洪 靜， 楊方瑤， 蔣立翔， 簡甜甜， 王思瑜， 黃新河

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

天然產(chǎn)物及其衍生物擁有結(jié)構(gòu)新穎多樣、生物活性高等特點(diǎn)，一直以來都是藥物研發(fā)重要的來源之一[1]。來源于天然產(chǎn)物的生物堿、黃酮類、萜類、皂苷類化合物具有多種藥理活性，已被廣泛用于治療多種重大疾病,如惡性腫瘤、心腦血管疾病、感染性疾病等[2]。

蘭科石斛屬植物種類繁多，是一類藥用價(jià)值豐富的天然產(chǎn)物，石斛的藥用歷史距今已有兩千多年[3]，可以強(qiáng)健體魄、延年益壽，因此被傳統(tǒng)中醫(yī)列為滋補(bǔ)上品。毛蘭素是提取自鐵皮石斛及鼓槌石斛中的一類聯(lián)芐類化合物，近年來發(fā)現(xiàn)毛蘭素在體內(nèi)外對多種癌細(xì)胞株具有抗腫瘤作用[4]，是一種極具潛力的抗癌活性分子。毛蘭素可通過多種機(jī)制對不同的腫瘤發(fā)揮抑制作用，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)毛蘭素可以抑制癌細(xì)胞生長和增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或自噬、阻滯癌細(xì)胞周期、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化、抑制癌癥組織新生血管的生成、抑制細(xì)胞遷移和侵襲、抑制炎癥反應(yīng)、提高機(jī)體免疫力等[5]。

本綜述旨在總結(jié)和分析抗癌活性物質(zhì)毛蘭素抗腫瘤作用潛在的分子機(jī)制，并探討毛蘭素在臨床治療癌癥中的應(yīng)用前景。可對毛蘭素的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究，開發(fā)以毛蘭素作為先導(dǎo)化合物的抗癌新藥。

1 石斛的主要活性成分及藥理作用

石斛是蘭科植物石斛屬DendrobiumSw.藥用植物新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有豐富的藥用價(jià)值，石斛種類繁多，目前有5種石斛被《中國藥典》收錄,分別是鐵皮石斛、金釵石斛、流蘇石斛、霍山石斛和鼓槌石斛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對石斛的化學(xué)成分、藥理作用以及臨床使用進(jìn)行了大量研究，其活性成分主要為生物堿、多糖、菲類、聯(lián)芐類、黃酮類、甾醇類、萜類、氨基酸等化合物[6]。藥理學(xué)研究證明石斛具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、心血管與神經(jīng)保護(hù)作用等[7]，其中石斛及其提取物的抗腫瘤活性已被越來越多的學(xué)者研究和報(bào)道。

2 毛蘭素及其他聯(lián)芐類提取物的抗腫瘤作用

毛蘭素(Erianin)，2-methoxy-5-[2-(3,4,5-trimethoxy-phenyl)-ethyl]-phenol(圖1)是一種分離提取自鼓槌石斛中的低分子量單體，分子式為C18H22O5，目前在金釵石斛、鐵皮石斛、球花石斛、流蘇石斛中均發(fā)現(xiàn)含有毛蘭素。除石斛屬外，毛蘭素植物E.carinata中也可分離得到毛蘭素[8]。除了天然來源，目前毛蘭素也可通過化學(xué)合成獲得。

圖1 毛蘭素結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structure of erianin

傳統(tǒng)中醫(yī)常將毛蘭素作為一種解熱鎮(zhèn)痛藥物，目前研究發(fā)現(xiàn)毛蘭素在體內(nèi)外均可抑制腫瘤生長，具有優(yōu)秀的抗腫瘤活性，是一種廣譜的抗腫瘤活性成分。目前國內(nèi)外對毛蘭素抗腫瘤機(jī)制已有比較全面的研究，結(jié)果表明其可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤活性，如抑制細(xì)胞生長和增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管生成、調(diào)節(jié)免疫等[10]。

毛蘭素屬于聯(lián)芐類化合物，而聯(lián)芐類化合物在石斛屬藥物中廣泛存在。在石斛屬藥物中除毛蘭素外的多種聯(lián)芐類化合物被報(bào)道在體外具有抗腫瘤活性。如從金釵石斛中提取的鼓槌聯(lián)芐、玫瑰石斛素被發(fā)現(xiàn)在體外對高侵襲性肝癌具有抑制作用[9]；從鼓槌石斛中分離提取的石斛酚被發(fā)現(xiàn)對骨肉瘤U20S細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用[10]；從反瓣石斛中提取得到的4,5,4-三羥基-3,3-二甲氧基聯(lián)芐被發(fā)現(xiàn)可以抑制肺癌細(xì)胞的遷移[11]。

