馬曉晴，黃綺雯 綜述 唐亮 審校

暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

鈦(titanium，Ti)具有良好的生物相容性和優(yōu)異的力學(xué)性能，是一種應(yīng)用廣泛的牙科植入材料。但鈦具有生物惰性，細(xì)菌容易黏附其表面并產(chǎn)生生物膜，增加種植術(shù)后并發(fā)癥和失敗率。另外，鈦不支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和成骨細(xì)胞的成骨且會(huì)降低成骨速度，導(dǎo)致骨結(jié)合不良[1]。近年來對(duì)鈦種植體表面的改性已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)純鈦進(jìn)行表面改性主要有物理處理、化學(xué)涂層、生物涂層和二氧化鈦納米管(titanium dioxide nanotubes，TNTs)修飾等方法。

采用陽極氧化技術(shù)制備的TNTs具有低細(xì)胞毒性、良好的生物相容性、高功能表面、光催化活性、良好的抗崩解性以及可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。TNTs修飾的鈦種植體能增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期骨整合[3]，此外，TNTs是一種新型的可控藥物釋放系統(tǒng)，具有廣譜抗菌活性，因此TNTs在口腔種植領(lǐng)域具有廣闊的潛在應(yīng)用前景。本文將從頜骨骨免疫微環(huán)境、種植體周圍炎、藥物遞送等方面闡述TNTs在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。

1 頜骨免疫微環(huán)境

種植體植入后，免疫系統(tǒng)被激活以調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的局部微環(huán)境，具有良好骨免疫調(diào)節(jié)性能的骨再生生物材料可以通過調(diào)節(jié)成骨和破骨行為促進(jìn)骨免疫平衡。此外，合適的免疫微環(huán)境能夠促進(jìn)骨再生[4]。BAI等[5]報(bào)道直徑為15 nm的TNTs能顯著激活血小板，在下調(diào)炎癥相關(guān)基因的同時(shí)上調(diào)生長(zhǎng)代謝相關(guān)基因，促進(jìn)骨細(xì)胞樹突的伸展，為骨再生和骨整合提供良好的骨免疫調(diào)節(jié)環(huán)境。BELTRáN-PARTIDA等[6]認(rèn)為TNTs可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，支持更快的臨床骨整合過程。TNTs能負(fù)載多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，調(diào)控免疫反應(yīng)，從而創(chuàng)造良好的骨免疫微環(huán)境。

巨噬細(xì)胞是免疫反應(yīng)的先天調(diào)節(jié)因子，通過將其極化為促炎癥的M1型巨噬細(xì)胞或促愈合的M2型巨噬細(xì)胞，能產(chǎn)生過量的細(xì)胞因子[5]。種植體植入后，促炎的M1巨噬細(xì)胞被干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子激活，隨后抗炎的M2巨噬細(xì)胞被白細(xì)胞介素-4(IL-4)等細(xì)胞因子激活，可促進(jìn)植入物的愈合和長(zhǎng)期穩(wěn)定。GAO等[7]將免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-4負(fù)載到TNTs中，并在TNTs上進(jìn)行水凝膠涂層，最后將IFN-γ添加到凝膠層，實(shí)現(xiàn)快速釋放，該涂層可以在預(yù)期的時(shí)間內(nèi)刺激巨噬細(xì)胞從M1表型向M2表型的極化，促進(jìn)M1向M2巨噬細(xì)胞平滑轉(zhuǎn)換，有助于種植體的穩(wěn)定。HE等[8]將鄰苯二酚基序修飾的甲基丙烯酸酯明膠水凝膠附著在TNTs上，然后將過氧化鈣納米粒子及IL-4負(fù)載到水凝膠中制備雙重載藥系統(tǒng)，結(jié)果表明釋放過氧化氫的過氧化鈣納米粒子能快速清除金黃色葡萄球菌，且過氧化鈣納米粒子被包埋在水凝膠中后潛在的細(xì)胞毒性明顯降低，此外該系統(tǒng)能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2表型極化。LI等[9]用聚多巴胺(polydopamine，PDA)將IL-4固定在TNTs上，隨后在TNTs上制備羧甲基殼聚糖水凝膠涂層并結(jié)合核心肽序列，發(fā)現(xiàn)該涂層不僅可以驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞向抗炎的M2表型轉(zhuǎn)換并產(chǎn)生修復(fù)性細(xì)胞因子IL-10，還能增強(qiáng)激活與MSCs分化相關(guān)的信號(hào)通路BMP/SMAD/RUNX2。YIN等[10]在TNTs上制備海藻酸鹽/殼聚糖(chitosan，CH)多層膜，指出該涂層能誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞激活BMP6/SMADs和Wnt10b/β-catenin通路，且誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞激活TGF-β/SMADs通路以促進(jìn)MSC的早期和中期成骨。YANG等[11]利用貽貝激發(fā)的PDA將銀離子固定在TNTs上，認(rèn)為PDA能控制Ag+的過量釋放，降低銀納米顆粒的細(xì)胞毒性，并通過細(xì)胞反應(yīng)性釋放Ag+調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞從M1表型極化為M2表型的時(shí)間。CHEN等[12]采用電化學(xué)陽極氧化法制備載銀納米TNTs，指出控制釋放超低劑量Ag+的載銀TNTs通過抑制PI3K/Akt通路可減少下游效應(yīng)分子GLUT1的釋放，從而激活自噬效應(yīng)以控制炎癥。

