劉朋飛,王 巖,王泓力,吳曰福,陳小飛,樓兵干*

(1.浙江大學生物技術研究所,農業(yè)農村部作物病蟲分子生物學重點實驗室,杭州 310058;2.新疆林業(yè)科學院現(xiàn)代林業(yè)研究所,烏魯木齊 830002;3.塔里木大學農學院,阿拉爾 843300)

由解淀粉歐文氏菌Erwiniaamylovora引起的梨火疫病是梨、蘋果等薔薇科仁果類植物上的一種毀滅性細菌病害,是重要的國際植物檢疫性病害[1]。病原菌通常從幼嫩組織的自然孔口侵染,侵染初期花、嫩梢和幼果有水漬狀病斑,氣候濕潤時有菌膿滲出,后變黑枯萎,如果不及時在病健交界以下30～50 cm剪除病枝,采取有效藥劑進行防治,病原菌會繼續(xù)沿枝條上下擴展,當年即可導致大枝枯死或整株死亡。

梨火疫病自18世紀80年代在美國紐約州首次發(fā)現(xiàn)至今,已傳播至全球50多個國家和地區(qū)[2],近年來,我國新疆和甘肅也有梨火疫病發(fā)生[3],嚴重威脅著我國梨、蘋果產業(yè)的發(fā)展。梨火疫病防控措施除了加強檢驗檢疫,嚴禁從病區(qū)調運苗木與接穗外,對老病區(qū)和常發(fā)區(qū),國內外采取的主要防控措施是化學藥劑防控。國際上使用的化學藥劑主要有兩大類:抗生素類如硫酸鏈霉素、土霉素、春雷霉素等,銅制劑類如堿式硫酸銅、氫氧化銅、王銅等[4]。鏈霉素兼具預防和治療效果,防治效果穩(wěn)定,在推薦使用濃度下對花、果和葉片安全,是梨火疫病防治的主要藥劑,但抗性菌株的出現(xiàn)和出于對人類健康安全考慮,一些國家禁止和限制鏈霉素的大田使用[4-8],我國于2018年6月農用硫酸鏈霉素已全面禁用[9]。銅制劑尤其是無機銅在有效防控濃度下對花、葉和果實易產生藥害,在使用上受到一定限制。雖然還沒有梨火疫病菌對銅制劑產生抗性的報道,但已有其他多種植物病原細菌對銅制劑抗性的報道,不能排除梨火疫病菌對銅制劑出現(xiàn)抗藥性的可能性[7]。Georg等對29種藥劑進行了梨火疫病防效測定,結果沒有篩選出比鏈霉素更有效的藥劑[10]。篩選新的有效藥劑,創(chuàng)制新的復配藥劑,提高防控效果,降低抗藥性風險是梨火疫病防控的當務之急。本研究對目前廣泛應用于植物細菌性病害防治的6種殺菌劑及其復配藥劑進行梨火疫病菌室內毒力測定和在盆栽杜梨苗上進行防效試驗,以期篩選出新的防治梨火疫病的有效藥劑單劑和復配劑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

梨火疫病菌XJSZ0102,由浙江大學生物技術研究所分離,經系統(tǒng)鑒定并保存于-70℃冰箱中。

1.2 供試藥劑

供試殺菌劑包括6種原藥和6種制劑。6種原藥分別為:76.1%春雷霉素(日本北興化學工業(yè)株式會社)、95%噻唑鋅(浙江新農化工股份有限公司)、97%喹啉銅[興農藥業(yè)(中國)有限公司]、12%中生菌素(福建凱立生物制品有限公司)、98%丙硫唑(貴州道元生物技術有限公司)、50%芬母肽(江蘇嘉泰生物技術有限公司);6種制劑分別為:40%春雷·噻唑鋅懸浮劑、20%噻唑鋅懸浮劑，浙江新農化工股份有限公司；45%春雷·喹啉銅懸浮劑、33.5%喹啉銅懸浮劑，興農藥業(yè)(中國)有限公司；2%春雷霉素水劑，江門市植保有限公司；10%丙硫唑懸浮劑，貴州道元生物技術有限公司。

1.3 供試杜梨苗

2018年秋移栽健康無病蟲為害的一年生杜梨苗到苗盆(盆高20 cm,內徑16 cm)中,置于新疆庫爾勒市農業(yè)農村局育苗中心3號大棚內,生長季7～14 d澆1次透水,一個月施1次復合肥,2020年冬季平茬,2021年4月份新生枝條長至15 cm左右供試驗用。

