張 娜,劉志偉,劉德廣

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院,楊凌 712100)

長期以來,害蟲防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥,這不僅能帶來“3R”問題(即害蟲抗藥性、農(nóng)藥殘留、害蟲的再猖獗),還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。尋找安全、高效、廣譜性的抗蟲基因來增強植物抗性成為害蟲防治研究的重點,植物蛋白酶抑制劑是其中一個重要的研究方向。蛋白酶抑制劑(PIs)是一種廣泛存在于植物組織中的小分子多肽或蛋白質(zhì),距今已有70多年的研究歷史[1-3]。在昆蟲消化道中,PIs能抑制消化蛋白酶的水解活性,從而對其生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。PIs也能夠進入害蟲的血淋巴,干擾免疫系統(tǒng),并降低卵母細(xì)胞的增殖能力[5]。本文綜述了植物蛋白酶抑制劑的生理功能、昆蟲的適應(yīng)機制以及蛋白酶抑制劑在蚜蟲防治方面的最新研究進展,并展望了蛋白酶抑制劑研究的未來發(fā)展趨勢及在蚜蟲防治方面的應(yīng)用前景。

1 植物蛋白酶抑制劑生理功能

植物蛋白酶抑制劑在貯藏器官(如塊莖和種子)、根、莖及葉片等組織中均有發(fā)現(xiàn)。蛋白酶抑制劑是植物體內(nèi)的貯藏蛋白,也是內(nèi)源性蛋白酶調(diào)節(jié)因子,參與種子萌發(fā)、種子休眠等生理過程。一般根據(jù)酶的活性位點及其氨基酸序列的同源性可將其分為4類:絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、酸性蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。目前研究比較深入的是絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑,因為很多鱗翅目、直翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲的主要消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶,而許多鞘翅目昆蟲的主要消化蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。一些研究表明,絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑也可抑制蚜蟲的消化蛋白酶活性,且效果顯著[6]。各種植物蛋白酶抑制劑的生理功能主要體現(xiàn)在生理調(diào)節(jié)、抵御環(huán)境脅迫、抗蟲性等幾個方面。

1.1 貯藏蛋白和調(diào)節(jié)因子

植物蛋白酶抑制劑是一種貯藏蛋白。在植物種子萌發(fā)過程中,其所含的蛋白酶抑制劑能被水解,從而為種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育提供氮源和碳骨架[7]。另外,植物蛋白酶抑制劑也是一種活性調(diào)節(jié)因子。蛋白酶抑制劑具有蛋白酶的水解活性,能通過蛋白酶的水解作用來調(diào)控相關(guān)蛋白的降解[8]。如通過基因改造,水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑(oryzacystatinⅠ,OCⅠ)基因在馬鈴薯塊莖中成功表達后,能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖內(nèi)可溶性蛋白明顯增加,而可溶性糖的含量顯著降低,這反映了OCⅠ不僅能調(diào)控蛋白酶的水解作用,也能抑制淀粉酶活性[9]。此外,蛋白酶抑制劑也存在于植物體的其他組織內(nèi),調(diào)節(jié)各種蛋白酶的生理活性功能和蛋白代謝[10]。

1.2 抵御環(huán)境脅迫

植物體內(nèi)包含多種蛋白酶抑制劑,能夠在干旱、高溫、鹽及氧化脅迫等條件下被誘導(dǎo)表達,調(diào)控多種蛋白酶的代謝和生理活性,維持組織細(xì)胞滲透平衡,提高植物耐受性[11-17]。大量研究結(jié)合其防御非生物脅迫的基本原理,根據(jù)植物遺傳轉(zhuǎn)化的生物技術(shù),利用啟動子過表達相關(guān)蛋白酶抑制劑基因,增強了植物對非生物脅迫的耐受性。比如,Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑在擬南芥中誘導(dǎo)表達,提高了擬南芥的抗旱性[11];板栗半胱氨酸蛋白酶抑制劑被高溫和鹽脅迫誘導(dǎo)表達,提高了植物對不良環(huán)境的耐受性[12]。Kunitz型蛋白酶抑制劑在蕓薹屬植物中誘導(dǎo)表達,響應(yīng)高溫和干旱脅迫[13]。對于植物自身而言,非生物脅迫不僅能夠直接導(dǎo)致滲透壓失衡的損害,也能夠引起一系列氧化應(yīng)激反應(yīng),蛋白酶抑制劑通過調(diào)控多種蛋白酶的代謝,也可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)[16-17]。

