彭 凱， 逯曉云， 盧麗娜， 張娟琨， 江會鋒

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院， 天津 300457； 2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300308)

蛋白質(zhì)是生命體關(guān)鍵的功能大分子，在生長快速、基因工程技術(shù)成熟的大腸桿菌中表達(dá)異源基因，已成為獲取或研究異源蛋白最簡單的方式。但異源表達(dá)中常見的低表達(dá)和可溶性的問題限制了基因異源宿主中的再利用，也阻礙了生物蛋白在生物催化、生物制藥和臨床檢測方面的推廣和應(yīng)用[1]。

從DNA水平到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從翻譯過程到外界環(huán)境，分子伴侶或助溶性標(biāo)簽都會影響大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)異源蛋白[2-3]。常用的對復(fù)制起始位點(diǎn)(origin of replication,ori)、啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site,RBS)、蛋白融合標(biāo)簽、分子伴侶和基因的組成及結(jié)構(gòu)等因素的調(diào)控策略也有助于異源基因的正常表達(dá)(圖1)。其中針對翻譯過程中mRNA組成與結(jié)構(gòu)的研究最為深入[4-6]。mRNA遺傳密碼子在定義蛋白質(zhì)氨基酸序列的同時，還包含著影響翻譯速率和效率的信息[7]。密碼子作為mRNA的基本功能結(jié)構(gòu)，其生物性約束將影響翻譯的全過程。但現(xiàn)有的密碼子介導(dǎo)的蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制并未得到明析的理解[8-10]。mRNA的二級結(jié)構(gòu)作為另一種基本結(jié)構(gòu)，其空間物理約束強(qiáng)烈影響翻譯過程速率。研究表明mRNA的+1～+100 nt區(qū)域的結(jié)構(gòu)對細(xì)菌翻譯起始的影響很大，改變這一段序列的結(jié)構(gòu)會對蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生顯著影響[11-13]。

圖1 基因表達(dá)調(diào)控策略Figure 1 Gene expression regulation strategy

重疊基因(overlapping genes,OG)是指兩個或兩個以上的基因共用一段完全相同的DNA序列[14]?；蚩啥喾N方式重疊，形成的共用序列通過不同的讀取方式對多個基因產(chǎn)物作出貢獻(xiàn)，可有效提高遺傳物質(zhì)的編碼能力，也會對發(fā)生偶聯(lián)的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程產(chǎn)生重要影響[15]。

共用DNA序列長的重疊基因，特異性強(qiáng)，難以再利用。但當(dāng)兩個基因以單堿基對重疊時，即前一個基因的終止密碼子(TGA)和后一個基因的起始密碼子(ATG)僅共用一對堿基，形成TGATG重疊形式，則可被再利用于蛋白表達(dá)調(diào)控。這種形式轉(zhuǎn)錄出的mRNA上，包含了兩個重疊的閱讀框。核糖體在前一個終止密碼子處完成閱讀框的翻譯后，不會立即完全解開游離，而是經(jīng)過終止-重新初始化過程，重新開始讀取下一個起始密碼子[16]。使這兩個僅共用一個堿基對的基因產(chǎn)物將被分開翻譯出來(圖2)。

圖2 TGATG重疊類型Figure 2 TGATG overlap type

基于原核生物邊轉(zhuǎn)錄-邊翻譯-邊折疊的多聚核糖體表達(dá)模式[17-18]，我們將這種終止-重起始過程引入到大腸桿菌異源蛋白表達(dá)質(zhì)粒中，融合mRNA的5′-端序列變化(密碼子簡并性允許在氨基酸不變的情況下，通過對mRNA的5′-端區(qū)域進(jìn)行同義密碼子替換，來改變mRNA的二級結(jié)構(gòu))，探索重疊基因強(qiáng)度變化對異源蛋白表達(dá)量和可溶性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和基因

大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自TransGen Biotech公司；pET-28a (+)質(zhì)粒和候選基因FLS(Formolase)、GAOA[Galactose oxidase(Gibberellazeae)]、PPK[Polyphosphate kinase (Klebsiellapneumoniae)]和HACL[2-hydroxyacyl-CoA lyase (Homosapiens)]均來自本實(shí)驗(yàn)室基因庫。

1.1.2 主要工具酶和試劑盒

高保真DNA聚合酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase購自TaKaRa公司；無縫克隆試劑盒Minerva Super Fusion Cloning Kit購自天津百倍生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液試劑

LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基， 2×YT培養(yǎng)基；1×TAE電泳緩沖液，1×Tris-Glycine蛋白電泳緩沖液，SDS-PAGE染色液。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