1.4 試驗方法

1.4.1接種菌液的制備

從活化的平板上挑取梨火疫病菌單菌落到50 mL 營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基中,28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。使用紫外可見光分光光度計測定菌懸液600 nm波長(OD600)吸光度,使用NB培養(yǎng)基稀釋菌懸液至1×109cfu/mL (OD600為0.4±0.01)。

1.4.2殺菌劑原藥溶解方法

95%噻唑鋅原藥先用適量二甲亞砜溶解,再用0.1%吐溫-80稀釋;98%丙硫唑原藥先用適量冰醋酸溶解,再用0.1%吐溫-80稀釋;97%喹啉銅原藥先用適量三氯甲烷溶解,再用0.1%吐溫-80稀釋;76.1%春雷霉素原藥、12%中生菌素原藥和50%芬母肽原藥用無菌水溶解,使用0.22 μm無菌過濾器過濾后再用無菌水稀釋。所有用于溶解原藥的有機溶劑在培養(yǎng)基中的使用濃度都低于0.1%,在預試驗中對梨火疫病菌生長的影響在統(tǒng)計誤差范圍內可忽略不計。

1.4.3殺菌劑原藥對梨火疫病菌的毒力測定

采用比濁法室內測定6種殺菌劑對梨火疫病菌的毒力[11]。根據預試驗,將6種殺菌劑原藥稀釋后加入到50 mL NB培養(yǎng)基中配成5個供試濃度(表1)。每個濃度設3個重復,每個重復1瓶,吸100 μL稀釋100倍的接種菌液于含藥培養(yǎng)基中,以相同濃度的含藥培養(yǎng)基中加入等量無菌水代替菌懸液為組內空白對照。陽性對照以等量無菌水代替藥劑,陰性對照以等量無菌水代替藥劑和菌懸液。在28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后測定培養(yǎng)液OD600增加值(ΔOD600,用組內空白對照調零后測定本組含藥培養(yǎng)液的OD600)。

1.4.4混配藥劑聯(lián)合毒力測定

基于6種殺菌劑對梨火疫病菌的毒力結合每種殺菌機理,形成7個類別35種混配方案,采用比濁法進行聯(lián)合毒力測定[12]。每種配比設5個供試濃度(表2),每個濃度設3個重復,每個重復1瓶,吸100 μL稀釋100倍的接種菌液于含藥培養(yǎng)基中,以相同濃度的含藥培養(yǎng)基中加入等量無菌水代替菌懸液為組內空白對照。陽性對照以等量無菌水代替藥劑,陰性對照以等量無菌水代替藥劑和菌懸液。在28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后測定培養(yǎng)液的ΔOD600,計算各混劑對梨火疫病菌的生長抑制率。

1.4.5在大棚盆栽杜梨苗上測定7種殺菌劑的防效

試驗分兩組,一組為預防試驗,一組為治療試驗,每組設9個處理,包括7個藥劑處理、1個接菌對照和1個空白對照。每個處理3個重復,每個重復10盆杜梨苗,為當年生枝條,在試驗前5 d,修剪掉過長或過短的枝條,留下長勢均勻一致長約15 cm的枝條。預防組先噴藥,48 h后噴菌并覆膜保濕48 h;治療組先噴菌并覆膜保濕48 h再噴藥。根據供試藥劑毒力測定結果結合生產廠家推薦使用倍數確定供試濃度(表3),每個處理用藥量約1 L,噴至枝葉上藥液懸而未滴;接菌采用噴霧方式,接菌濃度為1×109cfu/mL,接菌量約10 mL/盆。以只接菌不做藥劑處理的為接菌對照,以既不接菌也不做藥劑處理的為空白對照。

根據浙江大學生物技術研究所樓兵干教授制定的梨火疫病溫室盆栽杜梨苗病情分級標準對接菌后14 d的盆栽苗進行調查,統(tǒng)計各病級發(fā)病枝條數。梨火疫病溫室盆栽杜梨苗病級分級標準:0級,無病斑;1級,病斑長度占總枝條長度1/3及以下;3級,病斑長度占總枝條長度1/3以上,不超過2/3;5級,病斑長度占總枝條長度2/3以上。

1.4.6數據處理

根據公式(1)計算殺菌劑在室內對梨火疫病菌的生長抑制率。把殺菌劑濃度換算成對數值作為自變量x,把生長抑制率換算成抑制率幾率值作為因變量y,使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行回歸分析,比較殺菌劑之間對梨火疫病菌的毒力差異。

生長抑制率=

(1)

根據公式(2)～(4)計算混劑的共毒系數(CTC)[12],根據CTC來評價藥劑混配的增效作用,即CTC≥120時該復配劑表現(xiàn)增效,CTC≤80表現(xiàn)為拮抗,80

