儲(chǔ)小毛，王新汝，李澤庚，童佳兵#

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，合肥 230012； 2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)呼吸病防治研究所，合肥 230012； 3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，合肥 230012)

治傷風(fēng)顆粒由葛根湯化裁而成，由葛根、麻黃、桂枝、白芍、大棗、對(duì)乙酰氨基酚和無(wú)水咖啡因等中西藥合成，具有良好的退熱作用[1]。本實(shí)驗(yàn)旨在明確治傷風(fēng)顆粒的退熱效果，并探討其退熱機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，購(gòu)于杭州醫(yī)學(xué)院，生產(chǎn)許可證號(hào)為scxk(皖)2019-0002，體重為(200±20)g。大鼠于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。倫理審查批件號(hào)：AHUCM-rats-2021029。

1.2 儀器

RT-6000型酶標(biāo)儀(雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；JS-1070P型自動(dòng)曝光儀(上海培清科技有限公司)；JW3021HR型離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；GL-88B型漩渦混合器(其林貝爾儀器制造有限公司)；DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；ZT-12M型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、YB-7LF型生物組織包埋機(jī)、YT-7FB型生物組織攤烤片機(jī)(亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；RM2016型徠卡切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；電子體重秤(中科生命科技股份有限公司)；灌胃針(北京寶元興業(yè)科技有限公司)；電子數(shù)字體溫計(jì)[歐姆龍(中國(guó))有限公司]。

1.3 藥品與試劑

治傷風(fēng)顆粒(明通化學(xué)制藥股份有限公司第二廠，國(guó)藥準(zhǔn)字ZC20171003，批號(hào)：19089009)；布洛芬片(天方藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022628，批號(hào)：200509063)；安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號(hào)：JYM0419Ra)、大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號(hào)：JYM0646Ra)、大鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號(hào)：JYM0446Ra)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號(hào)：JYM0635Ra)、大鼠去甲腎上腺素(NE，貨號(hào)：JYM0587Ra)、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH，貨號(hào)：JYM0425Ra)、大鼠α-黑素細(xì)胞刺激素(α-MSH，貨號(hào)：JYM1025Ra)、大鼠精氨酸加壓素(AVP，貨號(hào)：JYM0888Ra)和大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP，貨號(hào)：JYM0574Ra)均購(gòu)于武漢基因美科技有限公司；3%戊巴比妥鈉溶液；0.9%氯化鈉溶液。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將SPF級(jí)SD大鼠40只隨機(jī)分為正常組、模型組(等體積的0.9%氯化鈉溶液)、布洛芬組(72 mg/kg)和治傷風(fēng)顆粒組(2.16 g/kg)，每組10只。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠3 d，用電子體溫計(jì)持續(xù)3 d、每日2次測(cè)量大鼠肛溫，使其適應(yīng)測(cè)溫操作。然后采取預(yù)防式干預(yù)措施，四組大鼠連續(xù)以10 mL/kg的體積灌胃給藥3 d，1日1次。禁食不禁水6 h后測(cè)肛溫3次取均值為基礎(chǔ)體溫，灌胃0.5 h后造模：除正常組大鼠皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液外，其余各組大鼠以10 mL/kg劑量皮下注射20%的干酵母混懸液(由0.9%氯化鈉溶液配制而成)。間隔1 h測(cè)肛溫并記錄。在造模后5 h再次灌胃給藥，第8 h測(cè)肛溫后采集標(biāo)本。

于最后1次測(cè)肛溫后，取3%戊巴比妥鈉溶液，按0.1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，并于腹主動(dòng)脈取血，置于37 ℃環(huán)境下靜置。隨后迅速取出全腦，置于冰袋上，冰浴下取大鼠下丘腦，以0.9%氯化鈉溶液清洗并用濾紙吸濕后，分別放入標(biāo)本管擰緊擦干后置于液氮罐及10%甲醛固定液中。1 h后以3 500 r/min離心(離心半徑10 cm)血液10 min后分離收集上清液，并將液氮罐中的標(biāo)本管轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中貯藏備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及生化檢測(cè)血清及下丘腦中內(nèi)生致熱源IL-1β、IL-6和TNF-α含量，中樞發(fā)熱介質(zhì)PGE2含量，下丘腦中CRH、NE和α-MSH含量。采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察下丘腦形態(tài)學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體溫比較

相比于正常組，模型組大鼠的體溫在造模后6、7及8 h顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明造模成功；相比于模型組，布洛芬組及治傷風(fēng)顆粒組大鼠的體溫在造模后7、8 h明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明治傷風(fēng)顆粒具有顯著的解熱作用，見(jiàn)表1。

表1 干酵母致大鼠發(fā)熱實(shí)驗(yàn)中各組大鼠體溫結(jié)果比較Tab 1 Comparison of body temperature of rats in different groups in the experiment of dry yeast-induced

3.2 大鼠下丘腦組織學(xué)形態(tài)學(xué)

與正常組比較，模型組大鼠下丘腦神經(jīng)元核固縮，胞質(zhì)呈現(xiàn)較深伊紅色，細(xì)胞外間隙增大，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及小膠質(zhì)細(xì)胞聚集；與模型組比較，布洛芬組及治傷風(fēng)顆粒組大鼠神經(jīng)元核固縮程度淺，胞質(zhì)呈現(xiàn)與正常組相似的伊紅色，細(xì)胞外間隙較小，僅少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

A.正常組；B.模型組；C.布洛芬組；D.治傷風(fēng)顆粒組A. normal group; b. model group; c. ibuprofen group; D. Zhishangfeng granules group圖1 各組大鼠下丘腦組織切片(HE，×200)Fig 1 Histological sections of hypothalamus of rats in each group (HE, ×200)