選取實(shí)驗(yàn)室基因庫中存在表達(dá)問題的候選基因。2個低表達(dá)的基因FLS(59 ku)、GAOA(68.5 ku)，3個不可溶表達(dá)的基因FLS(wild type,wt低表達(dá))、PPK(80.4 ku)、HACL(61 ku)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計，在各基因起始密碼子之后的連續(xù)13個密碼子上設(shè)計簡并引物。利用簡并引物向基因上引入同義突變，基因與載體片段的融合基于Minerva Super Fusion Cloning Kit的方法。將構(gòu)建好的表達(dá)載體pET-28a-Gene轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，建立篩選庫。

1.2.2 mRNA的5′-端序列優(yōu)化設(shè)計

驗(yàn)證基因mRNA的5′-端約100 nt區(qū)域?qū)Φ鞍妆磉_(dá)的影響。選取已知的低表達(dá)基因FLS、GAOA，設(shè)計簡并引物，如圖3，構(gòu)建5′-端序列優(yōu)化篩選庫。

圖3 同義突變設(shè)計Figure 3 Synonymous mutation design

FLS、GAOA的5′-端簡并引物設(shè)計：FLS上游引物：5′-CGCGCGGCAGCCATATGGCNATGATHACNGGNGG-NGARCTNGTNGTNCGNACNCTNATT-AAAGCTGGCGTAGAAC-3′。

GAOA上游引物：5′-AGAAGGAGATATACCATGGCNTCNGCNCCNATHGGNAGYGCNATHAGYCGNAAY-AAYTGGGCAGTTACCTGTGAT-3′。

1.2.3 重疊基因結(jié)構(gòu)設(shè)計

驗(yàn)證重疊基因結(jié)構(gòu)對蛋白表達(dá)的影響。不可溶表達(dá)基因FLS(wt低表達(dá))、PPK、HACL，保留pET-28a載體上表達(dá)框5′-端His-Tag和thrombin site的DNA序列，在基因起始密碼子前引入兩個堿基TG，形成TGATG共用堿基A的重疊基因形式，設(shè)計簡并引物，如圖4，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-Gene(OG)，建立mRNA的5′-端重疊基因結(jié)構(gòu)篩選庫。

圖4 重疊基因結(jié)構(gòu)設(shè)計Figure 4 Overlapping gene structure design

FLS(OG)、PPK(OG)、HACL(OG)的5′-端重疊基因結(jié)構(gòu)篩選引物設(shè)計。FLS(OG)上游引物：5′-CGCGCG-GCAGCCATTGATGGCNATGATHACNGGNGGNGARCT-NGTNGTNCGNACNCTNATTAAAGCTGGCGTAGAAC-3′。

PPK(OG)上游引物：5′-CGCGCGGCAGCCATTGATGGGNCARGARAARCTNTAYATHGARAARGARCT-NTCNTGGCTGTCTTTCAACGAACG-3′。

HACL(OG)上游引物：5′-GCGCGGCAGCCATTGATGCCNGAYTCNAAYTTYGCNGARCGNTCYGARGA-RCARGTNTCTGGTGCTAAAGTTATCGCTC-3′。

1.2.4 表達(dá)量差異分析

(1) 單克隆挑取及誘導(dǎo)表達(dá)。挑取單克隆(10～20個單克隆)，轉(zhuǎn)至有2×YT培養(yǎng)基(Kan+，100 μg/mL)的24孔板或無菌EP管內(nèi)，37 ℃搖床培養(yǎng)，作為種子液。再轉(zhuǎn)接到試管，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)至OD600為0.8左右，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，17 ℃，220 r/min，誘導(dǎo)14～16 h。測量各菌株收集時的OD600，離心收菌，PBS重懸，控制各樣品的終OD600一致(OD600=15～20)。

(2) SDS-PAGE膠檢測。制全細(xì)胞的SDS-PAGE樣品，保持上樣量相同，通過SDS-PAGE膠檢測目的蛋白表達(dá)量。將電泳完成的膠，經(jīng)染色和脫色處理后，使用凝膠成像儀拍攝保存膠圖。

(3) 通過Image J 軟件分析SDS-PAGE膠中目標(biāo)蛋白灰度，并使用內(nèi)參蛋白GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,35 ku)做歸一化處理，計算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 mRNA的5′-端序列變化對蛋白表達(dá)的影響

