曾學(xué)梅，何新華，余海霞，黃 星，陸婷婷，張藝粒，朱嘉偉，羅 聰

芒果基因特征及表達模式分析

曾學(xué)梅，何新華*，余海霞，黃 星，陸婷婷，張藝粒，朱嘉偉，羅 聰**

廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530000

屬于Type I型MADS-box基因家族，調(diào)控擬南芥中央細胞及胚乳的發(fā)育。目前，在木本植物中鮮有研究報道。本研究從芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得并命名為基因。生物信息學(xué)分析表明：基因位于1號染色體上，ORF全長為897 bp，無內(nèi)含子，編碼299個氨基酸，理論等電點為4.95，蛋白質(zhì)分子量為73.19 kDa，氨基酸序列中含有1個MADS_SRF_like保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析表明：芒果MiAGL80與阿月渾子PvAGL80最為接近，且同源性最高，氨基酸相似性為64.29%。啟動子序列分析顯示：芒果基因的啟動子包含光響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及激素響應(yīng)元件等，其中光響應(yīng)元件相較其他元件數(shù)量較多，不僅包含光調(diào)節(jié)相關(guān)元件，還包含晝夜節(jié)律表達所必需的區(qū)域元件；激素響應(yīng)元件中包括赤霉素響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件和乙烯響應(yīng)元件；逆境響應(yīng)元件主要是干旱響應(yīng)元件?；虮磉_模式分析顯示：在芒果果實中，隨著芒果果實的逐漸發(fā)育，其在果肉中的表達水平持續(xù)下降，在花后100 d的果實與成熟果中的表達水平很低；在種胚發(fā)育過程中其表達水平先上升后下降，在花后100 d的胚和成熟胚中表達水平也很低；在種胚萌發(fā)發(fā)育期，其表達水平再次升高。在成花發(fā)育不同時期的組織器官中：主要在葉片中表達，其表達量先降低后逐漸升高，然后再降低，在花器官發(fā)育末期達到最大值；在花芽中的表達水平也顯著高于營養(yǎng)芽；但在莖中表達量極低，幾乎不表達。說明在芒果果實發(fā)育、種胚發(fā)育、種子萌發(fā)以及成花調(diào)控方面發(fā)揮作用。以上研究結(jié)果為深入研究基因的功能提供參考。

芒果；；基因特征；表達模式

MAD-box基因是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于植物和動物中，在植物的成花調(diào)控、花器官發(fā)育、芽休眠、果實發(fā)育、果實成熟以及逆境脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。（）屬于Type I型MADS box基因，DNA序列中無內(nèi)含子，在擬南芥中被分離鑒定出來，功能分析顯示其與中央細胞及胚乳的發(fā)育有關(guān)[3]。有進一步研究表明，突變體顯著降低擬南芥的種子數(shù)量，但和互補可以提高突變體的種子數(shù)量[4]，說明其與擬南芥的種子發(fā)育有關(guān)。在其他物種上，關(guān)于基因的報道還非常少。

芒果（L.）是重要的熱帶水果，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，享有“熱帶水果之王”的美稱。在生產(chǎn)上，我國的主栽芒果品種目前存在著無胚果率過高的現(xiàn)象，嚴重影響了芒果產(chǎn)量與品質(zhì)的提高。在前期轉(zhuǎn)錄組研究中，本課題組從‘四季蜜芒’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了1個基因，本研究通過生物信息學(xué)分析和表達模式研究，探討了與芒果果實發(fā)育、種胚發(fā)育、胚萌發(fā)和成花的關(guān)系，為進一步研究在芒果果實發(fā)育調(diào)控中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采集于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹標本園內(nèi)，采集樣品為成年‘四季蜜芒’營養(yǎng)生長期（2018年11月5日）、成花誘導(dǎo)期（2018年12月5日）、成花誘導(dǎo)末期（2019年1月4日）、花器官發(fā)育末期（2019年1月29日）、開花期（2019年3月6日）的成熟葉片、成熟莖段及頂芽/花（其中只有開花期為花形態(tài)），采樣時間為下午5：00—6：00；采集不同發(fā)育時期的‘四季蜜芒’果實樣品（胚及果肉，2021年11月16日）和不同萌發(fā)時間的胚。樣品采集后即刻于–80℃冰箱冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA的合成 用RNAperp Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取芒果RNA，后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于–40℃保存。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam在線軟件分析MiAGL80蛋白一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)；利用在線軟件GenBank Blast分析同源基因與其他植物基因核苷酸的同源性以及蛋白保守結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN 8.0和MEGA對MiAGL80及其他物種的氨基酸序列進行比對和聚類分析，并構(gòu)建進化樹；利用PLANTCARE和NEW PLACE軟件進行啟動子區(qū)域順式元件分析。

