許 坤，張潔帆，王用玉，馬 威，吳玉云，陳 博，曹月龍，趙詠芳，詹紅生，龐 堅(jiān)#

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 200120； 2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 200120)

如意金黃散首見(jiàn)載于明代著名醫(yī)家陳實(shí)功所編著的《外科正宗》：“如意金黃散大黃，姜黃黃柏芷陳蒼，南星厚樸天花粉，敷之百腫自當(dāng)安?！彼^“百腫”，《外科正宗》釋為“癰疽發(fā)背、諸般疔腫、跌撲損傷、濕痰流毒、大頭時(shí)腫、漆瘡火丹、風(fēng)熱天泡、肌膚赤腫、干濕腳氣、婦女乳癰、小兒丹毒，凡外科一切諸般頑惡腫毒”。陳實(shí)功又謂之“凡外科一切諸般頑惡腫毒，隨手用之，無(wú)不應(yīng)效，誠(chéng)為瘡家良便方也”，以其效驗(yàn)。清代吳謙將如意金黃散收入《醫(yī)宗金鑒》?，F(xiàn)代研究結(jié)果顯示，如意金黃散作為外用制劑被廣泛應(yīng)用于靜脈炎、網(wǎng)狀淋巴管炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性乳腺炎、闌尾周?chē)撃[、流行性腮腺炎、肱骨外上髁炎、膝骨關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等感染與非感染性炎癥疾病，可見(jiàn)其局部外用抗炎與抗感染的效用得到了臨床醫(yī)師的廣泛肯定。然而，關(guān)于如意金黃散的效應(yīng)機(jī)制與有效成分研究卻鮮見(jiàn)于報(bào)道，限制了其組方配伍優(yōu)化與制劑的改進(jìn)。既往藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，如意金黃散中的大黃[1]、黃柏[2]、姜黃[3]和白芷[4]等多種藥物均具有抗炎作用。但是，由于如意金黃散組方中所含藥味多樣、成分復(fù)雜，作為外用制劑又涉及藥物透皮吸收的生物利用度等問(wèn)題，使得基于傳統(tǒng)藥理學(xué)研究思路的研究開(kāi)展頗多局限。

2007年，Hopkins[5]率先提出并系統(tǒng)地闡述了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念，將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與機(jī)體生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)合在一起，分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點(diǎn)或模塊的相互作用關(guān)系，從而理解藥物與機(jī)體的相互關(guān)系。近年來(lái)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來(lái)進(jìn)行中醫(yī)病癥的分析以及中藥藥理的機(jī)制探討已成為中醫(yī)藥研究的重要方法[6]。本研究嘗試采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與生物信息學(xué)技術(shù)，運(yùn)用多個(gè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)分析軟件等研究工具，從分子層面探討如意金黃散抗炎作用的活性成分與潛在機(jī)制，為后續(xù)的藥理與制劑研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 篩選炎癥的疾病靶點(diǎn)

運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)[7]，以“inflammation”為關(guān)鍵詞，搜索與炎癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，并以“相關(guān)性分?jǐn)?shù)[8]>5”為篩選條件進(jìn)行篩選，篩選時(shí)間范圍為自建庫(kù)至2021年12月20日。

1.2 篩選如意金黃散的成分及靶點(diǎn)

在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)[9]中分別檢索大黃、黃柏、姜黃、白芷、天南星、陳皮、蒼術(shù)、厚樸、甘草和天花粉，篩選如意金黃散中藥物的活性成分及其相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為score cutoff≥30且P<0.05，篩選時(shí)間范圍為自建庫(kù)至2021年12月20日。

1.3 獲取“炎癥-如意金黃散”交集基因

運(yùn)用R軟件(v4.0.0)，將“1.1”中篩選出的炎癥相關(guān)疾病的靶點(diǎn)基因與“1.2”中篩選出的如意金黃散相關(guān)靶點(diǎn)基因取交集，并繪制出韋恩圖。

1.4 繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

運(yùn)用perl軟件(v5.28.1)，將如意金黃散靶點(diǎn)基因與“炎癥-如意金黃散”交集靶點(diǎn)基因一一映射，再用Cytoscape軟件(v3.7.0)將相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，繪制出“藥物-成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點(diǎn)基因

將“1.3”中獲取的“炎癥-如意金黃散”交集基因?qū)隨tring在線(xiàn)軟件(https://string-db.org/，v11.0)，Organism選項(xiàng)設(shè)置為“Homo sapiens”，將最小互作得分設(shè)置為0.6，繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。從String在線(xiàn)軟件獲得的數(shù)據(jù)中，篩選出連接節(jié)點(diǎn)最多的30個(gè)基因，并繪制出條形圖。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析

為了進(jìn)一步明確如意金黃散抗炎的作用機(jī)制，運(yùn)用R軟件將“炎癥-如意金黃散”交集基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并繪制出相關(guān)柱狀圖和氣泡圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