1.3 抗蟲性

不少研究表明,植物蛋白酶抑制劑能抑制各類昆蟲消化蛋白酶的水解,擾亂昆蟲正常的生長發(fā)育,表現(xiàn)出明顯的抗蟲性[18-40]。從表1可以看出,各蛋白酶抑制劑的效果因不同昆蟲(如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目等)體內(nèi)主要消化蛋白酶種類不同而不同。如絲氨酸蛋白酶抑制劑能調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶活性,調(diào)節(jié)雙翅目昆蟲的生長發(fā)育[18-19],影響鱗翅目昆蟲幼蟲體重和發(fā)育歷期及成蟲發(fā)育歷期、繁殖力、存活率等[20-21]。而半胱氨酸蛋白酶抑制劑通過水解半胱氨酸蛋白酶,影響鞘翅目昆蟲的正常生長發(fā)育[28]。多數(shù)鱗翅目昆蟲的主要消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶,而多數(shù)鞘翅目昆蟲的主要消化蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。因此,半胱氨酸蛋白酶抑制劑對鞘翅目昆蟲的抗蟲效果一般優(yōu)于絲氨酸蛋白酶抑制劑。非寄主植物的蛋白酶抑制劑對植食性昆蟲也具有顯著抗蟲性[29-30]。絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑均能夠減輕蚜蟲體重,延長若蚜發(fā)育歷期,降低種群密度[36]。因此,蛋白酶抑制劑在蚜蟲等刺吸式昆蟲的防治中也具有一定的潛力。

表1 植物蛋白酶抑制劑的具體抗蟲功能Table 1 Specific functions of plant protease inhibitors against insects

昆蟲行為也會影響植物蛋白酶抑制劑基因的表達,從而影響植物的抗蟲水平[36,41-44]。例如,甜菜夜蛾Spodopteraexigua取食造成植物葉片損傷,可直接誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑基因表達[36]。稻縱卷葉螟的取食能誘導(dǎo)拔節(jié)期至揚花期水稻葉片中胰蛋白酶抑制劑基因表達,但抑制其在乳熟期的表達[41-42]。二化螟Chilosuppressalis取食也能誘導(dǎo)水稻中胰蛋白酶抑制劑的高表達,從而使得水稻對該蟲表現(xiàn)出誘導(dǎo)抗蟲性[43];但隨后褐飛虱Nilaparvatalugens取食能抑制胰蛋白酶抑制劑的表達,降低水稻對二化螟的抗性[44]。而且昆蟲取食為害后能誘發(fā)植物的過敏反應(yīng),刺激植物體內(nèi)產(chǎn)生病原相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins,PR),這些PR會進一步影響蛋白酶抑制劑介導(dǎo)的昆蟲-植物之間的互作。

微觀層面蛋白酶抑制劑的作用機制與昆蟲蛋白酶的活性位點密切相關(guān)。蛋白酶抑制劑與昆蟲蛋白酶的活性位點或變構(gòu)位點結(jié)合,抑制其蛋白水解酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶。根據(jù)蛋白酶抑制劑與蛋白酶的結(jié)合位點,可將蛋白酶抑制劑分為3類[45]:1)雙頭抑制劑,具有兩個不同的活性位點;2)多結(jié)構(gòu)域抑制劑,如塊莖休眠和防御相關(guān)的多聚體半胱氨酸蛋白酶抑制劑;3)多種蛋白酶抑制劑聚合體。蛋白酶抑制劑可通過與各種蛋白酶的結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白酶的水解活性,影響昆蟲體內(nèi)重要的生理過程如葉酸合成(葉酸參與核酸物質(zhì)的合成)[46]、減緩脂質(zhì)代謝[47]、蛻皮過程[如下調(diào)保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)、保幼激素環(huán)氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和保幼激素二醇激酶(juvenile hormone diol kinase,JHDK)的基因表達][48]。