(2)

混劑理論毒力指數=TIA×PA+TIB×PB

(3)

式中TIA為A藥劑的毒力指數,PA為A藥劑在混劑中的百分含量,TIB為B藥劑的毒力指數,PB為B藥劑在混劑中的百分含量。

(4)

根據公式(5)(6)計算盆栽杜梨苗病情指數和殺菌劑在盆栽苗上對梨火疫病的防治效果。應用SPSS統(tǒng)計分析軟件完成數據分析。

病情指數=

(5)

防治效果=

(6)

2 結果與分析

2.1 6種殺菌劑室內毒力測定結果

室內毒力測定結果(表1)表明:6種殺菌劑對梨火疫病菌都有生物活性。丙硫唑、芬母肽和中生菌素的EC50均低于1 mg/L,表現(xiàn)出很強的毒力;春雷霉素和噻唑鋅的EC50大于1 mg/L小于50 mg/L,表現(xiàn)出較強的毒力;喹啉銅的EC50大于100 mg/L,毒力最弱。毒力方程的斜率反映了藥劑對病原菌的急性毒作用帶,斜率越大急性毒作用帶越小,表示藥效越好[13]。供試6種殺菌劑中梨火疫病菌急性毒作用帶最小的藥劑是芬母肽,其次是丙硫唑,中生菌素急性毒作用帶最大。

表1 6種殺菌劑對梨火疫病菌的室內毒力測定Table 1 The toxicity of six single fungicides to Erwinia amylovora

2.2 混劑聯(lián)合毒力測定結果

聯(lián)合毒力測定結果(表2)表明:在供試的7類混劑中,春雷霉素和喹啉銅復配的5種混劑共毒系數均大于120,表現(xiàn)出增效作用;芬母肽和中生菌素復配的5種混劑共毒系數均小于80,表現(xiàn)出拮抗作用。在組成的35種混劑中,3個類別的9種混劑具有增效作用,其中增效最顯著的混劑是春雷霉素∶喹啉銅=1∶9,CTC值為184,春雷霉素∶噻唑鋅=1∶7的增效作用最弱,CTC值為120;8種混劑具有拮抗作用;18種混劑具有相加作用。

2.3 盆栽杜梨苗上防效測定結果

在具有增效作用的3類混劑中分別選擇最優(yōu)配比的混劑:40%春雷·噻唑鋅懸浮劑(春雷霉素∶噻唑鋅=1∶7)、45%春雷·喹啉銅懸浮劑(春雷霉素∶喹啉銅=1∶9)和2.1%丙硫·春雷懸浮劑(丙硫唑∶春雷霉素=1∶11),以及4種組成混劑的單劑在盆栽杜梨苗上測定對梨火疫病的防治效果。結果表明:3種混劑的預防效果和治療效果均顯著好于單劑(表3)。效果最好的是40%春雷·噻唑鋅懸浮劑,預防效果和治療效果分別為84.58%和74.37%;效果最差的是33.5%喹啉銅懸浮劑,預防效果和治療效果分別為為40.88%和37.89%。

3 結論與討論

本研究測定了6種殺菌劑原藥對梨火疫病菌的毒力,結果除喹啉銅的EC50大于100 mg/L,毒力較弱外,其他5種殺菌劑都有較高的生物活性,其中芬母肽、丙硫唑和中生菌素生物活性最高。噻唑鋅、中生菌素和芬母肽是我國近年來自主研發(fā)的創(chuàng)制藥劑。噻唑鋅對水稻白葉枯病、水稻細菌性條斑病等細菌性病害有很好的防治效果[14-15];室內毒力測定顯示,中生菌素對核桃細菌性黑斑病菌Xanthomonasarboricolapv.juglandis、獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringae有較好的生物活性,并且在田間對番茄潰瘍病表現(xiàn)出較好的防治效果[16-18];芬母肽屬于抗菌肽類殺菌劑,通過物理作用破壞細胞膜達到殺菌效果,對多種動植物病原細菌有很好的殺菌效果[19]。丙硫唑最早在臨床上用于治療蠕蟲感染引起的疾病,后研究發(fā)現(xiàn)對多種植物病原真菌有較好的生物活性,在細菌性病害上的研究較少[20]。喹啉銅是銅制劑類的后起之秀,比堿式硫酸銅、氫氧化銅等無機銅更安全,對大麥條紋病、馬鈴薯瘡痂病等多種病害有較好的防效[21-22]。上述5種藥劑多數為近20年國內農藥領域新的高效低毒藥劑,在國際上很少有用于防治梨火疫病的文獻報道。已有研究表明春雷霉素對梨火疫病菌的最低抑菌濃度為3.5～18.3 mg/L,EC95為6.9～46.7 mg/L[23],本研究結果與之一致。我們將春雷霉素和其他5種藥劑的EC50比較,結果證明了各藥劑對梨火疫病菌的有效性。