1.2.3基因的表達分析 根據(jù)芒果轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，設(shè)計熒光定量引物qMiAGL80u（GCTCTGTGGGA TCAATGGTT）、qMiAGL80d（AGCTGCATTTGGTCAGGATT）。以為內(nèi)參基因[5]：qActinu（CCGAGACATG AAGGAGAAGC）、qActind（GTGGTCTCATGGA TACGAGCA）。設(shè)置陰性對照，每個樣設(shè)置3個重復(fù)。熒光定量PCR儀器為ABI7500，擴增反應(yīng)體系及程序見試劑盒說明書SYBR Premix Dimer Eraser（TaKaRa）。采用2–ΔΔCT法計算相對表達水平[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiAGL80基因序列分析

本研究從芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了1個基因，位于1號染色體，ORF全長為897 bp，無內(nèi)含子，編碼299個氨基酸，理論等電點為4.95，蛋白質(zhì)分子量為73.19 kDa。通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索引擎分析其保守結(jié)構(gòu)域，顯示MiAGL80蛋白在2～85位點區(qū)域有1個MADS_SRF_like保守結(jié)構(gòu)域，即MADS家族所共有的典型結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 MiAGL80基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域

2.2 MiAGL80生物信息學(xué)分析

芒果MiAGL80與擬南芥（AtAGL80）、四季蜜芒（MiAGL80）、木薯（MeAGL80）、甜櫻桃（PaAGL80）和阿月渾子（PvAGL80）序列比對結(jié)果顯示，芒果MiAGL80與阿月渾子（PvAGL80）同源性最高，氨基酸相似性為64.29%（圖2）。芒果MiAGL80與擬南芥（）、蘿卜（）、木槿（）、泰洛帕木（）、甜櫻桃（）、裂葉櫟（）、木薯（）、可可（）、阿月渾子（）和四季蜜芒（）等進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，芒果MiAGL80在進化上也與阿月渾子PvAGL80較為接近（圖3），由此可以推測克隆所得基因?qū)儆贏GL80基因家族，其功能可能與類似。

圖2 MiAGL80同源蛋白氨基酸序列

圖3 MiAGL80蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.3 MiAGL80基因啟動子序列分析

利用Plant CARE和NEW PLACE在線軟件對‘四季蜜芒’基因約2000 bp的啟動子序列進行順式作用元件預(yù)測其元件的功能和數(shù)量。結(jié)果表明（表1），基因啟動子中存在激素響應(yīng)、光響應(yīng)和逆境響應(yīng)等元件，因此推測出基因可能受到激素、光照以及逆境等調(diào)控。

表1 MiAGL80基因在‘四季蜜芒’中啟動子主要順式作用元件的比較分析

2.4 MiAGL80基因表達模式分析

為了研究基因在不同種子發(fā)育時期的表達模式，以‘四季蜜芒’種子及果肉為材料，對其進行實時熒光定量分析。在果實發(fā)育時期，隨著結(jié)實天數(shù)的增加，果實逐漸增大，在果肉中的表達逐漸下降；在花后100 d以及后熟果（花后100 d采果并放置10 d后的果實）內(nèi)表達量很低（圖4A）。在種子發(fā)育過程中，的表達量在花后10 d逐漸升高，到花后40 d到達頂峰后下降，花后100 d以及后熟果的胚與果實類似，表達水平很低（圖4B）。而在種胚萌發(fā)過程中，在種胚萌發(fā)后5 d的表達量很低，而后上升，在種胚萌發(fā)后10 d及15 d的表達量都處在較高水平（圖4C）。

