盧禮平，范志梁，柴藝匯，潘 梅，何鑫菊，蒲 翔，李來(lái)來(lái)，牛建均，劉春艷，唐靖雯*，張麗艷*

1.貴州威門藥業(yè)股份有限公司技術(shù)專利部(貴州 貴陽(yáng) 550000)2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(貴州 貴陽(yáng) 550000)3.德江縣民族中醫(yī)院土家族民族醫(yī)藥研究所(貴州 德江 565200)

發(fā)熱是外源性熱源進(jìn)入機(jī)體后，作用于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞，使其產(chǎn)生內(nèi)生熱源，該物質(zhì)可作用于中樞介質(zhì)進(jìn)而作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，從而引起體溫升高，造成機(jī)體發(fā)熱[1]。

熱淋清顆粒是以貴州民族特色藥頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham.ex D.Don)為原料的單方制劑，具有清熱瀉火，利尿通淋的功效；可用于治療下焦?jié)駸崴碌臒崃?，癥見(jiàn)尿頻、尿急、尿痛；尿路感染、腎盂腎炎見(jiàn)上述證候者，臨床上常用于治療濕熱蘊(yùn)結(jié)下焦，機(jī)體氣化不利所致諸癥[2-5]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)熱淋清顆粒可對(duì)胃炎、腎炎、前列腺炎等多種炎癥均有一定的治療作用，而炎癥反應(yīng)多會(huì)引起機(jī)體不同程度的發(fā)熱。中醫(yī)認(rèn)為發(fā)熱是外邪入侵機(jī)體后，邪氣與正氣相爭(zhēng)的結(jié)果，最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，謂之“身熱”，多屬溫病范疇[6-7]。目前常用的發(fā)熱模型造模藥物主要為2，4-二硝基酚、干酵母等[8]。2，4-二硝基酚所致發(fā)熱模型致熱時(shí)間較短(3～5 h)，而頸背部皮下注射干酵母混懸液造模穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(20h)，是檢驗(yàn)中藥及其制劑解熱作用最常使用的模型。因此本實(shí)驗(yàn)采用頸背部皮下注射干酵母混懸液的方法誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型[9-10]，以熱淋清顆粒為研究對(duì)象，研究其對(duì)干酵母致熱大鼠模型的解熱效果，并探明其解熱作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。

1.1.2 藥物 熱淋清顆粒(貴州威門藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：210602)、對(duì)乙酰氨基酚(特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：32210507)、干酵母粉(安琪酵母股份有限公司，批號(hào)：D33F1)。

1.1.3 主要試劑與儀器 腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(Bioswamp，批號(hào)：RA20035/20211210)；AVP ELISA試劑盒(Bioswamp，批號(hào)：RA20797/20211210)；PGE2 ELISA試劑盒(Bioswamp，批號(hào)：RA20013/20211210)；cAMP ELISA試劑盒(Bioswamp，批號(hào)：RA20134/20211210)；甘油(Solarbio，批號(hào)：306D039);自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIOBASE，型號(hào)：EL10A)；電子溫度計(jì)(界面醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：PL-500)；離心機(jī)(THERMO，型號(hào)：ST 16R)、立式超低冰箱(海爾，型號(hào)：DW-86L386)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱淋清顆粒混懸液的制備 將適量熱淋清顆粒置于研缽中研磨，精準(zhǔn)稱取研磨后粉末24.0 g，于50 mL容量瓶定容備用(0.48 g/mL)；精準(zhǔn)稱取研磨后粉末12.0 g，于50 mL容量瓶定容備用(0.24 g/mL)；精準(zhǔn)稱取研磨后粉末6.0 g，于50 mL容量瓶定容備用(0.12 g/mL)。

1.2.2 分組、造模、給藥 SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d(實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：25±2 ℃，相對(duì)濕度50%±5%)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日每30 min測(cè)量1次體溫，共3次，取平均值作為基礎(chǔ)體溫。隨機(jī)將60只大鼠平均分為6組，即正常組、模型組、陽(yáng)性組和熱淋清顆粒高、中、低劑量組。除正常組皮下注射生理鹽水(5 mL/kg),其余各組均皮下注射15%干酵母(5 mL/kg)制作發(fā)熱模型。造模4 h后(此時(shí)每只鼠體溫均升高至少0.8 ℃)，對(duì)熱淋清顆粒高、中、低劑量組分別灌胃4.8、2.4、1.2 g/kg熱淋清顆粒，模型組和正常組均灌胃等體積生理鹽水。

1.3指標(biāo)檢測(cè)給藥后4 h記錄體溫；將各組大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，于3 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，吸取適量上清液置于EP管中，置于4 ℃冰箱保存待測(cè)；實(shí)驗(yàn)大鼠取血后，頸部脫臼處死，冰浴條件下迅速取出大鼠下丘腦，存放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書對(duì)大鼠血清進(jìn)行TNF-α、精氨酸加壓素(AVP)指標(biāo)檢測(cè)，對(duì)大鼠下丘腦進(jìn)行前列腺素E2(PGE2)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)指標(biāo)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1熱淋清顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠血清AVP、TNF-α水平的影響與正常組比較，模型組大鼠AVP、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，熱淋清顆粒高、中劑量組大鼠AVP水平顯著升高(P<0.01)、TNF-α水平顯著下降(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組亦可降低大鼠血清TNF-α水平，見(jiàn)表1。

表1 熱淋清顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠血清AVP、TNF-α水平的影響

2.2熱淋清顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量的影響與正常組比較，模型組大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，熱淋清顆粒高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組cAMP、PGE2含量顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 熱淋清顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量的影響