種植體植入后，術(shù)后損傷的組織與其相互作用會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS通過氧化DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)破壞細(xì)胞并作為信號(hào)分子參與細(xì)胞生理調(diào)控，氧化還原的失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[13]。此外，大量的ROS會(huì)引起巨噬細(xì)胞的聚集和炎癥，長(zhǎng)期的炎癥會(huì)導(dǎo)致種植體無菌性松動(dòng)[14]。YANG等[15]將白藜蘆醇負(fù)載到TNTs上，指出該涂層能有效消除ROS，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，從而抑制炎癥反應(yīng)，維持骨穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)MSCs的成骨分化。GAO等[16]在鈦合金表面制備PDA和載銀納米TNTs涂層，發(fā)現(xiàn)該涂層能夠清除ROS，增強(qiáng)細(xì)胞黏附和刺激細(xì)胞分化。YANG等[17]指出高糖狀態(tài)下細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS會(huì)抑制細(xì)胞黏附和增殖，降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與純鈦噴砂表面相比，TNTs表面在糖尿病條件下產(chǎn)生的ROS較少，在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的生物相容性和成骨能力。此外，TNTs表面通過產(chǎn)生更多超氧化物歧化酶以平衡ROS的表達(dá)，避免ROS的過量產(chǎn)生，最終緩解高糖狀態(tài)下ROS對(duì)成骨的抑制。HUANG等[18]指出TNTs的抗氧化性由上調(diào)的叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子FoxO1驅(qū)動(dòng)，F(xiàn)oxO1在MSCs中通過shRNA廢除，因此TNTs能減輕巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌誘導(dǎo)M2表型的分化，進(jìn)一步提高骨免疫力。

2 種植體周圍炎

種植體周圍炎是一種發(fā)生在種植體周圍軟硬組織的炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為不同程度的骨組織喪失，伴有種植體周圍袋的形成、探診出血及溢膿[19]。引起種植體周圍炎的因素有：菌斑微生物、牙周炎、咬合過載、種植三維位置欠佳、角化齦不足、種植義齒設(shè)計(jì)不合理和修復(fù)部件松動(dòng)等[20-21]。持續(xù)的感染最終會(huì)導(dǎo)致骨結(jié)合喪失和種植失敗[22]。目前種植體周圍炎的治療方法分為非手術(shù)治療和手術(shù)治療，非手術(shù)治療主要包括機(jī)械清創(chuàng)術(shù)、藥物治療、激光治療和抗菌動(dòng)力治療等[23-24]。TNTs修飾的鈦種植體，主要通過改性、負(fù)載生物活性分子或抗菌劑以促進(jìn)種植體周軟組織封閉、實(shí)現(xiàn)抗菌活性等多種功能，預(yù)防和控制種植體周感染。

