王 鑫，邵遠志，湯 月，李 雯*

荔枝P型ATP酶基因家族鑒定及其在采后貯藏過程中響應拮抗菌N-1的表達模式分析

王 鑫1，邵遠志2，湯 月2，李 雯1*

1. 海南大學園藝學院海南省熱帶園藝作物品質調控重點實驗室，海南海口 570228；2. 海南大學生命科學學院，海南?？?570228

P型ATP酶是植物體內一種重要的膜轉運蛋白，在果實能量代謝和酸代謝中發(fā)揮重要作用，并廣泛參與植物離子運輸、抗逆、細胞信號轉導等各項生命活動，然而在荔枝或其他無患子科植物中尚未對P型ATP酶基因家族進行全面分析，本研究基于‘妃子笑’荔枝轉錄組數據，通過對這些基因進行生理生化分析、生物信息學分析和表達分析，共鑒定了28個P型ATP酶基因家族成員基因，探討P型ATP酶在荔枝采后貯藏過程中的潛在功能。結構和系統發(fā)育分析表明該基因可以分為5個亞家族，同一亞族的基因在基因結構和motif基序方面具有很大的相似性，其蛋白二級結構主要以α-螺旋為主，亞細胞定位預測分析發(fā)現LcPAs多定位于線粒體（21/28）。通過轉錄組分析，在采后貯藏期間，荔枝P型ATP酶家族基因中上調表達的基因明顯高于下調表達基因，暗示其可能在荔枝采后品質劣變過程中發(fā)揮著積極的抵御作用。使用拮抗菌N-1處理荔枝可以有效抑制其果實采后褐變和病害的發(fā)生，結合RT-qPCR結果，發(fā)現拮抗菌N-1處理能誘導和在整個貯藏過程中的上調表達，并維持了較高的ATP酶活性，進一步說明P型ATP酶家族基因在抑制荔枝病變過程中發(fā)揮著重要作用。本研究為了解荔枝P型ATP酶基因家族基因的進化和功能分析提供了參考，為深入了解拮抗菌N-1保鮮機理的分子調控機理提供新的證據。

荔枝；P型ATP酶基因家族；轉錄組；拮抗菌N-1

P型ATP酶是在植物整個生命過程中都發(fā)揮重要作用的膜轉運蛋白，參與廣泛的細胞基本代謝過程。迄今為止，在闡明P型ATP酶的結構、功能和調控特性方面都取得了極大的進展。植物P型ATP酶在結構上有一個亞基，8～12個跨膜（TM）片段，N端和C端暴露于細胞質，以及一個大型的中央細胞質的結構域，其上包含磷酸化和ATP結合位點，P型ATP酶最重要的一個特征是形成一個磷酸化的中間產物，因此被命名為P型，P型泵的復雜性也反映了P型ATP酶的多樣性和這些轉運體具有離子特異性[1]。目前已經從擬南芥全基因組序列中鑒定出45個編碼P型ATP酶的基因[2]，從向日葵基因組中鑒定出13個P型H+-ATP酶基因家族成員[3]，從陸地棉中鑒定出98個P型ATP酶家族基因[4]，從大豆基因組中鑒定了105個P型ATP酶基因[5]，從水稻中鑒定出43個P型ATP酶基因家族成員等，通過蛋白序列和系統發(fā)育比較，一個共同的被子植物祖先擁有至少23個P型ATP酶基因家族成員的集合[6]，說明它普遍存在于各種生物中，并廣泛參與植物離子運輸、抗逆性、細胞信號轉導等各項生命活動。近年來大量研究表明P型ATP酶和植物的酸代謝密切相關，從矮牽牛的遺傳分析中發(fā)現2種P型ATP酶PH1和PH5，這2種酶通過改變花瓣細胞液泡酸度從而改變花的顏色[7]，通過進一步研究發(fā)現，這2個基因在柑橘類水果的酸調控中發(fā)揮重要作用[8]。此外，P型ATP酶還參與細胞內PH穩(wěn)態(tài)的調控，為植物多胺（plant polyamines）PA前體向液泡運輸提供動力[9]，并在大豆鹽、干旱、寒冷、磷酸鹽饑餓等脅迫下被顯著誘導或抑制[5]，在水稻和擬南芥的非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[10]。