總的來看,PIs在昆蟲-植物協(xié)同進化中能發(fā)揮重要作用,各種植物中都含有蛋白酶抑制劑,研究較多的是豆科(如豇豆等)、茄科(如煙草等)以及禾本科(如水稻等)植物的PIs[37-49],其他植物PIs的研究明顯不足?，F(xiàn)有研究雖然發(fā)現(xiàn)了很多植物PIs,但其效用都沒有達到足以防治害蟲的強度,需要開發(fā)效用更高的PIs。而且,一些最根本的問題仍然沒有得到解決,如PIs在不同昆蟲腸道上作用靶標(biāo)的進化特點和演變規(guī)律的異同,再加上害蟲能對植物PIs產(chǎn)生適應(yīng)性,使得目前仍很難在生產(chǎn)上利用PIs防治害蟲。

2 昆蟲適應(yīng)機制

植物蛋白酶抑制劑作為一種防御蛋白,能抑制各種昆蟲蛋白酶的水解活性,干擾昆蟲正常生長發(fā)育,但昆蟲對其也會逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性。如飼喂絲氨酸蛋白酶抑制劑開始時能顯著降低大豆夜蛾Anticarsiagemmatalis胰蛋白酶和總蛋白酶活性,但連續(xù)飼喂兩周后,該蟲體內(nèi)總蛋白酶活性會有一定程度恢復(fù)甚至升高[25]。有研究基于密碼子機制-經(jīng)驗組合(mechanistic-empirical combination,MEC)進化模型比較了鞘翅目四紋豆象Callosobruchusmaculatus、玉米根螢葉甲Diabroticavirgifera和馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata的25個中腸半胱氨酸蛋白酶基因的編碼序列,對高度變異的氨基酸及結(jié)構(gòu)位點進行了深入分析,發(fā)現(xiàn)對昆蟲蛋白酶的正選擇作用以及昆蟲快速進化適應(yīng)植物蛋白酶抑制劑的有力證據(jù)[50]。因此,在長時間進化過程中,昆蟲能對蛋白酶抑制劑產(chǎn)生適應(yīng)性,其適應(yīng)方式包括調(diào)節(jié)消化道內(nèi)環(huán)境pH、分泌蛋白酶、改變蛋白酶構(gòu)象等。

2.1 昆蟲適應(yīng)機制的種類

2.1.1調(diào)節(jié)消化道內(nèi)環(huán)境pH

蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性是影響其水解作用的重要因子之一,作為一種蛋白質(zhì),其穩(wěn)定性和活性與昆蟲消化道內(nèi)環(huán)境pH密切相關(guān),有時僅在特定的pH條件下才具有活性。如Oppert在研究馬鈴薯羧肽酶抑制劑(carboxypeptidase inhibitor,CPI)對谷蠹Rhizoperthadominica蛋白酶的作用時發(fā)現(xiàn),在酸性條件下,CPI對谷蠹失去殺蟲活性[51]。一些昆蟲的蛋白酶在特定的pH條件下才具有較好的活性,如雙翅目昆蟲的天冬氨酸蛋白酶適合較低的pH,鱗翅目昆蟲的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶適合高于10.5的pH,鞘翅目昆蟲的半胱氨酸蛋白酶適合稍微偏酸的pH等[52]。昆蟲可以根據(jù)消化道內(nèi)變化的pH條件轉(zhuǎn)換蛋白酶種類,借此應(yīng)對植物蛋白酶抑制劑的負(fù)面作用[53]。