2.1 促進(jìn)種植體周軟組織封閉 種植體穿齦部分強(qiáng)有力的軟組織整合對(duì)種植體的長(zhǎng)期成功至關(guān)重要，種植體冠部封閉由牙槽骨上的結(jié)締組織和交界處上皮組成，結(jié)締組織是種植體冠部封閉的重要部分，可限制連接上皮的根尖遷移，保障有效的骨結(jié)合[25]。然而，由于口腔細(xì)菌生物膜的不良反應(yīng)，種植體的成功率可能會(huì)因?yàn)榭琊つぼ浗M織完整性的損害而受到影響[26]。人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGFs)作為種植體周圍軟組織的主要細(xì)胞，分泌含有豐富膠原纖維的細(xì)胞外基質(zhì)，能促進(jìn)牙齦創(chuàng)面的愈合、修復(fù)和再生[27]。XU等[28]在鈦表面制備直徑分別為30 nm、100 nm和200 nm的TNTs，發(fā)現(xiàn)直徑為30 nm和100 nm的TNTs均能增強(qiáng)HGFs的黏附、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，其中直徑100 nm的TNTs可以最大限度地激活HGFs功能，并降低牙齦假單胞菌在穿齦部的黏附，促進(jìn)軟組織附著，抑制細(xì)菌生物膜的黏附，保護(hù)牙槽骨。WANG等[29]采用陽極氧化和熱氫化技術(shù)制備超親水性TNTs，表明修飾后的表面可以大幅上調(diào)黏著斑激酶和磷酸化黏著斑蛋白激酶的表達(dá)，HGFs在氫化TNTs的黏附、遷移相對(duì)基因表達(dá)水平和細(xì)胞外基質(zhì)合成均增強(qiáng)，而且其誘導(dǎo)了黏著斑激酶活化和整合素介導(dǎo)的黏附，提示陽極氧化和氫化修飾的超親水納米結(jié)構(gòu)可以提高HGFs的生物活性并能促進(jìn)結(jié)締組織再生。

天然牙里牙齦纖維垂直插入牙骨質(zhì)中，以獲得良好的附著，而種植體周圍的結(jié)締組織纖維與牙根表面平行或成圓周排列，此結(jié)構(gòu)不利于種植體周圍的軟組織封閉及力的傳導(dǎo)。TNTs可以通過促進(jìn)垂直纖維的插入以增強(qiáng)種植體周圍的軟組織附著，使種植體周上皮保持在修復(fù)體和種植體之間的垂直水平[30]。HOU等[21]用聚合物滲透的無定型TNTs制作類牙周膜韌帶樣種植體周圍韌帶，結(jié)果顯示該結(jié)構(gòu)能增加18%以上的骨結(jié)合，并將種植體傳導(dǎo)至周圍骨組織的有效應(yīng)力降低30%，防止超負(fù)荷引起的骨吸收。CHEN等[31]應(yīng)用電泳融合(electrophoretic fusion，EPF)方法將Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)垂直融合成納米管陣列(TNTs-ColEPF)，指出具有垂直Col-Ⅰ表面的TNTs在刺激血小板介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞募集的同時(shí)錨定成纖維細(xì)胞來源的Col-Ⅰ形成垂直的膠原集合體，此外該涂層表面對(duì)促炎性腫瘤壞死因子-α的釋放有輕微的促進(jìn)作用，但對(duì)組織再生因子如PDGF-AB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的刺激作用顯著，說明TNTs-ColEPF表面通過建立牢固的軟組織密封，能夠減少種植體的并發(fā)癥。當(dāng)TNTs-ColEPF延伸到種植體上時(shí)，可以獲得堅(jiān)固而靈活的種植體牙周韌帶狀懸浮物，通過EPF附著在鈦表面的膠原蛋白可用于預(yù)防和作為跨黏膜種植體的抗炎治療。TNTs-ColEPF表面能抑制上皮細(xì)胞的初始黏附，其與膠原纖維的垂直黏附可防止上皮細(xì)胞向下生長(zhǎng)[32]。