生防治作為一種安全健康的應對果蔬保鮮問題的新途徑，是最有希望替代傳統化學保鮮劑的一種保鮮方法，其中拮抗菌生物防治具有安全、綠色和環(huán)保的優(yōu)點，成為荔枝采后保鮮技術研究的熱點[11-12]。然而拮抗菌作為保鮮劑的作用機理十分復雜，目前可以確定的是果實能量代謝在其中起到了十分重要的作用。提高果實的能荷水平可以減緩桃[13]、梨[14]和枇杷[15]等果實病害的發(fā)生，陳夢茵[16]研究發(fā)現外源ATP處理能提高Ca2+-ATPase和H+-ATPase酶活性，維持果實較高的ATP含量，保護細胞膜結構，維持細胞的抗氧化系統，使龍眼果實免受病菌帶來的傷害。因此，研究P型ATP酶基因家族，篩選出該家族中可能響應拮抗菌作用信號的關鍵基因，可能有助于探明拮抗菌保鮮劑的作用機理，提高采后荔枝的果實品質。

1 材料與方法

1.1 材料

供試荔枝品種為‘妃子笑’，采摘于海南省澄邁縣荔枝種植園。剔除病果、機械損傷果，留0.5 cm左右果柄、大小均一的荔枝果實為材料。將挑選后的荔枝均勻分為2組，一組于108CFU/mL拮抗菌N-1懸液中浸泡20 min，另一組用清水浸泡相同時間用作對照，隨后晾干。每30個果實裝一框，用80 cm×120 cm的保鮮膜輕裹，放置于25℃的智能人工氣候（RH：85%～90%）中貯藏，每2 d取樣一次。取30個果實用于觀察，并測定好果率和荔枝果皮的ATP酶活性[16]，果皮使用液氮研磨，并使用天根RNA提取試劑盒（多糖多酚植物總RNA提取試劑盒DP441）提取荔枝果實總RNA，使用逆轉錄試劑盒（MonScriptTM RTIII All-in-One Mix With dsDNase）將RNA逆轉錄成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

暹羅拮抗菌N-1從自然感病的熱帶水果中分離，隨后保存在–80℃環(huán)境中，該拮抗菌在之前的實驗中已經得到鑒定[17]。在使用之前，N-1拮抗菌在28℃條件下于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，隨后轉移到NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，最后稀釋拮抗菌懸浮液濃度為108CFU/mL，備用。

1.2 方法

1.2.1 荔枝P型ATP酶家族基因的收集與鑒定 利用Pfam數據庫（http://pfam.xfam.org/）獲取P型ATP酶家族基因的結構域（PF00690、PF00122、PF13246）的比對文件構建隱馬爾可夫模型（HMM）文件。然后，利用TB-tools軟件對荔枝蛋白數據庫進行HMM搜索。此外，所有P型ATP酶蛋白序列均通過SMART（http://smart.emblhe- idelberg.de/）和NCBI（http://www.ncbi.nlm.n-ih. gov/cdd/）手動篩選結構域，并去除缺乏P型ATP酶結構域的蛋白序列[18]。

1.2.2 系統進化樹分析 利用MEGA-X軟件對荔枝、蘋果、獼猴桃、擬南芥、巴旦木、辣椒和蒺藜苜蓿共7個不同種屬物種的P型ATP酶基因家族全長蛋白序列進行比對，對比結果在Jalview軟件中進行美化分析，再使用MEGA-X軟件繪制進化樹，并通過FigTree軟件進行美化[19]。

1.2.3 保守基序和理化性質分析 利用MEME （http://memesuite.org/t-ools/-meme）網站對荔枝P型ATP酶家族基因進行motif分析，共設置15個motif，其他參數為默認設置，隨后利用ExPAsy（http://web.expasy.org/com-pute_pi/）在線軟件預測P型ATP酶基因家族成員蛋白理化性質信息，包括氨基酸數、分子量、等電點、總平均疏水指數；通過Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/-plant-multi/）在線軟件預測該基因家族蛋白的亞細胞定位，并利用GOV IV（http://npsa prabi.-ibcp.fr）在線軟件預測蛋白二級結構[20]。

