秦亞麗，冀美琦，訾迎新，鄧婷婷，韓夢(mèng)雨，金明

視網(wǎng)膜缺血性損傷（retinal ischemic injury，RII）是許多眼底血管性疾病的病理基礎(chǔ)之一，如視網(wǎng)膜血管阻塞、缺血性視神經(jīng)病變等[1-2]。RII 導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織內(nèi)長(zhǎng)期低灌注，并誘發(fā)不可逆的視神經(jīng)細(xì)胞退行性病變，最終造成患者視力下降或視覺(jué)障礙。選擇理想的RII 模型，深入探索其潛在的發(fā)病機(jī)制，可以為全面認(rèn)識(shí)該病變并尋求有效的治療方法提供研究基礎(chǔ)。近年來(lái)，許多學(xué)者通過(guò)建立不同類型的急、慢性缺血性視網(wǎng)膜病變的動(dòng)物模型，針對(duì)不同病變階段的多個(gè)機(jī)制環(huán)節(jié)做了大量研究，取得了一定的進(jìn)展。本文對(duì)近年來(lái)與RII相關(guān)動(dòng)物模型與發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)。

1 RII常見(jiàn)動(dòng)物模型

用于研究視網(wǎng)膜疾病的動(dòng)物主要包括大鼠、小鼠、獼猴、家兔、家豬、貓和犬等[3]。常見(jiàn)的視網(wǎng)膜缺血模型包括升高眼壓法、視神經(jīng)或血管結(jié)扎法、光動(dòng)力或藥物注射誘導(dǎo)法等。

1.1 升高眼壓法

升高眼壓法主要是通過(guò)輸液管將37℃的生理鹽水引入前房，增加輸液管的高度使眼內(nèi)壓提升至70～90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），維持時(shí)間一般為45～60 min，顯微鏡下可以觀察到虹膜變白和視網(wǎng)膜動(dòng)脈白化等現(xiàn)象[4]。這種方法多用于制作急性視網(wǎng)膜缺血或急性青光眼模型。也有采用前房注射聚苯乙烯珠誘導(dǎo)慢性高眼壓模型，在單次注射聚苯乙烯珠后，高眼壓至少能夠維持3 個(gè)月，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）發(fā)生漸進(jìn)性萎縮[5]。

1.2 視神經(jīng)結(jié)扎或鉗夾法

大鼠眼動(dòng)脈在視神經(jīng)鞘膜內(nèi)與視神經(jīng)伴行，采用視神經(jīng)結(jié)扎或鉗夾法等機(jī)械性損傷可有效阻斷視網(wǎng)膜血供。KONRAD K 等[6]持續(xù)結(jié)扎大鼠球后視神經(jīng)束60 min 后，觀察到視網(wǎng)膜血流中斷，視網(wǎng)膜電流圖顯示a、b 波振幅明顯降低，超微結(jié)構(gòu)觀察中可見(jiàn)細(xì)胞核固縮和殘留線粒體。JONAS JB 等[7]采用鉗夾球后視神經(jīng)束法制作恒河猴視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈（central artery retina，CRA）閉塞模型，鉗夾時(shí)間為97～300 min，通過(guò)眼底照相和熒光素眼底血管造影證實(shí)CRA閉塞成功。在中老年動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈高血壓的恒河猴中，CRA閉塞的持續(xù)時(shí)間與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的可見(jiàn)性降低和視盤蒼白程度之間具有相關(guān)性，CRA 閉塞的持續(xù)時(shí)間為240 min 或以上，神經(jīng)纖維層幾乎全部出現(xiàn)損傷和嚴(yán)重視神經(jīng)萎縮[8]。