2.1.2分泌蛋白酶

2.1.2.1分泌敏感蛋白酶

首先,在基因轉(zhuǎn)錄過程中,昆蟲可通過提高敏感蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄水平,提高敏感蛋白酶的表達量。其次,昆蟲也可通過翻譯后的修飾調(diào)節(jié),分泌大量敏感蛋白酶。如四紋豆象消化道內(nèi)存在半胱氨酸蛋白酶基因的兩個亞型,分別是CmCPAs 和 CmCPBs;在蛋白酶抑制劑的誘導(dǎo)作用下,CmCPA1經(jīng)自動切除前導(dǎo)肽,表達提升2.5倍,而CmCPB1經(jīng)翻譯后修飾,表達提升116倍[53]。因此,當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┐嬖跁r,昆蟲可通過調(diào)控敏感蛋白酶的基因表達,分泌大量敏感蛋白酶,借此適應(yīng)蛋白酶抑制劑。

2.1.2.2分泌不敏感蛋白酶

分泌不敏感蛋白酶也是昆蟲適應(yīng)植物蛋白酶抑制劑的重要機制,如甘藍銀紋夜蛾Trichoplusiani能通過提高不敏感蛋白酶活性,適應(yīng)大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑[54]。一方面,當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┐嬖跁r,昆蟲消化道內(nèi)敏感蛋白酶可向不敏感蛋白酶轉(zhuǎn)化。如大豆半胱氨酸蛋白酶抑制劑N(soyacystatin N,scN)能誘導(dǎo)四紋豆象消化道內(nèi)蛋白酶由半胱氨酸蛋白酶為主向天冬氨酸蛋白酶為主轉(zhuǎn)變[53]。另一方面,蛋白酶抑制劑可直接誘導(dǎo)不敏感蛋白酶基因表達。如馬鈴薯甲蟲能通過基因表達的顯著提升和不敏感蛋白酶的大量分泌來應(yīng)對食物中的大豆半胱氨酸蛋白酶抑制劑[55]。

2.1.2.3分泌水解蛋白酶

大量研究表明,昆蟲調(diào)節(jié)蛋白酶敏感性以適應(yīng)植物蛋白酶抑制劑。但昆蟲體內(nèi)存在一類蛋白酶,能夠水解植物蛋白酶抑制劑。例如,昆蟲天冬氨酸蛋白酶可以降解植物蛋白酶抑制劑[53]。昆蟲絲氨酸蛋白酶和亮氨酸氨肽酶結(jié)合蛋白可以降解植物蛋白酶抑制劑[56]。黑葡萄耳象Otiorynchussulcatus體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種新型蛋白酶,可以水解水稻蛋白酶抑制劑[57]，類似的情況在四紋豆象中也有發(fā)現(xiàn)[55]。昆蟲可將植物蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)換為有利蛋白,提供營養(yǎng)物質(zhì)。

2.1.3改變蛋白酶構(gòu)象

昆蟲可以改變蛋白酶構(gòu)象,降低或阻斷蛋白酶抑制劑的結(jié)合,來應(yīng)對植物蛋白酶抑制劑。一方面,蛋白酶通過改變蛋白酶構(gòu)象,形成多聚體,減少與蛋白酶抑制劑的接觸面積[58]。另一方面,蛋白酶活性位點的構(gòu)象也可以改變。如在蛋白酶抑制劑scN的作用下,四紋豆象消化道內(nèi)敏感蛋白酶活性位點周圍的構(gòu)象會發(fā)生改變,從而改變相關(guān)蛋白酶對scN的敏感性[53]。

