定結(jié)合。既往研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能通過抑制NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子通路抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與炎性反應(yīng)[24-25]。槲皮素對(duì)皰疹病毒感染機(jī)體后的增殖具有抑制作用，也可拮抗病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26]。木犀草素對(duì)病毒具有一定的抑制作用[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素A也能起到減輕炎性反應(yīng)的作用[28]?；趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能顯著抑制大鼠ALI時(shí)肺組織中TNF -α、IL-10水平，從而改善肺損傷[29]。體外、體內(nèi)和臨床研究均表明，木犀草素的主要藥理作用機(jī)制是其抗炎活性，其抗炎活性來源于其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄激活因子3、NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子[30]。此外，漢黃芩素能明顯抑制流感病毒感染后肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)各種炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生,具有抗炎作用[31]。由此可見，這4種成分不僅能與IL-6靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合，而且之前多數(shù)研究證明其具有多種抗炎作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)手段和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)麻杏石甘湯加減方的活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，闡釋了其對(duì)COVID-19的分子作用機(jī)制，突出了中藥制劑多成分、多靶標(biāo)對(duì)機(jī)體整體調(diào)控的特點(diǎn)，為其治療COVID-19提供了理論支持。當(dāng)然，目前還迫切需要進(jìn)一步廣泛的研究和臨床試驗(yàn)，包括有更多患者的臨床試驗(yàn)及藥理學(xué)試驗(yàn)，以進(jìn)一步確認(rèn)這些藥物的療效及機(jī)制，以便為COVID-19患者提供更好的治療方案。