趙 鑫，馬桂敏，尹 娟，王正川，李赫龍，徐 強(qiáng)

(1. 深圳市廣匯源環(huán)境水務(wù)有限公司，廣東 深圳 518011；2. 廣東省城市水環(huán)境與水務(wù)信息化工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518011)

0 引 言

雙酚A(Bisphenol A，BPA)，即2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷，是一種具有內(nèi)分泌干擾性的類雌性激素，屬于難揮發(fā)、疏水性有機(jī)污染物[1]。BPA被廣泛應(yīng)用于制造聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等高分子材料，也可用于生產(chǎn)粘合劑、抗老化劑、粉末涂料等工業(yè)制品。由于應(yīng)用廣泛，BPA可通過多種途徑進(jìn)入水體，污染地表水和地下水。BPA對(duì)脊椎動(dòng)物具有激動(dòng)雌激素受體的作用，可誘導(dǎo)脊椎產(chǎn)生前凸反應(yīng)，引起假早熟[2]；對(duì)于兩棲類動(dòng)物，可引發(fā)性逆轉(zhuǎn)；對(duì)于哺乳動(dòng)物，則會(huì)導(dǎo)致子代變異效應(yīng)，如子代的畸形、死胎、體重下降、肝多核細(xì)胞增加及纖維性骨萎縮等現(xiàn)象。BPA進(jìn)入人體內(nèi)后會(huì)干擾體內(nèi)正常激素的分泌，從而影響生殖功能，導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生[3-4]。

漆酶可以用于降解水中BPA。漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有4個(gè)銅離子的多酚氧化酶，能催化多種芳香族化合物，如各種酚類染料、氯酚、硫酚、多氯聯(lián)酚、BPA、芳香胺、殺蟲劑等的降解，可與之作用的底物相當(dāng)廣泛[5]。與直接利用微生物的水處理技術(shù)相比，酶催化反應(yīng)本身具有分解效率高、毒性小、操作簡(jiǎn)便、使用范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。然而，由于漆酶本身易溶于水、不可重復(fù)使用、容易變性失活、價(jià)格偏高，使它在實(shí)際中的應(yīng)用受到了限制，而通過酶的固定化技術(shù)，則可以實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)連續(xù)使用。漆酶的固定化是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無機(jī)的載體上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物，使其仍具有催化活性，并可回收及重復(fù)使用的方法與技術(shù)[6-7]。與游離酶相比，固定化漆酶易從反應(yīng)體系中分離出來，可以重復(fù)使用，提高酶的化學(xué)穩(wěn)定性，能夠嚴(yán)格控制酶反應(yīng)過程，同時(shí)易從使用環(huán)境中分離，提高了酶的使用效率，降低其使用成本[8]。

本研究采用靜電紡絲纖維膜作為漆酶固定化的載體，利用包埋法固定化漆酶。借助靜電紡絲包埋漆酶，形成核-殼結(jié)構(gòu)載酶納米纖維，先在聚合物溶液中加入一定量的表面活性劑，再加入酶溶液混合形成均勻的乳液，然后將乳液引入靜電紡絲裝置中進(jìn)行電紡，從而得到載酶纖維膜[9]。本研究重點(diǎn)考察了載酶纖維膜的催化活性和穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)了其在降解模擬地表水中BPA的過程中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 紡絲液和游離漆酶溶液的制備

稱取1.8 g聚乳酸-乙醇酸共聚物(PDLGA)，0.2 g 嵌段聚醚F108和20 g二氯甲烷，經(jīng)磁力攪拌器震蕩2 h，至充分溶解即制成紡絲液。其中，加入與聚合物PDLGA質(zhì)量比為10%的F108作為乳化劑。使用超純水制備漆酶(真菌漆酶，CAS 80498-15-3，西寶生物科技，在30 ℃、pH 6.5、3 mL反應(yīng)體積中，以丁香醛連氮為底物時(shí)，1個(gè)單位每分鐘將產(chǎn)生的Δa530為0.001)溶液，將漆酶與超純水按照一定比例混合，經(jīng)過震蕩使之充分溶解，分別制成5 mg/L和15 mg/L的漆酶水溶液。漆酶溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，以防止酶失活。5 mg/L漆酶溶液用于做游離漆酶降解實(shí)驗(yàn)，15 mg/L漆酶溶液則用于制備載酶電紡纖維膜。