1.2.4 基于轉錄組的荔枝P型ATP酶家族基因表達分析 使用荔枝轉錄組（FPKM）值表示在各P型ATP酶家族基因的表達量，并用TBtools軟件繪制熱圖和維恩圖顯示該家族基因在荔枝貯藏過程中的表達水平。其中熱圖依據轉錄組數據FPKM值作圖，以分析荔枝貯藏前期（0、2d）和后期（6、8d）基因表達差異；維恩圖中差異基因篩選均以0 d為作為參照，以轉錄組數據-value和log2(FC)值為依據篩選差異基因。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 根據荔枝P型ATP酶家族基因的ORF序列，在網站（https:// primer3.ut.ee/）上設計引物序列，并在DNAMAN軟件上驗證引物的可靠性，設計好的引物交由中美泰和生物技術有限公司合成。使用Mona公司試劑盒（MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix）進行RT-qPCR擴增，荔枝P型ATP酶家族基因的相對表達水平采用2–DDCT法進行標準化分析[21]，并用GraphPad Prism 8軟件構建基因表達柱狀圖。

1.3 數據處理

數據采用SAS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 對荔枝P型ATP酶基因家族的鑒定

通過對荔枝轉錄組數據進行篩選，并結合在線工具SMART（http://smart.emb-lheidelberg.de/）和NCBI（http://www.ncb-i.nlm.nih.gov/cdd/）的結構域分析，共鑒定出28個P型ATP酶基因家族成員，并對所有的家族成員進行系統編號，將其命名為～。

荔枝28個P型ATP酶基因家族成員的氨基酸長度范圍在203（LcPA28）～1061（LcPA25）之間不等，相對分子質量范圍為50 926.22～ 259 788.49 Da，等電點范圍為4.75～5.14，所有蛋白均為疏水性蛋白，脂肪系數范圍為17.29～ 29.66，α-螺旋占比最大。亞細胞定位預測發(fā)現荔枝大多數P型ATP酶家族基因定位于線粒體（21/28），其次定位于細胞膜（5/28）、葉綠體（LcPA15）和細胞質（LcPA22）中（表1）。

2.2 系統進化樹分析

通過聚類分析，將荔枝中28個LcPA蛋白分成5個亞組，Group Ⅱ、Group Ⅲ和Group Ⅴ均有3個成員，分別為、和，、和，、和，Group Ⅳ僅有1個成員，其余18個成員均屬于Group I（圖1）。

2.3 荔枝P型ATP酶基因家族結構分析

利用MEME分析了荔枝P型ATP酶基因家族蛋白序列的15個保守motifs（圖2），這些基序的氨基酸組成如表2所示。本研究發(fā)現，所有LcPA蛋白均含有motif 2，表明其在荔枝P型ATP酶基因家族中高度保守，此外，高度保守的motif 4同樣存在于除外的所有LcPA蛋白中。在所有15個motif基序中，值從高到低排在前6的依次是motif 1、motif 4、motif 5、motif 7、motif 6、motif 2，均位于N末端結構域。

表1 荔枝P型ATP酶基因家族成員信息

圖1 P型ATP酶基因家族系統進化樹分析

2.4 荔枝P型ATP酶家族基因采后貯藏過程中的表達分析

根據荔枝P型ATP酶家族基因在荔枝采后貯藏過程中的表達水平繪制成熱圖（圖3A）和維恩圖（圖3B）。結果表明，在整個貯藏過程中出現明顯上調或下調表達的基因占到64.3%，且貯藏后期差異表達的基因數量明顯高于前期，上調表達基因的數量顯著高于下調表達基因。上調表達基因的大量富集暗示著該基因家族基因可能在‘妃子笑’荔枝品質劣變過程中起到積極的抵御作用。