1.3 血管結(jié)扎法

雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）或聯(lián)合雙側(cè)椎動(dòng)脈結(jié)扎，即2 或4 血管閉塞法，是研究視網(wǎng)膜缺血模型的常用方法[9]。BCCAO 誘導(dǎo)的低灌注性視網(wǎng)膜病變典型病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞活化增生[10]。有學(xué)者[11-12]通過(guò)建立BCCAO 模型，觀察到視網(wǎng)膜動(dòng)脈變細(xì)、靜脈擴(kuò)張等眼底表現(xiàn)，形態(tài)學(xué)研究顯示視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生明顯的病理性損害。局部血管結(jié)扎主要是將視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈、靜脈和視神經(jīng)束一起進(jìn)行結(jié)扎，或剪開(kāi)球后視神經(jīng)鞘膜，僅分離并鉗夾CRA，60 min后松開(kāi)，可以觀察到眼底視網(wǎng)膜血流中斷和再灌注現(xiàn)象[13]。

1.4 光動(dòng)力誘導(dǎo)法

此法通常采用注射誘導(dǎo)劑聯(lián)合激光制作眼底分支血管缺血模型，單純激光或單純誘導(dǎo)劑干預(yù)并不能成模。WANG RS 等[14]通過(guò)注射血卟啉衍生物2 h 后再給予氪紅色激光照射（波長(zhǎng)647 nm）誘導(dǎo)前部缺血性視神經(jīng)病變大鼠模型，病變?cè)缙诳梢?jiàn)視盤水腫，后期出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄。也有學(xué)者[15]采用注射赤蘚紅素B 染液加激光誘導(dǎo)制備后部缺血性視神經(jīng)病變模型。國(guó)內(nèi)有研究[16]采用光化學(xué)法誘導(dǎo)兔視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞模型，觀察到阻塞區(qū)域單位面積內(nèi)血液灌注量明顯下降。

1.5 藥物誘導(dǎo)法

常用誘導(dǎo)劑如血管內(nèi)皮素-1（endothefin，ET-1），由于其強(qiáng)大的血管收縮作用，會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血和氧化應(yīng)激，加重RGC 凋亡和視神經(jīng)軸突退行性損傷[17]。在大鼠眼球后植入ET-1 滲透式微型泵，通過(guò)熒光標(biāo)記法監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)了RGC 存活時(shí)間減少，伴有視神經(jīng)血流灌注量減少68%[18]。在兔視神經(jīng)周圍植入ET-1 微型泵后，觀察到2 周時(shí)視神經(jīng)微血管中氧蛋白的表達(dá)增加，8周后RGC 數(shù)量減少，內(nèi)、外核層隨著時(shí)間的推移變得越來(lái)越薄[19]。

2 RII主要發(fā)病機(jī)制

2.1 氧自由基損傷

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在的氧自由基和氧化物處于較低水平，維持細(xì)胞內(nèi)的多種生理活動(dòng)。然而組織缺血、缺氧時(shí)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，通過(guò)介導(dǎo)線粒體呼吸鏈、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase，NOS）等多種途徑產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[20]。NADPH 氧化酶的非吞噬細(xì)胞氧化酶（non-phagocytic cell oxidase，NOX）有許多亞型，其中，在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮、周細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的亞型主要包括NOX1、NOX2 和NOX4 等，其過(guò)度表達(dá)增加了ROS 的形成，誘發(fā)視網(wǎng)膜新生血管形成、毛細(xì)血管阻塞、血管滲漏和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞加速衰老等病變[21-22]。體外研究[23]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化使誘導(dǎo)型NOS 表達(dá)上調(diào)，釋放大量一氧化氮（nitric oxide，NO），過(guò)量NO 通過(guò)與超氧陰離子結(jié)合形成強(qiáng)氧化物，也會(huì)加重視網(wǎng)膜組織的氧化損傷。

2.2 線粒體功能障礙

線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡被認(rèn)為是RII導(dǎo)致線粒體功能障礙后的一個(gè)重要病理機(jī)制[24]。線粒體基質(zhì)特異性蛋白親環(huán)素D（cyclophilinD，CypD）是MPTP 的重要結(jié)構(gòu)組成部分，在MPTP 的開(kāi)放中起著關(guān)鍵作用，CypD 水平升高，導(dǎo)致局部缺血后線粒體膜電位異常和ROS 的過(guò)度生成[25]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，MTFA）是一種細(xì)胞核編碼的DNA 結(jié)合蛋白，在線粒體基因表達(dá)和線粒體DNA 維護(hù)中起著重要作用[26]。KIM SY 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，急性視網(wǎng)膜缺血可以誘發(fā)MTFA 蛋白和CypD 蛋白的過(guò)度表達(dá)，二者是介導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素。