2.2 抗菌性 IM等[33]用電噴霧沉積法在TNTs上沉積聚乳酸-乙醇酸共聚物，并在其上負(fù)載四環(huán)素納米顆粒以應(yīng)對(duì)種植體感染等問題，結(jié)果表明四環(huán)素納米顆粒包裹的TNTs具有抗金黃色葡萄球菌活性和前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的生物相容性，TNTs的成骨活性被保留。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽的殺菌機(jī)制更快且細(xì)菌極難產(chǎn)生抗藥性[34]。KAZEMZADEH-NARBAT等[35]在TNTs、磷酸鈣涂層和磷脂層的垂直三層結(jié)構(gòu)上浸漬一種高效的抗菌肽，發(fā)現(xiàn)該涂層對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抗菌活性且對(duì)成骨細(xì)胞MG63無細(xì)胞毒性。FENG等[36]將穿心蓮脂負(fù)載到TNTs中，結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯負(fù)載的TNTs能顯著地對(duì)抗葡萄球菌形成的外層生物膜以控制感染。

3 藥物遞送

種植術(shù)后感染常常會(huì)導(dǎo)致種植失敗，傳統(tǒng)的給藥方式存在許多缺點(diǎn)和局限性，如生物分布性差、治療效率低、副作用大、藥物溶解性差以及容易造成細(xì)菌耐藥性等，采用局部給藥方式能夠提高局部用藥部分的藥物濃度，有效地控制感染的發(fā)生[37]。TNTs作為新型載藥系統(tǒng)，其尺寸、幾何構(gòu)型及藥物釋放方式可以通過不同方法調(diào)控，且TNTs具有高比表面積和高載藥量等優(yōu)點(diǎn)，在藥物釋放方面具有廣闊的應(yīng)用前景[38]。目前主要使用物理吸附、電泳沉積和磁控濺射等多種技術(shù)將具有抗菌和成骨作用的元素或分子負(fù)載到TNTs中以促進(jìn)骨整合及控制感染，但TNTs的突釋行為會(huì)導(dǎo)致局部藥物濃度過高而引起細(xì)胞毒性，不利于周圍組織健康，可通過改變納米管的尺寸、表面修飾、聚合物包封及刺激響應(yīng)等方法延緩藥物的釋放[39]。目前關(guān)于納米管尺寸及表面修飾方法以控制藥物釋放的研究已有大量報(bào)道[40-42]，本文主要從聚合物包封和刺激響應(yīng)兩方面進(jìn)行闡述。

3.1 聚合物包封 RAHNAMAEE等[43]在TNTs上負(fù)載萬古霉素并將還原石墨烯(reduced graphene oxide，RGO)和CH組裝在TNTs上形成多功能涂層，研究純鈦組、TNTs組、TNTs/CH組、TNTs/RGO組及TNTs-RGO/CH組的藥物釋放行為，結(jié)果表明RGO對(duì)萬古霉素的釋放有輕微的抑制作用，培養(yǎng)20 d后TNTs組藥物完全釋放，而TNTs/CH組和TNTs-RGO/CH組的累積釋放率分別為87%和88%，TNTs/CH組和TNTs-RGO/CH組的藥物持續(xù)釋放至31 d。HASHEMI等[44]在TNTs上負(fù)載糖尿病藥物二甲雙胍，并在TNTs上旋涂CH以形成具有可持續(xù)藥物凝膠特性的表面，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，CH包覆的TNTs藥物釋放時(shí)間由3 d延長(zhǎng)至20 d，突釋行為由85%降低至7%，實(shí)現(xiàn)藥物可持續(xù)釋放。