圖2 荔枝P型ATP酶基因家族motif分布

表2 荔枝P型ATP酶基因家族結構域序列標識

圖3 荔枝P型ATP酶基因家族的表達分析

2.5 拮抗菌N-1處理下果實外觀，好果率和ATP酶活性變化

隨著貯藏時間的增加，果實的好果率呈現明顯的下降趨勢，但在整個貯藏過程中，拮抗菌處理后的荔枝果實的好果率始終高于對照果實（圖4A，圖4B），從圖4A中可以看出，處理組荔枝果實的外觀，褐變及病變情況均好于對照組，說明拮抗菌N-1處理可以有效的抑制荔枝果實的褐變和病變。結合圖4C可知，拮抗菌處理的荔枝果實ATP酶活性在整個貯藏過程中顯著高于對照果實，說明拮抗菌可能通過提高ATP酶活性維持荔枝的高能荷狀態(tài)，增強荔枝的抗病性，減少荔枝營養(yǎng)物質的損失，最終達到延緩荔枝果實衰老腐敗的目的。

2.6 部分LcPA家族基因在拮抗菌N-1處理下的表達

從LcPA基因家族在采后貯藏過程中的表達分析中初步篩選出在‘妃子笑’荔枝貯藏過程中可能起到關鍵作用的家族基因，并對這些基因在拮抗菌N-1處理后的表達情況進行實時熒光定量PCR分析（圖5）。結果表明，拮抗菌N-1顯著誘導了基因和在整個貯藏過程中的上調表達，誘導基因、在荔枝貯藏第2天上調表達，并誘導基因、和在貯藏后期的上調表達，總體而言，拮抗菌N-1處理能誘導荔枝P型ATP酶基因家族基因的上調表達，這與ATP酶活性的變化一致。以上結果說明，荔枝LcPA家族基因在拮抗菌N-1抑制荔枝病變的過程中發(fā)揮著積極的作用，且響應外源刺激信號的時期和作用也有所不同。

圖4 拮抗菌N-1處理下果實好果率和ATP酶活性變化

圖5 荔枝P型ATP酶基因家族成員在拮抗菌處理下的表達

3 討論

3.1 荔枝P型ATP酶家族基因的鑒定與結構分析

采后果實是一個鮮活的有機體，時刻進行著各種代謝活動，P型ATP酶基因家族在果實的能量代謝、酸代謝、脅迫信號轉導、逆境響應等過程中發(fā)揮著重要的作用，目前已在蘋果[22]、柑橘[23-24]和梨[25]等多個物種中得到鑒定和研究。在本研究中，基于‘妃子笑’荔枝的轉錄組數據，共鑒定出28個荔枝P型ATP酶家族家族基因，并劃分為5個亞族，說明該家族在進化上可能存在5個分支，這在擬南芥P型ATP酶基因家族的鑒定上也得到了驗證[1]，這28個家族基因對應蛋白的等電點、總平均疏水指數、α-螺旋和脂肪系數在荔枝中高度一致，表明該家族成員在進化上比較保守，在motif的分布模式中，值高的motif基序基本分布于N-末端結構域，說明N-末端結構域比C-末端結構域更加保守。荔枝P型ATP酶基因家族的亞細胞定位預測大多位于線粒體，而線粒體能夠參與植物細胞內的諸多過程，如呼吸作用、產熱、抗逆機制、程序性細胞死亡和基因組進化等[26]，另外還有少量基因定位于葉綠體、細胞膜和細胞質中，說明該基因家族不僅在能量代謝過程中發(fā)揮重要作用，還在植物的各種生理活動中發(fā)揮作用，也說明了該基因家族功能的多樣性。