上述研究均證明石斛屬中的聯(lián)芐類化合物是石斛類藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要活性成分，同時(shí)說明聯(lián)芐的分子結(jié)構(gòu)對毛蘭素發(fā)揮抗腫瘤活性也具有重要作用，這為后續(xù)石斛屬抗腫瘤活性分子的篩選提供了新思路。

3 毛蘭素的抗腫瘤機(jī)制

3.1 毛蘭素抑制癌細(xì)胞生長和增殖

癌細(xì)胞的快速增殖是其區(qū)別正常細(xì)胞的一大特點(diǎn)，快速增殖帶來的機(jī)體消耗往往使患者虛弱甚至死亡，因此目前臨床上的許多化療藥物通過抑制惡性腫瘤的生長增殖來達(dá)到治療目的。

研究表明，小分子化合物毛蘭素在體內(nèi)及體外對一系列人類癌細(xì)胞株具有細(xì)胞毒性，包括對白血病K562[12]、HL-60細(xì)胞[13]、胃癌MGC803、SGC-7901細(xì)胞[14-15]、肝癌SMMC-7721、HepG2、Huh7、SNU449、Bel-7402細(xì)胞[16-19]、結(jié)腸癌SW480、HCT116細(xì)胞[20-22]、骨肉瘤MG63.2 細(xì)胞[23]、乳腺癌細(xì)胞T47D[24]、肺癌A549、LL/2細(xì)胞[25-26]、膀胱癌EJ、T24細(xì)胞[27-28]、鼻咽癌NPC-BM、NPC-039細(xì)胞[29]、宮頸癌Hela細(xì)胞[30-31]、口腔鱗狀癌SCC9、CAL27、OSC20細(xì)胞[32]等(表1)， 毛蘭素均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，且該抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，毛蘭素對癌細(xì)胞株的平均IC50值在納摩爾水平。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，毛蘭素是一種極具潛力的抗癌活性成分，但其藥效學(xué)和毒理藥理學(xué)仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 毛蘭素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡,是由機(jī)體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程[33]。真核細(xì)胞主要存在4種凋亡通路，毛蘭素被報(bào)道主要通過內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。其中，天冬氨酸蛋白水解酶 (caspase) 家族級聯(lián)反應(yīng)的激活在內(nèi)源性凋亡過程中起著執(zhí)行作用,其激活往往伴隨著底物蛋白酶PARP的降解[34]。如白血病HL-60細(xì)胞[13]、乳腺癌T47D細(xì)胞[24]、結(jié)腸癌SW480細(xì)胞[20]、口腔鱗狀細(xì)胞癌OSCC細(xì)胞[32]、肝癌 SMMC-7721 和HepG2細(xì)胞中[16]均有報(bào)道毛蘭素可通過引起caspase級聯(lián)反應(yīng)和激活PARP的活性，最終啟動線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑，從而誘導(dǎo)上述多種腫瘤細(xì)胞凋亡。

類似地，毛蘭素可以抑制人骨肉瘤細(xì)胞的生長，毛蘭素通過激活活性氧依賴的JNK/c-Jun通路誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[23]。Bcl-2家族蛋白與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)[33]，其主要包括促凋亡蛋白(BAG-3，Bcl-2，Bcl-W，Bcl-X等)和抗凋亡蛋白(Bax、Bak、Bim、Bad、Bid等)，在肝癌SMMC-7721 和HepG2細(xì)胞異種移植瘤裸鼠模型中，毛蘭素處理上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bad、Bim和PUMA的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，且呈時(shí)間劑量依賴性[18]。在膀胱癌EJ和T24細(xì)胞中，毛蘭素通過上調(diào)Bim和下調(diào)Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是通過激活JNK信號通路實(shí)現(xiàn)的[27]。

p53是一種抑癌基因，在宮頸癌Hela細(xì)胞中，毛蘭素促進(jìn)p53的活化來促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，并通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號和線粒體途徑引起凋亡[30]；在毛蘭素處理后的T47D細(xì)胞中，促凋亡因子Bax，p12,p18,p27、p53、p21顯著上調(diào)[24]。在人鼻咽癌細(xì)胞中，毛蘭素通過抑制ERK信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且該效應(yīng)可以被ERK通路激活劑減弱[29]，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)毛蘭素通過抑制PI3K/AKT和p38-ERK MAPK信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[16]。上述研究表明，毛蘭素可以通過多種機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