在“1.4”獲得的“藥物-成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖中，篩選與靶蛋白連接節(jié)點(diǎn)最多的10個(gè)主要活性成分，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中找出這10個(gè)主要活性成分的3D結(jié)構(gòu)，并保存為mol2格式；篩選出連接節(jié)點(diǎn)排序居前10位的靶蛋白，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中找出這10個(gè)靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，并保存為PDB格式。運(yùn)用AutoDock軟件(v1.5.6)將活性成分及靶蛋白轉(zhuǎn)換成pdbqt格式，最后使用Vina將10個(gè)活性成分與10個(gè)靶基因一一進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 篩選炎癥的疾病靶點(diǎn)

運(yùn)用GeenCard數(shù)據(jù)庫(kù)搜索出炎癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因9 921個(gè)，以“相關(guān)性分?jǐn)?shù)>5”為篩選條件進(jìn)行篩選后獲得1 648個(gè)炎癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)基因。

2.2 篩選如意金黃散的成分及靶點(diǎn)，獲取“炎癥-如意金黃散”交集基因

通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選，共得到283種如意金黃散的活性成分，共涉及793個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，見(jiàn)表1；將其與1 648個(gè)炎癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)取交集，結(jié)果顯示共有159個(gè)“炎癥-如意金黃散”交集靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖1。如意金黃散主要活性成分見(jiàn)表2。

表1 如意金黃散成分靶點(diǎn)數(shù)量Tab 1 Target quantity of Ruyi Jinhuang powder

圖1 如意金黃散-炎癥交集靶基因Fig 1 Intersection target genes of Ruyi Jinhuang powder-inflammation

表2 如意金黃散主要活性成分Tab 2 Main active components of Ruyi Jinhuang powder

2.3 繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

運(yùn)用Cytoscape軟件將相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，繪制出“藥物-成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。圖中，菱形表示如意金黃散中所含的中藥名稱(chēng)，圓形表示如意金黃散中所含的中藥活性成分，長(zhǎng)方形表示“炎癥-如意金黃散”交集靶點(diǎn)基因。圖中顯示，如意金黃散主要通過(guò)217個(gè)藥物活性成分作用于159個(gè)靶點(diǎn)，從而發(fā)揮抗炎作用。

圖3 炎癥-如意金黃散交集靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network of target genes at the intersection of inflammation-Ruyi Jinhuang powder

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點(diǎn)基因

通過(guò)String在線(xiàn)軟件構(gòu)建出“炎癥-如意金黃散”交集靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。圖中共有149個(gè)節(jié)點(diǎn)(隱藏10個(gè)游離節(jié)點(diǎn))，862條相互作用關(guān)系。將連接次數(shù)最多的30個(gè)靶點(diǎn)基因篩選出來(lái)，繪制出條形圖，見(jiàn)圖4。

圖4 核心靶基因條形圖Fig 4 Core target gene bar chart

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

將如意金黃散治療炎癥的核心靶點(diǎn)基因運(yùn)用R軟件進(jìn)行GO功能富集分析，得到GO條目2 051個(gè)(P<0.05)，其中涉及生物過(guò)程(BP)的條目1 844個(gè)，占89.9%；涉及細(xì)胞組成(CC)的條目78個(gè)，占3.8%；涉及分子功能(MF)的條目129個(gè)，占6.3%。各排序居前20位的條目見(jiàn)圖5。

A.BP；B.CC；C.MFA.BP；B.CC；C.MF圖5 GO功能富集分析Fig 5 Go enrichment analysis

進(jìn)行KEGG通路富集分析共得到145條(P<0.05)信號(hào)通路，主要包括流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-RAGE受體信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。選擇富集基因最多的前20個(gè)信號(hào)通路繪制氣泡圖，見(jiàn)圖6；并繪制出靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖7。

圖6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis

圖7 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Target-pathway network

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將與靶基因連接節(jié)點(diǎn)最多的10個(gè)主要活性成分和連接節(jié)點(diǎn)排序居前10位的靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表3、圖8。部分分子對(duì)接效果圖見(jiàn)圖9。一般認(rèn)為，受體與配體直接的結(jié)合能越低，則兩者結(jié)合的穩(wěn)定性越高。當(dāng)結(jié)合能≤-20.920 0 kJ/mol時(shí)，說(shuō)明受體和配體可以自由結(jié)合；當(dāng)結(jié)合能≤-29.288 0 kJ/mol時(shí)，說(shuō)明受體和配體結(jié)合后有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。本次分子對(duì)接結(jié)果顯示，結(jié)合能≤-29.288 0 kJ/mol的占20%，結(jié)合能≤-20.920 0 kJ/mol的占86%，表明本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果具有一定的可靠性。

表3 分子對(duì)接結(jié)果(kJ/mol)Tab 3 Molecular docking results (kJ/mol)