3.2 P型ATP酶家族基因在采后荔枝貯藏保鮮過程中發(fā)揮重要作用

ATP酶作為能量代謝的關鍵酶，貫穿于細胞的整個生命過程。采后果實由于脫離了母體，切斷了能量供應，其貯藏的能量又被不斷消耗，已有諸多研究證實，果實的能量虧損越嚴重，品質劣變程度越嚴重，其衰老和死亡的速度和進程越快[27]。高兆銀等[28]研究發(fā)現外源ATP處理可提高荔枝貯藏前期ATP合成酶基因表達量，保持荔枝果實的能量供應，顯著延緩荔枝果實的成熟衰老，這與本研究中拮抗菌處理誘導基因、和在荔枝貯藏第2天上調表達的結果相似，說明這些基因可能是最先響應拮抗菌處理觸發(fā)的信號。基因和則在整個貯藏過程中均被拮抗菌顯著誘導高表達，這些基因均定位于線粒體，研究表明，線粒體ATP合成酶是細胞功能的關鍵樞紐，控制著ATP的產生和細胞信號傳導，它受ATP酶抑制因子1（IF1）的調節(jié)，從而控制線粒體功能和線粒體活性氧的產生[29]，這在生理水平上也得到了驗證，解偶連劑DNP可加劇活性氧的積累，降低能荷水平從而加速草莓衰老[30]。在拮抗菌的誘導下，荔枝線粒體ATP酶基因上調表達，荔枝ATP酶活性升高，其保護機制可能也是通過抑制線粒體活性氧的產生，進而保護細胞膜結構，最終抑制了荔枝果實品質劣變，而基因基因和可能是維持荔枝高能荷狀態(tài)、抑制荔枝果實品質劣變的關鍵基因。ATP除了作為能量貨幣的功能外，還起著胞外信號分子的作用，當果實ATP含量過低時，會產生反饋調節(jié)[31]，基因、和在荔枝貯藏后期的上調表達說明其可能是ATP反饋調節(jié)的響應基因。本研究表明以上幾個基因在荔枝采后貯藏保鮮過程中發(fā)揮著重要作用，可作為后續(xù)的研究重點，進行基因功能的驗證。

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Identification of P-type ATPase Gene Family and Analysis of Expression Pattern in Response to Antagonistic N-1 During Postharvest Storage in Litchi

WANG Xin1, SHAO Yuanzhi2, TANG Yue2, LI Wen1*

1. Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Crops of Hainan Province, School of Horticulture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. School of Life Sciences, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

P-type ATPase is an important membrane transporter in plants. It plays a significant role in plant energy metabolism and acid metabolism. In addition, the enzyme is widely involved in plant ion transport, stress resistance, cell signal transduction and other life activities. However, p-type ATPase gene family has not been comprehensively analyzed in litchi or other sapindaceae plants. In this study, based on the transcriptome data of ‘Feizixiao’ litchi, 28 p-type ATPase genes were identified through physiological and biochemical analysis, bioinformatics analysis and expression analysis, to explore the potential function of P-type ATPase during postharvest storage of litchi. The structure and phylogenetic analysis showed that the gene could be divided into 5 subfamilies, the genes in the same subfamily had similar gene structure and motifs. The secondary structure of protein was mainly consisted of α -helix, and the N-terminal domain of LcPAs was more conserved than the C-terminal domain. Subcellular localization prediction analysis showed that LcPAs were mostly located in mitochondria (21/28). According to transcriptome analysis, the up-regulated genes of P type ATPase family genes in litchi were significantly higher than the down-regulated genes during postharst storage, which suggesting that they may play a positive role in the resistance of quality deterioration of litchi after harvest. As a safe and healthy preservation technology, the mechanism of antagonistic biological control is very complex. Results showed that the antagonistic N-1 treatment could effectively inhibit the browning and disease occurrence of litchi fruits after harvest. Combined with RT-qPCR results, it was found that antagonistic N-1 treatment could induce up-regulated expression of,,andduring the whole storage process, which further indicating that P-type ATPase family genes would play an important role in the antagonistic N-1 inhibition of litchi lesions. This study would provide a reference for understanding the evolution and biological function analysis of p-type ATPase gene family in litchi, it also provide new evidence for further understanding the molecular regulation mechanism of antagonistic N-1 preservation mechanism.

litchi; p-type ATPase gene family; transcriptome; antagonist N-1

S667.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.021

2022-02-25；

2022-04-04

海南省自然科學基金創(chuàng)新研究團隊項目（No. 320CXTD430）；海南省研究生創(chuàng)新科研課題（No. Qhys2021-244）。

王 鑫（1994—），男，碩士研究生，研究方向：荔枝采后貯藏保鮮。*通信作者(Corresponding author)：李 雯（LI Wen），E-mail：liwen9-210@163.com。