3.3 毛蘭素阻滯癌細(xì)胞周期

針對癌細(xì)胞的周期失調(diào)，將其阻滯于某一周期從而抑制其無限增殖是抗腫瘤治療的一大策略[35]。

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞[18]及結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中[20]，毛蘭素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/ M期阻滯來抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)伴隨G0/ G1期和S期細(xì)胞數(shù)量減少[30]。此外，毛蘭素誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞的周期蛋白CyclinD1和ICAM-1的表達(dá)下調(diào)，將其阻滯于G1期細(xì)胞周期。而在口腔鱗癌細(xì)胞中，毛蘭素處理24 h后，G2/M期細(xì)胞顯著增加，使其被阻滯于G2/M期而抑制其生長[32]。在人骨肉瘤細(xì)胞中，毛蘭素可以誘導(dǎo)其G2/M期阻滯，這是通過調(diào)控CyclinB1，phospho-Cdk1，phospho-Cdc25c，p21和p27的表達(dá)上調(diào)，CDK1表達(dá)下調(diào)來實(shí)現(xiàn)的[23]。在乳腺癌T47D細(xì)胞中，毛蘭素誘導(dǎo)其G2/M期阻滯，且毛蘭素處理后周期蛋白依賴性激酶CDK1、2、4、7、8、9、10的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[24]。在膀胱癌EJ和T24細(xì)胞中，體外實(shí)驗(yàn)表明毛蘭素通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)G2/M期周期阻滯[27]。結(jié)果表明，毛蘭素可以調(diào)控多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.4 毛蘭素癌誘導(dǎo)腫瘤自噬

細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性死亡，是細(xì)胞內(nèi)重要的物質(zhì)分解代謝過程，主要通過雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡包裹錯(cuò)誤蛋白或受損細(xì)胞器,與溶酶體融合,經(jīng)溶酶體酸性水解酶水解作用產(chǎn)生能量和小分子供細(xì)胞再次利用的過程[36]。

自噬在腫瘤發(fā)展中的作用復(fù)雜，目前被廣泛接受的是自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用[37]。LC3參與了自噬體膜的形成,LC3經(jīng)過兩步加工形成LC3II、LC3II定位于自噬體,是自噬體的形成標(biāo)志[36]。在口腔鱗癌細(xì)胞SAS和SCC9細(xì)胞中，毛蘭素處理24 h后，可以觀察到自噬細(xì)胞的特征自噬小體的形成，毛蘭素通過上調(diào)兩種細(xì)胞系中LC3-I和LC3-II的表達(dá)，降低自噬接頭蛋白p62的表達(dá)，誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬[32]。而在骨肉瘤143B和MG63.2細(xì)胞中，ROS/JNK通路介導(dǎo)了毛蘭素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，毛蘭素促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中酸性囊泡細(xì)胞器增多，這也是自噬的特征之一，同時(shí)其上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3BII、Beclin-1和自噬接頭蛋白p62的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞自噬。在使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制毛蘭素誘導(dǎo)的自噬后，細(xì)胞凋亡反而增強(qiáng)[23]，說明毛蘭素促進(jìn)的癌細(xì)胞自噬對骨肉瘤是一種保護(hù)作用。

3.5 毛蘭素抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移

惡性腫瘤最大的特性就是侵襲和轉(zhuǎn)移,這也是導(dǎo)致化療失敗及患者死亡的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT )是極性和黏附性的上皮細(xì)胞特征減少而遷移和侵襲的間充質(zhì)細(xì)胞特性增強(qiáng)的過程，EMT在癌癥轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[38]。EMT受到如鈣黏蛋白(cadherin)、轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等的調(diào)節(jié)[39]。