2.2 昆蟲適應(yīng)性相關(guān)研究的不足之處和展望

為了滿足營養(yǎng)需求,植食性昆蟲能通過調(diào)整消化道結(jié)構(gòu)、酶分泌和消化過程來適應(yīng)寄主蛋白酶抑制劑。由于植物養(yǎng)分組成的原因,氮成為許多植食性昆蟲營養(yǎng)攝取的限制因素,蛋白酶的消化和代謝是氮營養(yǎng)攝入的關(guān)鍵一環(huán),因為昆蟲攝入的蛋白質(zhì)都是大分子形式,這些大分子在被利用之前須先被蛋白酶水解變成小分子。由于植食性昆蟲消化蛋白酶的多樣性,昆蟲能通過分泌大量敏感蛋白酶、不敏感蛋白酶和水解蛋白酶等快速適應(yīng)寄主植物PIs,從而補償生長所需要的養(yǎng)分不足。相關(guān)研究都集中在害蟲取食PIs后不同蛋白酶的分泌量的變化,很少涉及一些重要問題,如昆蟲如何識別食物中的PIs?昆蟲防御PIs涉及的關(guān)鍵基因有哪些？相關(guān)機制是什么？昆蟲防御PIs所涉及的調(diào)控元件是什么？最近的研究表明,蛋白酶抑制劑N端和C端的延伸肽在植物防御反應(yīng)中能發(fā)揮重要作用[49],這提供了一個新的領(lǐng)域和研究方向,可借此探索昆蟲蛋白酶分泌的調(diào)控機制。上述這些問題的深入研究將有助于發(fā)展延緩昆蟲適應(yīng)PIs的手段,促進基于植物PIs的害蟲綠色防治。

3 植物蛋白酶抑制劑在蚜蟲防治中的應(yīng)用潛力

蚜蟲是世界上重要的農(nóng)業(yè)害蟲,由于其生活史短,孤雌生殖等特點,能夠在短時間內(nèi)大量繁殖。蚜蟲刺吸植物韌皮部汁液,需要將多余的糖分以蜜露的形式排出體外,覆蓋在植物葉片表面,容易導(dǎo)致‘煤煙病’。蚜蟲也是植物病毒的媒介昆蟲,傳播200多種病毒,對農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害[59-60]。長期以來,蚜蟲的防治主要依靠使用化學(xué)農(nóng)藥,但蚜蟲可快速進化為抗性種群,農(nóng)藥的大量和頻繁使用,會嚴(yán)重污染環(huán)境和損害人體健康,急需開發(fā)新型生物殺蚜劑[61]。

蛋白酶抑制劑是普遍存在于植物體內(nèi)的防御蛋白,能夠不可逆結(jié)合昆蟲消化蛋白酶。寄主蛋白酶抑制劑通過抑制昆蟲的消化作用,導(dǎo)致蟲體內(nèi)游離氨基酸短缺,從而對其生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響;即使隨后補充游離氨基酸后,也不能使昆蟲恢復(fù)正常的生長發(fā)育[49]。因此,蛋白酶抑制劑除抑制昆蟲消化作用外,還可能參與其他生理過程。蚜蟲是一種刺吸式口器昆蟲,通過內(nèi)共生菌獲取游離氨基酸,不依賴于消化蛋白酶,但蛋白酶抑制劑對蚜蟲生長發(fā)育也具有消極影響。用含大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Hordeumvulgarecysteine protease inhibitor 6,HvCPI-6) 的人工飼料飼喂豌豆蚜Acyrthosiphonpisum,可有效抑制其消化蛋白酶活性,延長其若蟲發(fā)育歷期[62]。轉(zhuǎn)基因試驗結(jié)果顯示,水稻絲氨酸蛋白酶抑制劑CI2c基因的過表達能抑制禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi的繁殖[25]。絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑均能夠減輕蚜蟲體重,延長若蚜發(fā)育歷期,減少害蚜種群密度[25,36]。而且,植物蛋白酶抑制劑會通過影響蚜蟲的初級共生菌Buchneraaphidicola來抑制宿主繁殖力[5]。因此,蛋白酶抑制劑在蚜蟲防治中具有較為獨特的優(yōu)勢和較好的潛力。

3.1 植物蛋白酶抑制劑的抗蚜性

蛋白酶抑制劑這類植物小分子防御蛋白,能夠通過作用于蚜蟲消化蛋白酶來擾亂蚜蟲生長發(fā)育,如大豆絲氨酸蛋白酶抑制劑(soybean bowman-birk inhibitor,SbBBI)能影響馬鈴薯長管蚜Macrosiphumeuphorbiae的生活史參數(shù)[36]。再如桃蚜取食半胱氨酸蛋白酶抑制劑HvCPI-6后,體重減輕,若蟲發(fā)育歷期延長[62]。但水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑能增強桃蚜總蛋白酶活性,原因在于桃蚜需要分泌大量不敏感消化蛋白酶,來維持正常生理代謝。可見,蚜蟲需要在消化上消耗額外的大量能量來抵御食物中的蛋白酶抑制劑,從而影響其生長發(fā)育。