1.2 漆酶的固定化和電紡纖維膜制備

按照上述步驟制備紡絲液后，在紡絲液中加入0.5 mL、15 mg/L的漆酶溶液充分震蕩混合形成均勻溶液，即制成載漆酶紡絲液。將0.5 mL漆酶溶液替換為0.5 mL超純水按同樣方法震蕩混合制成空白膜紡絲液。載漆酶紡絲液現(xiàn)配現(xiàn)用。

乳液電紡的步驟如圖1所示，使用的裝置是自制的靜電紡絲裝置，由直流高壓電源、噴絲頭和接收裝置組成。靜電紡絲采用20 kV高壓電場(chǎng)，紡絲液噴射針尖及收集器之間的距離為15 cm。使用塑料滴管手動(dòng)將紡絲液引入紡絲容器中，調(diào)節(jié)各參數(shù)獲得穩(wěn)定連續(xù)的噴射，噴射出的纖維用鋁箔紙進(jìn)行收集。在紡織載酶膜時(shí)注意避光。待纖維膜厚度達(dá)到0.5～1.0 mm時(shí)，停止紡絲。一般情況下，紡一張足夠厚的膜需要40 min。紡織完成的膜放置在干燥避光處待其晾干。空白膜可儲(chǔ)存在4 ℃的條件下以備下次試驗(yàn)使用，載酶膜須現(xiàn)紡現(xiàn)用，防止酶失活。

圖1 乳液電紡流程圖Fig.1 Flow chart of emulsion electrospinning

1.3 電紡纖維膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的表征

固定化漆酶電紡纖維膜的形態(tài)特征采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM S-4800，Hitachi)來觀察表征。在靜電紡絲過程中，電紡纖維用激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM LSM510,ZEISS)觀察。固定化漆酶電紡纖維膜的比表面積和孔體積的測(cè)定采用是比表面孔分布測(cè)定儀(ASAP2020,Micromerities)。為了驗(yàn)證漆酶是否已經(jīng)被包埋入電紡纖維之中，使用配制好的紡絲液加入等量的未作標(biāo)記的漆酶溶液和用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的漆酶溶液分別進(jìn)行靜電紡絲，靜電紡絲之后均在激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)下觀察其包埋情況[10]。

1.4 游離漆酶及電紡纖維膜固定化漆酶酶活性的測(cè)定

通過紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定漆酶催化氧化2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)過程中的吸光度變化來確定漆酶活性，測(cè)量波長為420 nm[11]。游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶的酶活穩(wěn)定性和持久性通過30 d的連續(xù)測(cè)定得到，在此期間，游離漆酶及固定化漆酶樣品均在4 ℃下，儲(chǔ)存在pH為3.5的磷酸鹽緩沖溶液中。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差，每次實(shí)驗(yàn)之前電紡纖維膜均經(jīng)磷酸鹽緩沖液淋洗3次，再與ABTS溶液反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)10次。

1.5 游離漆酶和固定化漆酶對(duì)水中雙酚A的降解實(shí)驗(yàn)

分別量取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 mL 的1 000 mg/L BPA標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶中，定容，配制成為100 μg/L、500 μg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的BPA水溶液。稱取一定量漆酶固體與超純水混合，震蕩至完全溶解，形成5 mg/mL的漆酶溶液。每個(gè)反應(yīng)瓶中加入30 mL不同濃度的BPA水溶液和20 μL、5 mg/L的漆酶溶液，每個(gè)濃度各設(shè)置3組平行樣。將反應(yīng)器放入恒溫振蕩箱中進(jìn)行反應(yīng)，振蕩箱溫度設(shè)置為25 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)為160 r/min。取樣時(shí)間為5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h。從每個(gè)反應(yīng)器中吸取等體積的反應(yīng)液置于液相色譜進(jìn)樣瓶中，每個(gè)樣品取完后立即加入20 μL、0.1 mol/L的NaN3溶液，以抑制酶活性。