在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，毛蘭素通過抑制程序性細(xì)胞死亡配體1(PD-L1)來誘導(dǎo)間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、vimentin和轉(zhuǎn)錄因子Slug顯著下調(diào)，同時(shí)上調(diào)上皮標(biāo)記物E-cadherin來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[20]。MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成中具有重要作用，可降解細(xì)胞外基質(zhì)而降低細(xì)胞的黏附性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。毛蘭素通過下調(diào)侵襲相關(guān)基因vimentin、N-cadherin、slug、snail、MMP-9以及上調(diào)侵襲抑制基因E-cadherin來抑制肺癌H460和H1299細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[40]。毛蘭素可以通過調(diào)控ERK1/2通路抑制乳腺癌T47D的轉(zhuǎn)移，且具有良好的時(shí)間依賴性，毛蘭素可以下調(diào)MMP2、MMP9、CDH2和纖連蛋白的表達(dá)，并上調(diào)侵襲抑制基因MMPs組織抑制劑1 (TIMP1)、TIMP2和CDH1的表達(dá)[24]。此外，毛蘭素通過抑制N-cadherin、MMP-2、MMP-7、MMP-9水平，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)顯著升高，來抑制肝癌SMMC7721和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。

3.6 毛蘭素抑制腫瘤新生血管生成

毛蘭素被報(bào)道通過下調(diào)PD-L1、VEGF和MMP9的表達(dá)水平和抑制人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞的小管形成，抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞中的新生血管生成。此外，在人宮頸癌Hela異種移植瘤裸鼠模型中，毛蘭素通過降低HIF-1α、RAS和VEGF的表達(dá)，抑制小鼠體內(nèi)新生血管生成[30]。JAK/STAT通路和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)與血管生成密切相關(guān)，毛蘭素被報(bào)道可以抑制IDO誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞血管生成，而在血管生成模擬實(shí)驗(yàn)中，毛蘭素可以抑制小鼠肺癌LL/2細(xì)胞IDO誘導(dǎo)的血管生成擬態(tài)，而且毛蘭素可以阻斷p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)，降低MMP-9、MMP-2，這是通過毛蘭素對JAK2/STAT3通路的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，此外，毛蘭素還可以抑制小鼠LL/2細(xì)胞IDO誘導(dǎo)的COX-2、HIF-1和IL-6的表達(dá)水平[26]，說明毛蘭素可以通過調(diào)控炎癥微環(huán)境中的關(guān)鍵因子發(fā)揮抗腫瘤新生血管生成的效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素抑制人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞的增殖和小管的形成，并抑制其遷移和黏附，而且毛蘭素可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗血管生成能力;在體內(nèi)的雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)(CAM)中，毛蘭素劑量依賴性的抑制bFGF誘導(dǎo)的和自發(fā)的血管生成反應(yīng)[41]。此外，毛蘭素的衍生物ZJU-6在CAM實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗血管生成能力，上述數(shù)據(jù)均表明，毛蘭素在體內(nèi)外均具有強(qiáng)大的抗血管生成能力[42]。

3.7 其他機(jī)制

免疫療法目前是抗腫瘤治療一大有力手段。研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞與活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)的模型中，毛蘭素作用后細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ含量增加，說明毛蘭素增強(qiáng)了T細(xì)胞對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性，使其發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[30]。有研究發(fā)現(xiàn)在BALB/c裸鼠的HepG2和SMMC -772異種移植瘤模型中，發(fā)現(xiàn)毛蘭素提高了血清TNF-α和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的功能[18]，說明毛蘭素可以提高免疫系統(tǒng)功能。

腫瘤微環(huán)境中存在大量的炎癥因子和炎癥細(xì)胞，他們相互促進(jìn)并有利于慢性炎癥的發(fā)生和浸潤[43]。有研究發(fā)現(xiàn)在BALB/c裸鼠的HepG2和SMMC -772異種移植瘤模型中，毛蘭素處理后降低了細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),提高了抗氧化因子HO-1和SOD-1的基因表達(dá)水平，這與毛蘭素調(diào)控Nrf2和NF-κB通路有關(guān)[18]。

4 總結(jié)與展望

石斛屬藥物具有多種藥理活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健品行業(yè)，在石斛屬單體中，毛蘭素的抗腫瘤作用被廣泛報(bào)道，但目前對毛蘭素作用直接靶點(diǎn)的鑒定、毛蘭素的成藥工藝研究、藥物不良反應(yīng)、藥理學(xué)研究、結(jié)構(gòu)優(yōu)化等方面仍缺乏深入探索。毛蘭素在體內(nèi)外均可通過多種信號通路及重要分子發(fā)揮其抗腫瘤作用[16,18,23-24,30,32,40]，本課題組將其歸納并具體總結(jié)如圖2。

圖2 毛蘭素抗腫瘤作用機(jī)制Figure 2 Summary of the anti-tumor mechanism of erianin

本文總結(jié)了毛蘭素可能的抗腫瘤作用機(jī)制，旨在為毛蘭素后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。