3.2 載藥刺激性反應(yīng)釋放策略

3.2.1 pH響應(yīng)性釋放策略 細(xì)菌感染后的局部微環(huán)境為弱酸性(pH≤6.0)，低于正常組織(pH=7.4)，因此可利用細(xì)菌感染部位和正常組織之間的pH差作為觸發(fā)信號(hào)開放藥物輸送平臺(tái)[45]。YIN等[10]將TNTs制備成“潘多拉盒子”，然后將抗菌肽HHC36置入盒內(nèi)并用pH響應(yīng)的分子門聚甲基丙烯酸封閉，該分子門在生理?xiàng)l件下膨脹關(guān)閉延緩抗菌肽的釋放，但在細(xì)菌感染時(shí)(pH≤6.0)時(shí)分子門坍塌打開以釋放抗菌肽殺菌，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組50%和90%釋放時(shí)間分別增加了近20倍和7倍，即72 h和168 h。TAO等[46]將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2負(fù)載在TNTs上，用海藻酸雙醛慶大霉素和CH組成pH響應(yīng)的多層膜模擬生理環(huán)境(pH=7.4)和感染微環(huán)境(pH=5.8)進(jìn)行藥物釋放行為研究，結(jié)果表明當(dāng)pH=7.4時(shí)，僅有17.0μg慶大霉素從多層膜中釋放，而在pH=5.8的條件下，釋放的慶大霉素達(dá)38.1μg。關(guān)于藥物長(zhǎng)期分布方面，在pH=7.4和pH=5.8中培養(yǎng)10 d后，該多層膜中分別釋放出約44.0和130.3μg慶大霉素，以上結(jié)果均表明，該多層具有較好的pH響應(yīng)性。

3.2.2 酶響應(yīng)性釋放策略 透明質(zhì)酸具有高度親水性，有助于蛋白排斥及抗微生物定植。臨床病原菌尤其是金黃色葡萄球菌在感染階段會(huì)分泌高濃度的特異性酶，如透明質(zhì)酸酶(hyluronidase，HAase)和糜蛋白酶[47]。YU等[48]在負(fù)載去鐵胺的TNTs上構(gòu)建透明質(zhì)酸-慶大霉素偶聯(lián)物(hyaluronic acid-gentamicin conjugates，HA-Gen)及CH聚電解質(zhì)多層膜，指出HA-Gen對(duì)細(xì)菌具有抗黏附能力，可通過細(xì)菌定制期間分泌的HAase降解，釋放出慶大霉素片段殺滅細(xì)菌，且該涂層在無HAase的情況下，去鐵胺釋藥曲線穩(wěn)定適中，而在外源性HAase的作用下，底物在最初12 h內(nèi)出現(xiàn)突發(fā)性釋放，24 h內(nèi)幾乎完全釋放，說明該涂層可以實(shí)現(xiàn)去鐵胺的突發(fā)釋放和按需投放。YUAN等[49]以含有萬古霉素的TNTs為載體，在鈦基底上制備由多巴胺修飾的HA和3,4-二羥基肉桂酸修飾的CH組成的鄰苯二酚功能化多層膜，于三種濃度下(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL和0.5 mg/mL)觀察該涂層的藥物釋放行為，結(jié)果表明在沒有HAase的情況下，對(duì)照組釋放量達(dá)75%，而實(shí)驗(yàn)組釋放量不到10%，此外實(shí)驗(yàn)組的萬古霉素釋放度在12 h后減慢，在72 h后釋放峰值約達(dá)90%，說明該涂層具有快速酶響應(yīng)性，避免了正常組織中不必要的毒副作用。

4 總結(jié)

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TNTs在口腔種植領(lǐng)域應(yīng)用方面已經(jīng)做了大量的研究，通過改性方法對(duì)TNTs的復(fù)合處理越來越受到重視。TNTs具有良好的生物相容和局部藥物釋放能力，可以改善骨免疫條件、促進(jìn)成骨和改善軟組織封閉，適當(dāng)功能化的TNTs能夠解決骨結(jié)合不良、炎癥和感染等問題。生物活性涂層TNTs常與其他生物活性元素或殺菌劑結(jié)合在一起，以實(shí)現(xiàn)骨整合和抗菌活性等多種功能。但是，TNTs作為抗菌劑載體，仍存在藥物難以控制突釋行為及細(xì)菌耐藥性等問題，需要進(jìn)一步尋找抗菌活性和再生能力之間平衡的方法。