3.3 各組大鼠血清及下丘腦IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2水平比較

相比于正常組，模型組大鼠血清和下丘腦中致熱性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、PGE2及TNF-α水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，布洛芬治傷風(fēng)顆粒組大鼠血清和下丘腦中IL-1β、IL-6、PGE2及TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清和下丘腦IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α水平比較Tab 2 Comparison of levels of IL-1β, IL-6, PGE2 and TNF-α in serum and hypothalamus of rats in each group n=6，pg/mL)

3.4 各組大鼠血清及下丘腦AVP、cAMP水平比較

與正常組比較，模型組大鼠血清及下丘腦AVP水平顯著降低，cAMP水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，布洛芬組及治傷風(fēng)顆粒組血清及下丘腦AVP水平顯著升高，cAMP水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清和下丘腦AVP、cAMP水平比較Tab 3 Comparison of levels of AVP and cAMP in serum and hypothalamus of rats in each group n=6，pg/mL)

3.5 各組大鼠下丘腦CRH、NE及α-MSH水平比較

與正常組比較，模型組大鼠下丘腦中CRH水平明顯升高，NE及α-MSH水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，布洛芬組及治傷風(fēng)顆粒組大鼠下丘腦中的NE、α-MSH水平明顯升高，CRH水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠下丘腦CRH、NE及α-MSH水平比較Tab 4 Comparison of levels of CRH, NE and α-MSH in the hypothalamus of rats in each group n=6，pg/mL)

4 討論

《傷寒論》曰：“太陽(yáng)病，項(xiàng)背強(qiáng)幾幾，無(wú)汗，惡風(fēng)，葛根湯主之?！?葛根湯為太陽(yáng)病之代表方，主要用于邪客太陽(yáng)經(jīng)輸，經(jīng)氣不利，衛(wèi)閉營(yíng)郁的證治。治傷風(fēng)顆粒以葛根湯加乙酰氨基酚、無(wú)水咖啡因、鹽酸那可汀和馬來(lái)酸氯苯那敏制備而成，可用于鼻塞、咳嗽、咽喉痛和發(fā)熱等上呼吸道感染癥狀的治療[2-3]。

發(fā)熱由發(fā)熱激活物作用于機(jī)體釋放內(nèi)生致熱原，進(jìn)一步作用于體溫調(diào)節(jié)中樞下丘腦釋放發(fā)熱介質(zhì)，使體溫失衡[4-6]。因此，研究?jī)?nèi)生致熱原、中樞發(fā)熱介質(zhì)是揭示發(fā)熱機(jī)制和藥物解熱機(jī)制的重要途徑[7]。由巨噬細(xì)胞等激活釋放的IL-1β既可直接引起發(fā)熱，也可作為內(nèi)生致熱源使體溫調(diào)定點(diǎn)上移誘導(dǎo)發(fā)熱[8-9]。有研究結(jié)果表明，TNF-α可以刺激PGE2或IL-6生成進(jìn)而促進(jìn)環(huán)氧合酶的合成，發(fā)揮致熱作用，也可以與IL-1β協(xié)同致熱[10-12]。IL-6是促使發(fā)熱最重要的外周致熱源之一，可由中樞及外周的IL-1β介導(dǎo)激發(fā)，可觸發(fā)環(huán)氧合酶2的合成，繼而通過(guò)前列腺素途徑介導(dǎo)發(fā)熱過(guò)程。目前已經(jīng)證實(shí)內(nèi)生致熱源IL-1β、TNF-α和IL-6可直接或間接引起重要的中樞發(fā)熱介質(zhì)PGE2的釋放，進(jìn)而升高體溫[13]。本研究結(jié)果顯示，治傷風(fēng)顆粒能通過(guò)下調(diào)下丘腦和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6及PGE2含量顯著抑制干酵母致熱模型大鼠的體溫。

AVP是下丘腦合成和分泌的中樞性解熱神經(jīng)肽類(lèi)激素，可在腹中隔與中杏仁核起到解熱效果[14-15]。cAMP是下丘腦中接近體溫調(diào)節(jié)終末環(huán)節(jié)的發(fā)熱介質(zhì)，其含量與發(fā)熱程度呈正相關(guān)[16]。CRH是存在于下丘腦組織中具有致熱作用的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其可引起α-MSH等的釋放，發(fā)揮解熱作用[17]。中樞單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE是溫度敏感性神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)之一，可以引起體溫下降[18]。α-MSH是由腺垂體分泌的、具有解熱作用的多肽類(lèi)激素，有研究結(jié)果表明，α-MSH可通過(guò)阻斷IL-1β來(lái)發(fā)揮解熱作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，治傷風(fēng)顆粒能顯著抑制酵母引起的大鼠體溫升高，治傷風(fēng)顆粒組大鼠血清及下丘腦中cAMP、下丘腦中CRH含量明顯低于模型組，血清及下丘腦中AVP以及下丘腦中NE、α-MSH含量明顯高于模型組。表明治傷風(fēng)顆粒能抑制下丘腦CRH的釋放，促進(jìn)NE及α-MSH的釋放，發(fā)揮解熱作用。

綜上所述，治傷風(fēng)顆粒對(duì)酵母致熱模型大鼠有良好的解熱作用，其解熱作用與下調(diào)下丘腦和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2和cAMP表達(dá)，下丘腦中的CRH表達(dá)，上調(diào)下丘腦和血清中AVP以及下丘腦中的NE和α-MSH表達(dá)有關(guān)。