不同小寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

為了進一步研究基因在不同組織及不同成花時期的表達模式，以‘四季蜜芒’為材料，對其進行實時熒光定量分析。如圖5所示，在‘四季蜜芒’的各個器官中的表達差異較大，但從總體上來看，都在葉片中表達量較高。其中，在‘四季蜜芒’的莖中，的表達量極低，幾乎不表達，在芽或花中的表達量也很低，而在葉片中，的表達量先降低后逐漸升高，然后再降低，在花器官發(fā)育末期，表達出現(xiàn)最高峰。

不同小寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

已有諸多研究結(jié)果支持MADS-box基因家族在植物營養(yǎng)生長、成花調(diào)控、花器官發(fā)育、果實和種子發(fā)育等生長發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要作用[7-8]，MADS-box基因家族分為Type I型和TypeⅡ型，與TypeⅡ型基因不同，Type I型基因通常無內(nèi)含子或只有1個內(nèi)含子，有一個MADS_SRF_like保守結(jié)構(gòu)域，且無K域[9]。一直以來對Type I型基因研究較少，目前發(fā)現(xiàn)Type I型基因與早期種子、胚胎和雌配子體發(fā)育過程相關(guān)，并且參與胚及胚乳發(fā)育[10-11]，Type I型基因包括、、()、、和等基因[3, 12-14]。其中對種子的發(fā)育至關(guān)重要，它調(diào)控中心細胞發(fā)育和胚乳發(fā)育。研究表明，F(xiàn)IS-PRC2復(fù)合體在Type I型基因調(diào)控胚乳早期發(fā)育過程中發(fā)揮著雙重作用[15]，與形成的二聚體抑制附屬細胞特異性基因的表達，以特異性表達中心細胞[4, 16-17]，但其調(diào)控過程仍不清楚，且一直以來對的研究鮮有報道。

啟動子決定了基因表達過程的開始及表達條件，是研究基因表達調(diào)控的前提和基礎(chǔ)，有利于全面揭示基因的功能[18-19]，它與植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫等方面密切相關(guān)[20]。對基因的2000 bp啟動子進行分析表明，其啟動子序列中含眾多順式元件，其中最多的是光響應(yīng)和激素響應(yīng)元件，也存在逆境響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點等。因此，可能參與植物光響應(yīng)、多種脅迫應(yīng)答以及激素誘導(dǎo)等過程。

本實驗室在前期已完成轉(zhuǎn)錄組測序，因此獲得了‘四季蜜芒’基因的CDS，對其進行氨基酸序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)分析和其在‘四季蜜芒’中的表達模式分析。結(jié)果表明：MiAGL80有一個MADS保守結(jié)構(gòu)域，與前人的研究結(jié)果一致[3]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明芒果MiAGL80與漆樹科的阿月渾子PvAGL80同源性最高，進化關(guān)系上親緣關(guān)系更近。通過分析基因的表達模式能為功能基因的研究提供有用的信息。在擬南芥中，在中心細胞和胚乳中表達[17]，在葉、花莖、花藥、幼花及根中也有表達[3]，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在‘四季蜜芒’的種子、果肉、葉、莖、花或芽中均有表達，主要在種胚發(fā)育時期的前中期的胚及果肉中表達、種胚發(fā)芽后期表達。以上結(jié)果表明可能參與‘四季蜜芒’種胚及果肉的發(fā)育，并調(diào)控種胚萌發(fā)。在不同成花發(fā)育時期的樣品中表達模式分析顯示，在花器官發(fā)育期的葉片、芽和花中表達量較高，也暗示該基因可能與芒果成花或花器官發(fā)育有關(guān)。本研究結(jié)果為進一步解析該基因在芒果生長發(fā)育進程中的功能提供實驗依據(jù)。

[1] 胡麗芳, 金志強, 徐碧玉. MADS-box基因在果實發(fā)育、成熟過程中的作用[J]. 分子植物育種, 2005, 3(3): 415-420.