按上述步驟，將游離漆酶降解BPA實(shí)驗(yàn)中加入的20 μL、5 mg/L漆酶溶液替換為3片經(jīng)裁剪稱量完畢的載酶膜即為固定化漆酶降解BPA實(shí)驗(yàn)。

1.6 不同溫度下游離酶和固定化漆酶對(duì)雙酚A的降解實(shí)驗(yàn)

采用濃度為5 mg/L的BPA溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先量取一定量1 000 mg/L的BPA標(biāo)準(zhǔn)液與超純水混合，配制5 mg/L的BPA水溶液。每個(gè)反應(yīng)器中加入30 mL配制完畢的BPA水溶液，并加入20 μL、5 mg/L的漆酶溶液。將反應(yīng)器放置于恒溫振蕩箱中分批次進(jìn)行反應(yīng)，箱內(nèi)溫度分別設(shè)為5、15、35、45 ℃，轉(zhuǎn)速均設(shè)為160 r/min，取樣時(shí)間及樣品保存方法同上。進(jìn)一步地，按上述步驟，將游離漆酶溶液替換為3片經(jīng)裁剪稱量完畢的載酶膜即為不同溫度下固定化漆酶對(duì)BPA的降解實(shí)驗(yàn)。

1.7 水中雙酚A的濃度檢測(cè)

采用高效液相色譜(HPLC，Waters 1525)測(cè)定BPA濃度，檢測(cè)器為UV(Dual λ Absorbance Detector，Waters 2487)，C18反向液相色譜柱為，流動(dòng)相體積比為乙酸水溶液∶無水甲醇=2∶8，檢測(cè)波長為280 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 電紡纖維膜形貌的表征

運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)能夠使水-油型(W/O型)或油-水型(O/W型)乳液形成核-殼結(jié)構(gòu)纖維[12]，作為水相的漆酶可以直接包埋進(jìn)入電紡纖維的核心，并且核-殼結(jié)構(gòu)纖維能夠有效保護(hù)包埋入的蛋白質(zhì)，使其保持結(jié)構(gòu)完整性和生物活性[13]。

圖2 電紡纖維的SEM圖Fig.2 SEM diagrams of electrospun fibers

圖2為放大100、2 000、10 000、22 000倍后，在場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)下電紡纖維的照片。從圖中可以看出，電紡納米纖維膜形態(tài)類似無紡布，纖維成無序狀態(tài)排列。增大放大倍數(shù)之后，可以清晰地看到，每一根電紡納米纖維表面均疏松多孔，孔隙率高，與一般的超細(xì)纖維相比，具有更大的比表面積，有利于反應(yīng)底物的附著和反應(yīng)的進(jìn)行。

圖3為用經(jīng)FITC標(biāo)記的載酶紡絲液靜電紡絲后得到的電紡納米纖維膜在激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)下的照片。圖中電紡纖維內(nèi)部有帶紅色熒光的部分，即為帶FITC標(biāo)記的漆酶。如圖3可知，漆酶溶液已經(jīng)成功包埋于電紡納米纖維之中，形成殼-核結(jié)構(gòu)。

圖3 經(jīng)FITC標(biāo)記的載酶電紡納米纖維膜激光共聚焦掃描顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 Confocal scanning microscopy images of FITC-labeledenzyme-loaded electrospun nanofiber membranes