2.1.1 mRNA的5′-端序列變化對表達(dá)量的影響

原核生物的邊轉(zhuǎn)錄-邊翻譯表達(dá)模式表明，mRNA的5′-端起始密碼子附近區(qū)域的結(jié)構(gòu)會影響翻譯起始過程。若這段區(qū)域內(nèi)同義突變點(diǎn)越多，其變化多樣性幅度就越高。針對DNA序列，通過引物設(shè)計，在低表達(dá)基因FLS和GAOA上各自突變部分區(qū)域，覆蓋約100 nt區(qū)域，驗(yàn)證mRNA的5′-端區(qū)域?qū)Φ鞍妆磉_(dá)的影響。隨機(jī)挑選少量克隆，培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，全細(xì)胞制樣，SDS-PAGE檢測其表達(dá)變化，如圖5。突變體測序，F(xiàn)LS突變體序列見表1，GAOA突變體序列見表2。

(a)FLS突變庫的SDS-PAGE分析(1～12：FLS突變菌株的全細(xì)胞樣)；(b)GAOA突變庫的SDS-PAGE分析(1～12：GAOA突變菌株的全細(xì)胞樣)。M: Protein Marker；C0：相應(yīng)含pET-28a-Gene (wt)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞樣；C1：相應(yīng)含pET-28a-Gene (wt)的全細(xì)胞樣。圖5 突變體文庫的SDS-PAGE分析Figure 5 SDS-PAGE analysis of mutant library

表1 FLS前14個氨基酸的密碼子優(yōu)化

表2 GAOA前14個氨基酸的密碼子優(yōu)化

分析膠圖，對低表達(dá)基因FLS和GAOA，大部分同義突變體相較于野生型(wt)，表達(dá)量均有明顯提高，且呈現(xiàn)出一定的波動。表明mRNA的5′-端100 nt區(qū)域范圍內(nèi)的序列變化，都會強(qiáng)烈影響基因的表達(dá)水平。分析測序結(jié)果，表達(dá)量的變化與密碼子的使用并無明顯相關(guān)性，更可能與mRNA的5′-端的二級結(jié)構(gòu)、GC含量相關(guān)。

2.1.2 mRNA的5′-端序列變化對可溶性的影響

挑選FLS、GAOA中表達(dá)量較高的菌株進(jìn)行簡單的可溶性驗(yàn)證，200 mL體系誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)高壓勻漿機(jī)破碎細(xì)胞后，離心，取上清液制樣，SDS-PAGE膠檢測其表達(dá)變化。簡單觀察發(fā)現(xiàn)FLS上清樣中幾乎沒有可溶性蛋白，而GAOA的上清樣中有可溶性蛋白，如圖6。

(a)FLS突變體可溶性表達(dá)分析 [M: Protein Marker；C1：FLS (wt)的全細(xì)胞樣；C2：FLS (wt)細(xì)胞破碎上清樣；1：FLS (7)的全細(xì)胞樣；2：FLS (7)細(xì)胞破碎上清樣]。(b)GAOA突變體可溶性表達(dá)分析[M: Protein Marker；1：GAOA(11)的全細(xì)胞樣；2：GAOA(11)細(xì)胞破碎上清樣；3、4：經(jīng)Ni-NTA純化后的GAOA 蛋白樣]。圖6 FLS和GAOA突變體的可溶性表達(dá)分析Figure 6 Soluble expression analysis of FLS and GAOA mutants

蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)形成空間結(jié)構(gòu)的過程主要由細(xì)胞質(zhì)的環(huán)境條件(折疊環(huán)境)和翻譯速率兩個因素控制[19]。如大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境呈現(xiàn)還原性，不利于蛋白二硫鍵的形成和穩(wěn)定，產(chǎn)生包涵體。此外，大腸桿菌中可溶性蛋白的產(chǎn)率主要取決于蛋白的合成速率和蛋白的折疊速率。FLS不可溶表達(dá)的原因可能與表達(dá)速率過快有關(guān)，減慢翻譯速率將有助于蛋白的可溶性表達(dá)。

2.2 重疊基因結(jié)構(gòu)對蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 重疊基因結(jié)構(gòu)對蛋白表達(dá)量的影響