2.3熱淋清顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠體溫變化情況的影響各組大鼠基礎(chǔ)體溫?zé)o顯著差異(P>0.05)；干酵母致熱模型建立后，與正常組比較，模型組大鼠體溫顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，熱淋清顆粒高、中、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組干酵母致熱模型大鼠體溫?zé)o顯著差異(P>0.05)；使用熱淋清顆粒及陽(yáng)性對(duì)照藥物干預(yù)后，與正常組比較，模型組大鼠體溫顯著升高(P<0.01)，熱淋清顆粒高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均可顯著降低模型大鼠體溫(P<0.01)，熱淋清顆粒低劑量組亦可顯著降低模型大鼠體溫(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 熱淋清顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠體溫變化情況的影響

3 討論

頭花蓼是熱淋清顆粒的主要原料，為蓼科植物頭花蓼的全草，文獻(xiàn)記載其味苦辛，性溫平，清熱解毒治熱淋[11]。目前對(duì)熱淋清顆粒的研究主要集中于其對(duì)泌尿系統(tǒng)感染等，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究已證明熱淋清顆粒療效顯著并成為臨床治療泌尿系統(tǒng)感染的首選藥之一?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)胃炎、腎炎等多種炎癥也有一定的治療作用，而炎癥多會(huì)引起機(jī)體發(fā)熱的癥狀。中醫(yī)認(rèn)為，發(fā)熱是外邪入侵后、邪氣與正氣相爭(zhēng)的結(jié)果，多用清上焦蘊(yùn)熱藥物緩解機(jī)體發(fā)熱。治療下焦熱淋癥的中藥多具有“清上達(dá)下”的作用[12]，因此推測(cè)熱淋清顆粒具有清上焦蘊(yùn)熱的作用。2020年熱淋清顆粒已被貴州省中醫(yī)藥管理局納入《貴州省新冠肺炎中醫(yī)康復(fù)方案》中，因此本課題組擬觀察熱淋清顆粒的解熱作用探討其作用機(jī)理，為臨床提供更多選擇。

發(fā)熱是機(jī)體在外源性物質(zhì)刺激下產(chǎn)生內(nèi)生熱源，如：TNF-α導(dǎo)致中樞體溫調(diào)節(jié)介質(zhì)失衡。cAMP和PGE2均為體溫正調(diào)節(jié)介質(zhì)，AVP為體溫負(fù)調(diào)節(jié)介質(zhì)，當(dāng)體溫負(fù)調(diào)節(jié)介質(zhì)降低與/或體溫正調(diào)節(jié)介質(zhì)升高時(shí)，機(jī)體即出現(xiàn)發(fā)熱癥狀[13]。

TNF-α等促炎因子通過(guò)多種不同途徑富集于體溫調(diào)節(jié)中樞，提高機(jī)體體溫調(diào)控點(diǎn)，造成機(jī)體體溫異常升高，使機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)，是重要的內(nèi)生熱源[14]。TNF-α可作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，導(dǎo)致中樞體溫調(diào)節(jié)介質(zhì)失衡，其可促進(jìn)下丘腦產(chǎn)生PGE2。有研究發(fā)現(xiàn)[15]將TNF-α注射至大鼠靜脈可誘導(dǎo)發(fā)熱，并顯著增加大鼠下丘腦中PGE2水平[15]。PGE2是花生四烯酸代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已被公認(rèn)為與發(fā)熱關(guān)系最密切且相關(guān)研究最為豐富的體溫中樞正調(diào)節(jié)因子，其可刺激下丘腦內(nèi)溫度相關(guān)神經(jīng)元，改變突觸間放電頻率，且可與G蛋白偶聯(lián)，升高下丘腦中cAMP水平。cAMP被認(rèn)為是最接近于體溫調(diào)節(jié)中樞末端的正調(diào)節(jié)因子。微量cAMP注射入動(dòng)物腦內(nèi)便可造成發(fā)熱[16]。當(dāng)機(jī)體發(fā)熱時(shí)，PGE2和cAMP在下丘腦中含量將顯著升高。AVP是由下丘腦合成、分泌的激素類物質(zhì)，其可改變由體溫正調(diào)控因子造成的溫度神經(jīng)元突觸放電異常，現(xiàn)代研究證實(shí)[17]其可明顯抑制由內(nèi)生熱源引起的機(jī)體發(fā)熱，是體溫調(diào)節(jié)中不可或缺的負(fù)調(diào)節(jié)因子。

本組結(jié)果表明，熱淋清顆粒高、中劑量組大鼠體溫顯著低于模型組(P<0.01)，且具有解熱時(shí)間久，作用溫和的特點(diǎn)。與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)生熱源物質(zhì)血清TNF-α水平均較模型組顯著下降(P<0.01)，PGE2、cAMP均為下丘腦體溫正調(diào)節(jié)介質(zhì)，模型組大鼠下丘腦PGE2、cAMP水平顯著高于正常組(P<0.01)，熱淋清顆粒高、中、低劑量組均可顯著降低模型大鼠下丘腦PGE2、cAMP水平(P<0.01)。AVP為體溫負(fù)調(diào)節(jié)介質(zhì)，模型組大鼠血清AVP水平顯著高于正常組(P<0.01)，而熱淋清顆粒高、中劑量組大鼠血清AVP水平顯著高于模型組(P<0.01)，表明熱淋清顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)高體內(nèi)體溫負(fù)調(diào)控因子水平，從而發(fā)揮解熱作用。

綜上所述，推測(cè)熱淋清顆粒作用機(jī)制可能是抑制機(jī)體內(nèi)生熱源物質(zhì)和體溫正調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生、增加體溫負(fù)調(diào)控因子水平，從而發(fā)揮解熱作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探明熱淋清顆粒解熱機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，但對(duì)于其藥效物質(zhì)還需后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。