HU L F, JIN Z Q, XU B Y. Effect of MADS-box genes to fruit development and ripeness[J]. Molecular Plant Breeding, 2005, 3(3): 415-420. (in Chinese)

[2] CASTELAN-MUNOZ N, HERRERA J, CAJERO- SANCHEZ W, ARRIZUBIETA M, TREJO C, GARCIA- PONCE B, SANCHEZ M P, ALVAREZ-BUYLLA E R, GARAY-ARROYO A. MADS-Box genes are key components of genetic regulatory networks involved in abiotic stress and plastic developmental responses in plants[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10: 853.

[3] PORTEREIKO M F, LLOYD A, STEFFEN J G, PUNWANI J A, OTSUGA D, DREWS G N.is required for central cell and endosperm development in[J]. Plant Cell, 2006, 18: 1862-1872.

[4] ZHANG M X, ZHU S S, XU Y C, GUO Y L, LI H J. Transcriptional repression specifies the central cell for double fertilization[J]. Plant Biology, 2020, 117(11): 6231-6236.

[5] LUO C, HE X H, CHEN H, HU Y, OU S J. Molecular cloning and expression analysis of four actin genes () from mango[J]. Biologia Plantarum, 2013, 57: 238-244.

[6] SCHMITTGEN T D, LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101-1108.

[7] BECKER A, THEIβEN G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2003, 29(3): 464-489.

[8] FERRARIO S, IMMINK R G H, ANGENENT G C. Conservation and diversity in flower land[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2004, 7: 84-91.

[9] BODT S D, RAES J, FLORQUIN K, ROMBAUTS S, ROUZE P, THEIβEN G, PEER Y V. Genome-wide structural annotation and evolutionary analysis of the type Ι MADS-box gene in plants[J]. Journal of Molecular Evolution, 2003, 56: 573-586.

[10] 黃 方, 遲英俊, 喻德躍. 植物MADS-box基因研究進展[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 35(5): 9-18.

HUANG F, CHI Y J, YU D Y. Research advances of MADS-box genes in plants[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2012, 35(5): 9-18. (in Chinese)

[11] MASIERO S, COLOMBO L, GRINI P E, KATER S M M. The emerging importance of type I MADS box transcription factors for plant reproduction[J]. Plant Cell, 2011, 23(3): 865-872.

[12] COLOMBO M, MASIERO S, VANZULLI S, LARDELLI P, COLOMBO L., a type I MADS-box gene that controls female gametophyte and embryo development in[J]. The Plant Journal, 2008, 54: 1037-1048.

[13] KOHLER C, HENNING L, SPILLANE C, PIEN S, GRUISSEM W, GROSSNIKLAUS U. The-group protein MEDEA regulates seed development by controlling expression of the MADS-box gene[J]. Genes & Development, 2003, 17: 1540-1553.

[14] SHIRZADI R, ANDERSEN E D, BJERKAN K N, GLOECKLE B M, HEESE M, UNGRU A, WINGE P, KONCZ C, AALEN R B, SCHNITTGER A. Genome-wide transcript profiling of endosperm without paternal contribution identifies parent-of-origin-dependent regulation of[J]. Public Library of Science Genetics, 2011, 7(2): e1001303.

[15] ZHANG S S, WANG D F, ZHANG H J, SKAGGS M I, LLOYD A. FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED- polycomb repressive complex 2 plays a dual role in regulating type I MADS-Box genes in early endosperm development[J]. Plant Physiology, 2018, 177: 285-299.

[16] STEFFEN J G, KANG I H, PORTEREIKO M F, LLOYD A, DREWS G N.interacts withand is required for central cell development in[J]. Plant Physiology, 2008, 148: 259-268.