經(jīng)初步的試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)單堿基重疊的兩個基因并不是以等量偶聯(lián)翻譯的。一些序列形成的單堿基重疊，后一個基因可能無法表達(dá)，說明重疊區(qū)域的結(jié)構(gòu)會影響核糖體終止-重新初始化過程，調(diào)控基因的翻譯過程。融合重疊基因結(jié)構(gòu)和mRNA的5′-端序列優(yōu)化，形成基于重疊基因結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的翻譯調(diào)控方法，可能有助于蛋白的可溶性表達(dá)。將pET-28a的5′-端標(biāo)簽序列作為重疊基因的一部分片段，在基因FLS、PPK、HACL的起始密碼子前引入兩個堿基TG形成重疊基因結(jié)構(gòu)，通過引物設(shè)計，構(gòu)建FLS(OG)、PPK(OG)、HACL(OG) 重疊基因結(jié)構(gòu)強(qiáng)度篩選庫。隨機(jī)挑選少量克隆，培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，全細(xì)胞制樣，SDS-PAGE檢測其蛋白量變化，如圖7。突變體測序，F(xiàn)LS(OG)突變體序列見表3，PPK(OG)突變體序列見表4、HACL(OG)突變體序列見表5。

表3 FLS(OG)重疊基因結(jié)構(gòu)篩選

2.2.2 重疊基因結(jié)構(gòu)對蛋白可溶性的影響

重疊基因結(jié)構(gòu)篩選結(jié)果表明，發(fā)生重疊的基因，其表達(dá)量與重疊基因結(jié)構(gòu)強(qiáng)度有關(guān)。挑選FLS(OG)、PPK(OG)、HACL(OG)中表達(dá)量較高的菌株進(jìn)行可溶性驗(yàn)證，200 mL體系誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)高壓勻漿機(jī)破碎細(xì)胞后，離心，制樣，經(jīng)SDS-PAGE膠檢測，如圖8，發(fā)現(xiàn)其中FLS(OG)、PPK(OG)可溶性表達(dá)有顯著提高，而HACL(OG)上清樣中無明顯可溶性蛋白。

(a)FLS(OG)突變體可溶性表達(dá)分析[M: Protein Marker；C1：FLS(OG-wt)細(xì)胞破碎上清樣；1：FLS(OG-1)全細(xì)胞樣；2：FLS(OG-2)細(xì)胞破碎上清樣；3：FLS(OG-9)細(xì)胞破碎上清樣]。(b)PPK(OG)突變體可溶性表達(dá)分析 [M: Protein Marker；C0：PPK(OG-wt)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞樣；C1：PPK(OG-1)的全細(xì)胞樣；1: PPK(OG-2)細(xì)胞破碎上清樣；2：PPK(OG-2)細(xì)胞破碎沉淀樣；3：PPK(OG-13)細(xì)胞破碎上清樣；4：PPK(OG-13)細(xì)胞破碎沉淀樣]。(c)HACL(OG)突變體可溶性表達(dá)分析 [M: Protein Marker；C0：HACL(OG-wt)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞樣；C1：HACL(OG-1)的全細(xì)胞樣；1：HACL(OG-9)細(xì)胞破碎上清樣；2：HACL(OG-9)細(xì)胞破碎沉淀樣；3：HACL(OG-12)細(xì)胞破碎上清樣；4：HACL(OG-12)細(xì)胞破碎沉淀樣]。圖8 重疊基因?qū)Φ鞍卓扇苄员磉_(dá)的影響Figure 8 The effect of overlapping genes on the soluble expressionof protein

利用重疊基因結(jié)構(gòu)強(qiáng)度篩選的策略，篩選FLS高表達(dá)可溶性突變體，將在大腸桿菌中FLS的可溶性表達(dá)量提高了近6倍，如圖9，突變體序列見表6。利用FLS通過全細(xì)胞催化將乙醛縮合成乙偶姻，再通過化學(xué)法將乙偶姻轉(zhuǎn)化為川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪，TMP)。優(yōu)化反應(yīng)條件后，乙偶姻和川芎嗪的滴度分別達(dá)到222 g/L和94 g/L，乙醛的轉(zhuǎn)化率分別為86.5%和48%，這是已知TMP報道的最高產(chǎn)量[20]。

3 討論與結(jié)論

利用mRNA的5′-端序列優(yōu)化的方法成功提高了低表達(dá)基因的蛋白表達(dá)量。在低表達(dá)基因FLS和GAOA的+1～+100 nt序列內(nèi)的兩個不同區(qū)域引入同義突變，對其突變體的蛋白表達(dá)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量均發(fā)生了大幅度變化，證明了mRNA的5′-端約100 nt序列的不同區(qū)域的變化均能強(qiáng)烈影響蛋白的表達(dá)水平。