植物蛋白酶抑制劑還能通過影響蚜蟲的免疫系統(tǒng)影響蚜蟲的生長發(fā)育。如水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑能降低豌豆蚜組織蛋白酶B和L活性;再如大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑HvCPI-6能與豌豆蚜組織蛋白酶相契合,抑制其組織蛋白酶活性[62]。因此,植物蛋白酶抑制劑會導(dǎo)致蚜蟲對病原微生物的免疫能力下降,從而降低蚜蟲對不良環(huán)境的適應(yīng)能力。

植物蛋白酶抑制劑也會影響蚜蟲的初級共生菌B.aphidicola。免疫熒光組織化學(xué)試驗表明,植物蛋白酶抑制劑被蚜蟲攝入體內(nèi),緊貼中腸上皮細(xì)胞,除在腸腔內(nèi)有聚集外也能夠到達血淋巴的含菌細(xì)胞[5]。蛋白酶抑制劑在含菌細(xì)胞內(nèi),抑制內(nèi)共生菌B.aphidicola的正常代謝。內(nèi)共生菌B.aphidicola對蚜蟲至關(guān)重要,其受到負(fù)面影響會導(dǎo)致蚜蟲自身的存活和繁殖受到嚴(yán)重影響。如水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑OC-Ⅰ和大麥蛋白酶抑制劑HvCPI-6都能降低桃蚜和豌豆蚜的繁殖力[62];水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑OCI也能降低馬鈴薯長管蚜種群的繁殖和增長[63]。

3.2 蛋白酶抑制劑對蚜蟲等刺吸式口器害蟲作用的獨特性和應(yīng)用潛力

刺吸式口器昆蟲如蚜蟲等取食的汁液中小分子自由氨基酸的含量遠(yuǎn)高于大分子蛋白的含量,因此蚜蟲等刺吸式口器害蟲無需對所攝入的大分子蛋白進行分解和代謝。但是,研究表明,植物PIs對蚜蟲的食物代謝活動仍具有明顯的負(fù)面作用,這種作用涉及的生理生化機制目前仍不清楚,但比較獨特,完全不同于前文描述的鱗翅目幼蟲、鞘翅目等咀嚼式口器昆蟲涉及腸道消化蛋白酶的生理生化機制。如上所述,蛋白酶抑制劑雖然能在一定程度上抑制蚜蟲消化作用,但也會影響其免疫系統(tǒng)以及與內(nèi)共生菌相互作用等,哪種作用方式在其抗蚜性中占主導(dǎo)地位目前并不清楚,相關(guān)機制也不明確。鑒于植物PIs對蚜蟲等刺吸式口器害蟲作用的獨特性,如深入研究并開發(fā)出專門針對這類害蟲的綠色防治手段,將具有很好的應(yīng)用前景。