圖8 分子對(duì)接評(píng)分熱力圖Fig 8 Thermodynamic diagram of molecular docking score

A.黃體酮-NR3C1；B.黃體酮-TP0；C.去氫二酮-ESR1A. progestin-NR3C1; B. progestin-TP0; C. dehydrodione-ESR1圖9 部分分子對(duì)接效果圖Fig 9 Effect of partial molecular docking

3 討論

既往已有眾多學(xué)者通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法對(duì)中藥治療各種疾病的機(jī)制進(jìn)行了探究，但研究對(duì)象絕大多數(shù)為內(nèi)服藥物。中醫(yī)外用藥物在臨床應(yīng)用廣泛且取得了較好的療效[10]，但對(duì)其藥效機(jī)制的研究報(bào)道卻并不多見(jiàn)。究其原因，可能與相關(guān)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中的篩選方式有關(guān)，如在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，人們常用于篩選中藥成分的指標(biāo)口服生物利用度只適用于篩選口服中藥，而不適用于篩選外用中藥。因此，建議進(jìn)行外用藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析時(shí)，可選用BATMAN-TCM或TCMID等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分篩選。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，炎癥反應(yīng)的過(guò)程即為正邪斗爭(zhēng)的過(guò)程[11]。持續(xù)的炎癥反應(yīng)在不同程度上影響著人們的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥通過(guò)扶正祛邪的方式治療炎癥已有悠久歷史，有著成本低、療效佳、不良反應(yīng)小和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，且注重辨證論治和整體觀念，可在消除局部炎癥的同時(shí)調(diào)節(jié)全身的免疫狀況[12]。

本研究結(jié)果提示，香芹酮、黃體酮、姜黃酮、反式苯亞甲基丙酮、10-十一烯酸、去氫莪術(shù)二酮和香葉基丙酮等化合物可能是如意金黃散抗炎作用的主要活性成分?！把装Y-如意金黃散”交集靶點(diǎn)基因的PPI關(guān)系顯示，INS、蛋白激酶B(Akt1)、白蛋白(ALB)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1和腫瘤壞死因子(TNF)等是如意金黃散發(fā)揮抗炎作用的核心靶點(diǎn)基因。有研究結(jié)果表明，患者在遭受重癥創(chuàng)傷的同時(shí)，常會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激性高血糖，從而加大感染的風(fēng)險(xiǎn)，INS可以通過(guò)調(diào)控血糖水平來(lái)抑制炎癥反應(yīng)從而降低感染概率[13]。李坤等[14]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Akt1的表達(dá)水平，可以下調(diào)TNF-α、白細(xì)胞介素6等炎癥因子的表達(dá)。MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶中的一種，與細(xì)胞分化、凋亡和炎癥密切相關(guān)。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如意金黃散抗炎機(jī)制的相關(guān)通路主要涉及流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等。(1)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路：動(dòng)脈粥樣硬化為常見(jiàn)的慢性疾病，其發(fā)病具有與炎癥相似的變質(zhì)、滲出及增生等特點(diǎn)，抗炎也已成為治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的新思路[15-16]。(2)神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路：研究結(jié)果表明，神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控具有重要作用，交感神經(jīng)的過(guò)度激活會(huì)加重炎癥反應(yīng)，而副交感神經(jīng)可以通過(guò)降低腫瘤壞死因子受體1的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[17]。(3)雌激素信號(hào)通路：雌激素的作用具有多效性，影響著機(jī)體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素的急性丟失會(huì)增加活性氧的水平，并激活核因子κβ和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，表明雌激素具有明顯的抗炎特性[18]。(4)環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路：環(huán)磷酸腺苷是穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞屏障的最有效的信號(hào)分子之一，環(huán)磷酸腺苷的刺激可以有效阻斷大多數(shù)炎癥介質(zhì)所致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加[19]。(5)糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路：Tang等[20]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高水平的TNF-α顯著促進(jìn)了2型糖尿病患者機(jī)體內(nèi)的慢性炎癥，該過(guò)程可能由糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等多個(gè)通路完成，而TNF-α下調(diào)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，如意金黃散可能是通過(guò)香芹酮、黃體酮和姜黃酮等多種酮類(lèi)活性成分參與流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等多個(gè)途徑作用于INS、Akt1、ALB、MAPK1和TNF等多個(gè)靶點(diǎn)，從而發(fā)揮抗炎作用，且運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，提示黃體酮和去氫莪術(shù)二酮與關(guān)鍵抗炎靶點(diǎn)能夠最佳結(jié)合。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)如意金黃散抗炎作用的分子機(jī)制進(jìn)行探究，為后續(xù)中醫(yī)外用藥的推廣和應(yīng)用提供了新思路和新方向。由于藥物制劑的調(diào)配差異以及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件算法的不足，使得本研究結(jié)果有著一定的局限性，為取得更加詳實(shí)可靠的研究數(shù)據(jù)，還需通過(guò)基礎(chǔ)或臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。