藥劑聯(lián)合毒力測定結果表明:所測試的7類35種混劑中只有3類9種藥劑有增效作用。藥劑混配通常有混劑和桶混兩種方式?；靹┦怯赊r藥生產廠家研發(fā)的含有兩種及以上有效成分的農藥制劑,桶混則是在田間施藥時將幾種單劑按比例配成混合藥液。好的藥劑混配不僅擴大了防治譜,降低了抗藥性風險,同時具有增效作用,降低用藥量,減少施藥次數[24]。不是所用的藥劑混配都具有增效作用,多數藥劑混配表現(xiàn)出藥效的相加,部分藥劑混配后甚至表現(xiàn)出拮抗作用,本研究中芬母肽與中生菌素混配后就出現(xiàn)藥劑間的拮抗作用。在田間施藥時不能隨意對不同藥劑進行混配,以免出現(xiàn)藥效降低的現(xiàn)象。藥劑混配的效果不僅與藥劑種類有關,也與混配比例相關,本研究中,春雷霉素和噻唑鋅混配只有在春雷霉素∶噻唑鋅=1∶7時有增效作用,其他比例都表現(xiàn)出相加作用,說明在混劑的研發(fā)過程中,混配比例至關重要,只有最佳的混配比例才能使混劑的藥效發(fā)揮得最好。

表3 7種殺菌劑在盆栽杜梨苗上對梨火疫病的防治效果1)Table 3 Effects of seven fungicides against pear fire blight disease on potted seedlings

藥劑Fungicide有效濃度/mg·L-1Effectiveconcentration預防試驗Preventivetrial病情指數Diseaseindex預防效果/%Protectiveeffect治療試驗Therapeutictrial病情指數Diseaseindex治療效果/%Treatmenteffect40%春雷·噻唑鋅SCkasugamycin·zincthiazole40%SC333(9.29±0.42)f84.58(15.01±0.67)g74.3745%春雷·喹啉銅SCkasugamycin·oxine-copper45%SC300(9.84±0.14)f83.66(17.09±0.18)f70.822.1%丙硫·春雷SCalbendazole·kasugamycin2.1%SC133(13.90±0.27)e76.92(20.48±0.15)e65.032%春雷霉素ASkasugamycin2%AS40(19.90±0.51)c66.96(24.30±0.46)c58.5033.5%喹啉銅SCoxine-copper33.5%SC419(35.61±0.66)b40.88(36.37±0.60)b37.8920%噻唑鋅SC zincthiazole20%SC500(19.69±0.49)c67.31(24.47±0.87)c58.2110%丙硫唑SC albendazole10%SC167(18.37±0.28)d69.50(22.87±0.93)d60.95接菌對照 Inoculationcontrol-(60.23±0.50)a-(58.56±1.77)a-空白對照 Blankcontrol-(0.00±0.00)g-(0.00±0.00)h-

大棚中盆栽杜梨苗上防治試驗結果表明:篩選和混配的藥劑對梨火疫病有一定防效且防效差異顯著,混劑的防治效果顯著好于單劑。藥劑的大田防治效果不僅與殺菌劑有效成分的生物活性有關,還與藥劑劑型加工有關[25]。為便于生產中應用,本研究所使用的單劑和混劑盡量選用市面上已有的商業(yè)化產品進行試驗。40%春雷·噻唑鋅懸浮劑是2015年國內新上市的產品,對水稻細菌性條斑病、水稻白葉枯病等都有較好的防治作用[26-27]。45%春雷·喹啉銅懸浮劑主要用于防治芒果、西瓜、黃瓜等作物的細菌性角斑病以及柑橘潰瘍病等。上述兩種藥劑之前并未有梨火疫病防治方面的相關報道。本研究通過室內毒力測定、盆栽防效測定,明確了兩種復配劑對梨火疫病的防治效果。丙硫唑和春雷霉素目前還沒有商品化復配劑,本研究所用的藥劑為使用現(xiàn)有單劑臨時混配,雖然混劑在盆栽試驗上表現(xiàn)出較好的防效,但作為制劑,還沒有經過最佳的助劑配比和生產工藝研發(fā),其防效有進一步提升的空間。