[17] BEMER M, WOLTERS-ARTS M, GROSSNIKLAUS U, ANGENENT G C. The MADS domain protein diana acts together withto specify the central cell inovules[J]. The Plant Cell, 2008, 20: 2088-2101.

[18] 王秋巖, 何淑雅, 馬 云, 李俐娟, 李斌元. 啟動子分析方法的研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2015, 14: 51.

WANG Q Y, HE S Y, MA Y, LI L J, LI B Y. Advances in analytical methods of promoter[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2015, 14: 51. (in Chinese)

[19] 李廣平, 張長青, 章 鎮(zhèn), 曹福亮. 中國李啟動子的克隆及調(diào)控元件分析[J]. 園藝學(xué)報, 2009, 36(10): 1425-1430.

LI G P, ZHANG C Q, ZHANG Z, CAO F L. Cloning ofpromoter fromand the computational identification of its regulatory element[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2009, 36(10): 1425-1430. (in Chinese)

[20] 李靜歡, 馬維波, 張明星, 李曉華. 苦養(yǎng)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達分析[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2021, 49(3): 84-94.

LI J H, MA W B, ZHANG M X, LI X H. Gene cloning and expression analysis of transcription factorin[J]. Journal of Shanxi Normal University (Natural Science Edition), 2021, 49(3): 84-94. (in Chinese)

Characterization and Expression Analysis of aGene in Mango

ZENG Xuemei, HE Xinhua*, YU Haixia, HUANG Xing, LU Tingting, ZHANG Yili, ZHU Jiawei, LUO Cong**

College of Agriculture, Guangxi University / State Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Agricultural Biological Resources, Nanning, Guangxi 530000, China

/belong to the Type I class of the MADS-box gene family and regulate the development of central cells and endosperm inhas been rarely reported in woody plants at present. In this study, angene was obtained from mango transcriptome data. Bioinformatics analysis showed thatwas located on chromosome 1, the ORF length ofwas 897 bp, and there was no intron in the DNA sequence.encoded 299 amino acids with an isoelectric point and molecular weights of 4.95 and 73.19 kDa,respectively. The amino acid sequence contained a conserved MADS_SRF_like domain. Phylogenetic tree analysis showed that MiAGL80 was closest to PvAGL80 and had the highest homology, with an amino acid similarity of 64.29%. Promoter sequence analysis revealed that the mangogene promoter contained light response elements, adversity response elements, transcription factor-binding sites and hormone response elements. There were more light response components than other components, which contained not only light regulating elements but also circadian rhythm elements. Hormone response elements included gibberellin response elements, auxin response elements and ethylene response elements, and the stress response elements were mainly drought response elements. The expression ofdecreased in the pulp with fruit development and increased first and then decreased during the development of the embryo, but the expression level was very low in the pulp and embryo at 100 days fruit and mature fruit. At the stage of embryo germination, the expression level ofincreased significantly with seed germination.was mainly expressed in leaves, and the expression level decreased at flowering induction period, then significantly upregulated during floral organ development, and last decreased again during the flowering period.was not expressed in buds during the vegetative period but was also upregulated in floral buds and flowers. However, the expression level was extremely low in the stem. The results suggest thatmay play an important role in mango fruit development, seed embryo development and germination, as well as in flower regulation. The results provide a reference for further study of the function of thegene.

mango;; gene characterization; expression pattern

S667.7

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.008

2022-01-19；

2022-04-14

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西芒果創(chuàng)新團隊栽培與病蟲害防治崗位項目（No. nycytxgxcxtd-2021-06-02）；廣西科技先鋒隊‘強農(nóng)富民’‘六個一’專項行動項目（No. 202204）。

曾學(xué)梅（1995—），女，碩士研究生，研究方向：果樹遺傳與分子育種；*同等貢獻作者：何新華（1966—），男，教授，研究方向：園藝植物生物技術(shù)與分子生物學(xué)。**通信作者（Corresponding author）：羅 聰（LUO Cong），E-mail：22003luocong@163.com。