2.3 興奮性氨基酸毒性作用

Na+的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于Müller 細(xì)胞內(nèi)谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（glutamate-aspartate transporter，GLAST），GLAST 的喪失會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞退行性損害[28]。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（excitatory amino acid transporter-1，EAAT-1）的功能紊亂往往是導(dǎo)致興奮性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素[29]。研究[28]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血、缺氧時(shí)激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架不穩(wěn)定，使細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP 酶減少，細(xì)胞能量生成障礙，Müller 細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增加，對(duì)細(xì)胞外谷氨酸的攝取減少，導(dǎo)致Ca2+通道異常開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，激活線粒體膜上半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）通路，細(xì)胞色素C 釋放增加，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。Ca2+超載導(dǎo)致的線粒體功能障礙引起氧自由基過(guò)量釋放，加重氧化損傷，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，直到死亡，被稱為興奮性神經(jīng)毒性作用[30]。

2.4 炎癥反應(yīng)

視網(wǎng)膜缺血時(shí)，組織中許多炎性因子和趨化因子被激活，如白細(xì)胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等含量增加，趨化蛋白如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘物（cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC）和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）等表達(dá)水平也明顯增加[31]。在眼缺血綜合征模型中發(fā)現(xiàn)，Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）介導(dǎo)的髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MYD88）信號(hào)通路被激活，并啟動(dòng)下游炎癥信號(hào)，激活核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）等，進(jìn)一步調(diào)控炎性因子的表達(dá)[32]。

2.5 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種在多種內(nèi)源性或外源性因素誘導(dǎo)下，相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制被激活，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生特異性程序化死亡的現(xiàn)象。缺血時(shí)ROS 過(guò)度釋放，對(duì)B 細(xì)胞原癌基因（B-cell lymphocyte/leukemia-2，Bcl-2）家族參與的神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用[33]。Bcl-2 為凋亡抑制蛋白，主要位于線粒體外膜，拮抗細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的促凋亡因子對(duì)線粒體的攻擊；Bcl-2關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）為凋亡促進(jìn)蛋白，與線粒體內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道結(jié)合，介導(dǎo)線粒體跨膜通道開(kāi)放，釋放細(xì)胞色素C 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一系列促凋亡因子，最后激活下游Caspase-3，完成蛋白質(zhì)降解。在視網(wǎng)膜缺血模型中觀察到，RGC層、內(nèi)核層和內(nèi)、外叢狀層可見(jiàn)Bax蛋白表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低現(xiàn)象[34]。GALINA D 等[4]將RGC 進(jìn)行氧糖剝奪離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中有引發(fā)壞死的受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）表達(dá)。MESTER L等[35]發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜低灌注可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性信號(hào)通路中的c-Jun 氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kainse，JNK）和MAPK 磷酸化，在介導(dǎo)缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性病變過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

3 小結(jié)

本文總結(jié)發(fā)現(xiàn)，RII與腦低灌注損傷關(guān)系密切，已成為神經(jīng)科和眼科等領(lǐng)域交叉疾病的研究熱點(diǎn)。誘導(dǎo)RII 動(dòng)物模型的方法以血管壓迫類或血管結(jié)扎類為主。氧自由基損傷是視網(wǎng)膜缺血發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并伴隨出現(xiàn)線粒體能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的結(jié)局。因此在本病的治療上，緩解視網(wǎng)膜缺血、缺氧狀態(tài)，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生與加重，是改善視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞功能，進(jìn)而提高患者視覺(jué)質(zhì)量的關(guān)鍵點(diǎn)。在今后的工作中，還需要更深入地展開(kāi)RII的防治研究。