(a)FLS突變體可溶性表達(dá)分析[M: Protein Marker； C1：FLS(wt)細(xì)胞破碎上清樣；C2：FLS(OG-wt) 細(xì)胞破碎上清樣；1：FLS(a)細(xì)胞破碎上清樣；2：FLS(OG-a)細(xì)胞破碎上清樣；3：FLS(b)細(xì)胞破碎上清樣；4：FLS(OG-b)細(xì)胞破碎上清樣]。(b)使用Image J分析的相對表達(dá)量。圖9 FLS可溶性表達(dá)量差異分析Figure 9 Analysis of the difference in the soluble expression of FLS

表6 FLS重疊基因結(jié)構(gòu)篩選

試驗(yàn)設(shè)計在優(yōu)化基因的5′-端序列使mRNA的二級結(jié)構(gòu)和密碼子適應(yīng)性同時發(fā)生了改變，從組成與結(jié)構(gòu)的關(guān)系來看，這兩個因素既有聯(lián)系又有區(qū)別。在分析突變體序列與表達(dá)量變化的關(guān)系時，采用RNAfold web Server計算GAOA突變體mRNA的最小自由能[分析序列為5′-UTR(untranslated region) + AUG +同義突變部分，其中5′-UTR序列是AGAAGGAGAUAUCAU]，并對照標(biāo)準(zhǔn)E.coli密碼子使用表統(tǒng)計GAOA同義突變部分使用頻率低于10%密碼子的個數(shù)。分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)的GAOA-C1 (-67.36 kJ/mol,0)和GAOA-8 (-35.15 kJ/mol,5)，高表達(dá)的GAOA-2 (-40.58 kJ/mol,3)、 GAOA-11 (-32.22 kJ/mol,5)和GAOA-12 (-60.67 kJ/mol,3)，如果分析這5個突變體的密碼子使用或mRNA的5′-端自由能來確定決定性表達(dá)量的影響因素，無論是改變最小自由能還是密碼子使用頻率，其與表達(dá)量關(guān)系的結(jié)論都是矛盾和混亂的。對這樣相互影響的變量的分析，更為深入的結(jié)論則需要從大樣本的統(tǒng)計學(xué)上進(jìn)一步研究。

通過在翻譯過程中引入重疊基因結(jié)構(gòu)，成功提高了FLS和PPK基因的可溶性表達(dá)量，證明重疊基因在調(diào)控蛋白可溶性表達(dá)中的作用。其中對FLS的表達(dá)優(yōu)化結(jié)果也應(yīng)用到了川芎嗪的合成中。我們也觀察到，HACL基因在重疊基因結(jié)構(gòu)調(diào)控下，可溶性并未增加。

針對異源基因表達(dá)，重疊結(jié)構(gòu)在調(diào)控可溶性上并未顯示出高通用性。對重疊基因結(jié)構(gòu)的設(shè)計，我們利用pET-28a表達(dá)載體自身含有的標(biāo)簽序列片段，僅在基因起始密碼子前增加兩個堿基TG，形成TGATG重疊。重疊基因的前一個基因片段并不是固定的，它的長度或序列是可變和可設(shè)計的。這一片段的變化會影響SD(Shine-Dalgarno)序列與后一閱讀框的間隔長度和重疊區(qū)域的mRNA二級結(jié)構(gòu)，而這兩個因素會直接影響核糖體終止-重起始過程的效率，導(dǎo)致核糖體在后一個閱讀框內(nèi)的數(shù)量和密度分布發(fā)生改變，這也可能是其調(diào)節(jié)翻譯速率來改善蛋白的可溶性的機(jī)制[14,16]。使用不同的重疊片段，對后一蛋白翻譯起始和翻譯速率的影響也會有所差異。

蛋白表達(dá)是一個涉及諸多因素協(xié)調(diào)工作的過程，其中翻譯過程中mRNA的密碼子使用和空間結(jié)構(gòu)是影響蛋白質(zhì)翻譯-折疊過程速率的重要因素，也包含著維持細(xì)胞生命有序性活動的重要信息。在進(jìn)行異源基因表達(dá)時，細(xì)胞“黑箱”能在一定范圍內(nèi)平衡各因素波動的影響，但當(dāng)失衡影響超過限度時，僅通過單因素調(diào)控，難以找到一種普遍適用的優(yōu)化方法。本研究證明重疊基因結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)異源蛋白的表達(dá)量和改善可溶性方面的作用，提出一種基于重疊基因結(jié)構(gòu)篩選的異源蛋白表達(dá)優(yōu)化方法，這種新方法是對現(xiàn)有蛋白表達(dá)調(diào)控策略的有效補(bǔ)充。