3.3 篩選高效蛋白酶抑制劑

在植物-昆蟲進化過程中,昆蟲能形成多種適應(yīng)機制,如過表達敏感蛋白酶或不敏感蛋白酶等來降低蛋白酶抑制劑的危害。因此,需要通過篩選高效、特異性蛋白酶抑制劑來提高害蟲防治效果。如有研究通過抽提并純化四棱豆Psophocarpustetragonolobus種子內(nèi)蛋白酶抑制劑(winged bean trypsin inhibitors,WBTIs),來比較其對棉鈴蟲胰蛋白酶的抑制效率,成功篩選了WBTI-1,WBTI-2和WBTI-3等3種高抑制力蛋白酶抑制劑[64]。研究人員在研究非植物源蛋白酶抑制劑的抗蚜性時,發(fā)現(xiàn)伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovienii蛋白酶抑制劑Xbpi-1對豌豆蚜的生長和存活有不利影響[61,65]:氨基肽酶對蚜蟲的食物消化和生化活性起著重要的作用,當(dāng)蚜蟲攝入Xbpi-1后,豌豆蚜氨肽酶活性降低18.30%;總糖、糖原和脂質(zhì)含量分別降低39.41%、24.61%和26.25%;游離氨基酸含量降低20.78%;碳水化合物、游離氨基酸和脂類等必需營養(yǎng)物質(zhì)的降低不利于豌豆蚜的生長發(fā)育。因此,可通過拓寬蛋白酶抑制劑種類,增加篩選到高效蛋白酶抑制劑的機會。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,篩選特異性蛋白酶抑制劑最高效的方法并不是對多種多樣的植物蛋白酶抑制劑都進行耗時費力的試驗測試,現(xiàn)在可基于分子動力學(xué)的模擬來篩選高效的植物蛋白酶抑制劑。例如,有研究利用液相色譜法(liquid chromatography,LC)與串聯(lián)質(zhì)譜分析(tandem mass spectrometry,MS/MS)相結(jié)合來高效鑒定寄主或非寄主植物蛋白酶抑制劑,再通過光譜計數(shù)分析計算各蛋白酶抑制劑與馬鈴薯甲蟲蛋白酶的結(jié)合能力,從而篩選與該蟲特異性結(jié)合的蛋白酶抑制劑[66]。再如有研究首先用軟件預(yù)測蛋白酶抑制劑(Anticarsiagemmatalistrypsin inhibitor,ApTI)、大豆夜蛾胰蛋白酶等的3D結(jié)構(gòu),然后通過同源建模、能量最小化分析等選擇最優(yōu)模板,確定目標(biāo)蛋白酶抑制劑的三維結(jié)構(gòu);再將各種蛋白酶抑制劑與上述胰蛋白酶進行分子對接分析,根據(jù)幾何結(jié)構(gòu)和能量評估,確定匹配效果;最后采用分子動力學(xué)方法對各種蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶的復(fù)合模型進行動態(tài)模擬,判斷配合物的穩(wěn)定性,通過最優(yōu)結(jié)合模型篩選高效蛋白酶抑制劑[33]。

另外,還可以根據(jù)蛋白酶抑制劑基因具有高變異性和特異性特點,利用定點突變技術(shù),發(fā)展高效新型蛋白酶抑制劑。例如,芥菜胰蛋白酶抑制劑(mustard trypsin inhibitor 2,MTI-2)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,能顯著降低甜菜夜蛾幼蟲的蛋白酶活性,但桃蚜對其不敏感;分析MTI-2與蛋白酶結(jié)合位點發(fā)現(xiàn),該位點是由位于Arg-20和Ile-21之間的P1和周圍殘基介導(dǎo)的,選取氨基酸Ala-18到phe22 DNA編碼區(qū),用NNK密碼子(N:A,C,G,T;k:G,T)取代該區(qū)域15個核苷酸;NNK密碼子的隨機化結(jié)果可產(chǎn)生大約3 400萬個DNA序列,編碼205萬～320萬個多肽;利用分子計算和定點突變技術(shù)成功篩選到10個MTI-2突變體,并利用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)驗證了突變體與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結(jié)合能力;最后利用人工飼料飼喂試驗驗證了突變體對害蟲的作用[67-69]。

3.4 新技術(shù)、新策略

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是異源雙鏈RNA阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致靶標(biāo)基因沉默或表達量明顯下調(diào)的現(xiàn)象。昆蟲中存在兩種RNA干擾方式,包括細(xì)胞自主RNAi和非細(xì)胞自主RNAi。線蟲體內(nèi)非細(xì)胞自主RNAi信號傳遞的關(guān)鍵基因是SID-1,而棉蚜Aphisgossypii和麥長管蚜Sitobionmiscanthi中存在SID-1同源基因[66-67],這可能有利于非細(xì)胞自主RNAi在蚜蟲中的發(fā)生。另一方面,蚜蟲的中腸上皮細(xì)胞存在大量微絨毛,有利于吸附外源siRNA。因此,RNA干擾這種新技術(shù)在蚜蟲上也具有較好的應(yīng)用潛力,而且該技術(shù)可與植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及新型植物蛋白酶抑制劑結(jié)合起來使用。有研究將桃蚜絲氨酸蛋白酶(Myzuspersicaeserine protease,MySP)dsRNA基因轉(zhuǎn)入擬南芥,轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)會產(chǎn)生大量小干擾核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,siRNAs),這些siRNAs被蚜蟲攝入后能抑制其絲氨酸蛋白酶基因表達,顯著降低了其蛋白酶活性[71]。因此,蚜蟲蛋白酶的RNAi干擾其蛋白酶基因表達,而植物蛋白酶抑制劑也可直接抑制其蛋白酶的水解活性,兩者結(jié)合起來使用,能提高對蚜蟲生長發(fā)育的抑制效果。