相比一般方法制備的纖維膜，通過靜電紡絲獲得的超細(xì)纖維膜具有極大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，有利于提高反應(yīng)底物對(duì)漆酶的結(jié)合位點(diǎn)的傳輸速率，以及其優(yōu)越的機(jī)械性能，使得超細(xì)纖維膜易從反應(yīng)液中恢復(fù)，可二次使用。同時(shí)，靜電紡絲制備纖維膜操作簡(jiǎn)單，制備成本低，制備的電紡纖維膜持久耐用，易于分離回收。因此，靜電乳液電紡纖維膜可以認(rèn)為是以包埋法固定化漆酶的理想載體。

2.2 漆酶活性評(píng)價(jià)

經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定漆酶催化氧化ATBS過程中的吸光度的變化，電紡納米纖維膜固定化漆酶對(duì)游離酶的活性保留率為78.5%。從這個(gè)結(jié)果可以看出，電紡纖維具有良好生物相容性的聚合物外殼，既保持了酶的活性，又保護(hù)了內(nèi)部的漆酶分子不受外界環(huán)境變化的影響。纖維表面的多孔結(jié)構(gòu)便于反應(yīng)基團(tuán)與漆酶分子的結(jié)合與分離，增加了漆酶的活性。電紡納米纖維膜這種特殊的結(jié)構(gòu)提高了纖維內(nèi)部漆酶活性的穩(wěn)定性。

以PDLGA材料制備電紡纖維膜，且在相同條件下對(duì)100 μg/L和500 μg/L的BPA溶液進(jìn)行反應(yīng)，考察吸附性。結(jié)果表明，PDLGA制備的電紡纖維膜對(duì)水中BPA無明顯吸附。經(jīng)5 h的反應(yīng)之后，各組對(duì)兩種濃度的BPA溶液的吸附率均在20%以內(nèi)，故本研究不考慮膜本身對(duì)BPA的吸附，只考察游離酶及固定化酶對(duì)BPA的降解作用。20 μL、5 mg/L的漆酶溶液與30 mL不同濃度的BPA水溶液反應(yīng)2 h，降解率隨時(shí)間變化如圖4(a)所示。通過靜電紡絲制備電紡纖維膜，并載入漆酶。每一張約45 cm × 45 cm、厚0.5～1.0 mm的膜載有0.5 mL、15 mg/L的漆酶溶液。將膜剪成1.5 cm ×1.5 cm小方塊之后，每30 mL BPA溶液加入3片小方塊膜反應(yīng)2 h，其降解率隨時(shí)間變化如圖4(b)所示。

圖4 游離漆酶及固定化漆酶降解水中不同濃度BPA的降解效率-時(shí)間曲線Fig.4 Degradation efficiency-time curves for the degradation of different concentrations of BPA in waterby free enzyme and immobilized enzyme

此游離酶和載酶膜對(duì)BPA的降解實(shí)驗(yàn)旨在比較游離酶和固定化酶對(duì)水中BPA降解率的高低及隨時(shí)間的變化。從圖中可以看出，總體上來說，在2 h的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)各濃度的BPA溶液，游離酶的降解率要高于固定化酶。游離酶對(duì)100 μg/L的BPA溶液在2 h內(nèi)可以全部降解，而固定化酶對(duì)其的降解率可達(dá)83.5%。由于固定化的過程中對(duì)酶活不可避免地會(huì)產(chǎn)生一定的損失，且酶固定化后，與反應(yīng)物的接觸面積比游離酶小，故固定化酶在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)BPA的降解率低于游離酶。從時(shí)間上來看，游離酶及固定化酶對(duì)各濃度BPA的降解率均隨時(shí)間遞增。相同酶量的游離酶和固定化酶對(duì)不同濃度的BPA溶液的降解率隨BPA的濃度增加而降低。對(duì)于高濃度(100 mg/L)的BPA溶液，游離酶及固定化酶的降解率分別為32.4%和31.7%。