另外,雖然并不是所有外來雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)均能夠被植物吸收,且dsRNA容易在植物表面被降解,但噴灑人工合成dsRNA于植物表面防治害蟲也具一定效果,特別是在使用時結(jié)合納米新技術(shù)的情況下會有更好的效果。納米顆粒是一種有效的轉(zhuǎn)運載體,不僅運輸外源物質(zhì)到植物體內(nèi),而且提高了外源物質(zhì)的穩(wěn)定性[72]。如大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor,STI)與介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles,MSNs)結(jié)合,噴灑于植物表面,提高了植物細(xì)胞攝取STI的速率。大豆胰蛋白酶抑制劑STI與二氧化硅納米粒子(silica nanoparticles,SiNPs)相偶聯(lián),提高了STI穩(wěn)定性和底物結(jié)合力,對胰蛋白酶的抑制效率高達80%[71]。該研究還發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲Helicoverpaarmigera幼蟲更傾向于選擇游離STI處理過的葉片,而避開Si20APT-STI處理過的葉片,說明Si20APT-STI對害蟲產(chǎn)生了驅(qū)避作用。因此,新型植物蛋白酶抑制劑與RNA干擾技術(shù)、納米技術(shù)相結(jié)合,在害蟲包括蚜蟲的防治中具有極大的應(yīng)用潛力。

4 展望

蛋白酶抑制劑是天然的小分子蛋白,廣泛存在于植物組織內(nèi),具有防御各種植食性昆蟲的功能,但目前防治效果有限,昆蟲也逐漸形成了一系列的適應(yīng)機制,而且PIs作用的廣譜性會帶來生物安全問題(如對天敵瓢蟲的負(fù)面影響等)[73]。相關(guān)研究雖然很多,但一些基本問題仍需要更深入系統(tǒng)的研究,如昆蟲識別食物中PIs的方式和策略、昆蟲防御PIs涉及的關(guān)鍵基因和相關(guān)機制、昆蟲防御PIs所涉及的調(diào)控元件、以及PIs對天敵昆蟲的負(fù)面影響和生物安全等。上述這些問題的深入研究將有助于發(fā)展延緩昆蟲適應(yīng)PIs的手段,促進基于植物PIs的害蟲綠色防治。將來為提高其防效可從如下幾方面著手:1)利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)篩選更高效的PIs,或與RANi和基因編輯技術(shù)相結(jié)合提高其防效;2)通過基因疊加,在轉(zhuǎn)基因作物中植入多個PI基因,或利用質(zhì)粒工程技術(shù)大幅提高轉(zhuǎn)基因作物的PI表達量;3)延緩害蟲適應(yīng)性的發(fā)展速度。植物PIs對蚜蟲等刺吸式害蟲也具有明顯的負(fù)面作用,這種作用涉及的獨特生理生化機制目前仍不清楚,這方面的深入研究可能開發(fā)出專門針對蚜蟲等刺吸式害蟲的綠色防治手段。隨著分子生物學(xué)和組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,快速篩選新型、高效蛋白酶抑制劑已成為可能,這些新型、高效PIs與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、納米技術(shù)、RNA干擾等新技術(shù)的結(jié)合使用,將在包括蚜蟲等刺吸式害蟲在內(nèi)的各種害蟲的綠色防控中具有重要價值和廣泛應(yīng)用前景。