2.3 溫度和pH對(duì)漆酶活性的影響

一般來說，生物酶產(chǎn)品受環(huán)境溫度和pH的影響較大，因此本研究重點(diǎn)考察溫度和pH對(duì)酶活的影響以及酶固定化前后活性和穩(wěn)定性的變化。本研究比較了5個(gè)溫度梯度下相同酶量對(duì)5 mg/L BPA溶液的降解作用(如圖5所示)。從圖5可以看出，漆酶對(duì)高溫的耐受性較好，對(duì)低溫的耐受性較差。5 ℃條件下，2 h內(nèi)游離酶對(duì)BPA的降解率為29.8%，固定化酶在此溫度下的降解率為31.2%，游離酶降解率不如固定化酶。在45 ℃條件下，游離酶的降解率可達(dá)89.4%，固定化酶為71.2%，游離酶隨溫度升高降解率波動(dòng)比固定化酶劇烈?？傮w上來說，固定化酶對(duì)BPA的降解率隨溫度變化在31.2%～71.2%范圍內(nèi)波動(dòng)，而游離酶則在29.8%～89.4%范圍內(nèi)波動(dòng)，故漆酶固定化后受溫度影響比游離漆酶要小，即固定化酶對(duì)溫度變化的耐受能力強(qiáng)于游離酶。

H3PO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)30 mL、5 mg/L BPA溶液的反應(yīng)體系溶液pH為1、3、5、7、9后，加入20 μL、5 mg/mL的游離漆酶溶液或3片1.5 cm×1.5 cm的載酶膜小方塊反應(yīng)2 h，BPA降解率隨時(shí)間變化如圖6所示。

圖5 不同溫度下游離漆酶和固定化漆酶對(duì)BPA降解率隨時(shí)間變化Fig.5 The degradation efficiency of BPA over time by free laccase and immobilized laccase at different temperatures

圖6 不同pH下游離漆酶和固定化漆酶對(duì)BPA降解率隨時(shí)間變化Fig.6 The degradation efficiency of BPA over time by free laccase and immobilized laccase at different pH values

與溫度類似，漆酶的活性受pH影響也較大。不同來源的漆酶，最適pH也不同。本實(shí)驗(yàn)同樣對(duì)比了5個(gè)pH梯度下游離酶和固定化酶對(duì)5 mg/L BPA溶液的降解率和隨時(shí)間變化規(guī)律。從圖中可以看出，游離酶降解率最高的pH為7，此時(shí)對(duì)應(yīng)的2 h降解率為59.8%，而固定化酶最佳pH為5，此時(shí)對(duì)應(yīng)的降解率為64.7%。此外，固定化酶對(duì)pH變化的耐受性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于游離酶。當(dāng)pH為1時(shí)，游離酶的降解率為0，而固定化酶在pH=1時(shí)仍有12.2%的降解率。在pH=9時(shí)，游離酶與固定化酶的降解率均為37.2%?？傮w上來說，固定化酶對(duì)BPA的降解率隨pH變化在12.2%～64.7% 范圍內(nèi)波動(dòng)，而游離酶則在0～59.8%范圍內(nèi)波動(dòng)?？傮w上來說，固定化酶的穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶，在特定條件下的催化活性也有一定優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié) 論

(1)漆酶以殼-核結(jié)構(gòu)成功包埋于電紡納米纖維之中，該固定化漆酶對(duì)游離酶的活性保留率為78.5%。

(2)2 h內(nèi)，固定化酶對(duì)100 μg/L的BPA溶液的降解率為83.5%，對(duì)100 mg/L的BPA降解率為31.7%。

(3)固定化酶對(duì)BPA的降解率隨溫度變化在31.2%～71.2%范圍內(nèi)波動(dòng)，游離酶隨溫度變化在29.8%～89.4%范圍內(nèi)波動(dòng)。

(4)固定化酶對(duì)BPA的降解率隨pH變化在12.2%～64.7%范圍內(nèi)波動(dòng)，游離酶隨pH變化在0～59.8%范圍內(nèi)波動(dòng)，故固定化酶的活性穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。