王彩霞，黃 振，李慧雪，周宇明，段真珍，暴怡雪，張木清*，姚 偉,3**

甘蔗鐮孢菌基因的克隆及表達(dá)模式分析

王彩霞1,2，黃 振1,3*，李慧雪1,2，周宇明1,2，段真珍1,3，暴怡雪1,3，張木清1,3**，姚 偉1,2,3**

1. 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；2. 廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；3. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004

甘蔗是我國(guó)主要的糖料作物，是生產(chǎn)蔗糖最主要的原料，甘蔗生產(chǎn)過(guò)程中受到的病蟲害威脅給蔗糖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。甘蔗鐮孢菌（）引起的梢腐病是一種真菌性病害，嚴(yán)重影響甘蔗作物生產(chǎn)。鐮孢菌致病基因的研究對(duì)于梢腐病的防治具有重要意義。腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（adenine nucleotide translocase, ANT）介導(dǎo)線粒體與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)之間ADP/ATP的交換，在真核細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡密切相關(guān)。本研究克隆獲得了長(zhǎng)936 bp具有完整開放閱讀框（open reading frame, ORF）的甘蔗鐮孢菌ANT基因序列，命名為，其編碼311個(gè)氨基酸，并且與小麥條銹菌病原菌ANT蛋白和小麥白粉病病原菌ANT序列相似性較高。蛋白軟件分析顯示，該基因編碼的蛋白為穩(wěn)定的疏水蛋白，含有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，一個(gè)ADP/ATP transporter結(jié)構(gòu)域，有3個(gè)同源重復(fù)的MCF基序，與粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（mitochondrial carrier family，MCF）的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相吻合。軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)基因可能定位在線粒體。qRT-PCR結(jié)果顯示，基因在菌絲生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定無(wú)顯著差異；在與甘蔗互作過(guò)程的表達(dá)模式表現(xiàn)為：接種后12 h該基因開始上調(diào)表達(dá)，24 h表達(dá)量顯著升高，72 h達(dá)到表達(dá)高峰。推測(cè)基因的表達(dá)不僅與甘蔗鐮孢菌細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)，同時(shí)可能參與與甘蔗的互作過(guò)程，且主要在侵染后期發(fā)揮功能。研究病原菌生長(zhǎng)保守基因?yàn)楦收峥股腋∮N提供新思路。

甘蔗梢腐病；甘蔗鐮孢菌；腺苷酸轉(zhuǎn)移酶；基因克??；表達(dá)分析

甘蔗（spp.）不僅是我國(guó)最重要的糖料作物，還是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要戰(zhàn)略物資，保障食糖安全已上升成為國(guó)家戰(zhàn)略[1-2]。廣西地區(qū)的亞熱帶氣候，適合甘蔗生長(zhǎng)的同時(shí)也利于各種病害的發(fā)生與傳播，其中，梢腐?。╬okkah boeng disease）是由真菌引起的主要威脅甘蔗梢部幼嫩葉片的病害，輕者使甘蔗梢部葉片褪綠，扭曲變形，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使梢部整個(gè)畸形壞死，引起頂腐，甚至造成甘蔗整株死亡[3-4]。近年來(lái)甘蔗梢腐病的發(fā)病趨勢(shì)逐年加重，廣西作為我國(guó)最主要的甘蔗種植地區(qū)，其蔗區(qū)的梢腐病由以前的零星發(fā)生到現(xiàn)在已發(fā)展成為甘蔗生長(zhǎng)前中期的主要病害。梢腐病的發(fā)生不僅出現(xiàn)在廣西蔗區(qū)，在云南蔗區(qū)也有發(fā)生，一些高感品種因梢腐病爆發(fā)致使甘蔗產(chǎn)量下降30.2%～48.5%，其發(fā)生逐漸表現(xiàn)出無(wú)規(guī)律性、無(wú)區(qū)域性的特點(diǎn)[5-7]。甘蔗梢腐病的發(fā)生導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量下降，影響甘蔗品質(zhì)（如會(huì)引起甘蔗糖分、蔗汁錘度、蔗汁重力純度等降低）[4, 8]，對(duì)甘蔗生產(chǎn)以及蔗糖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。甘蔗梢腐病病原菌為半知菌亞門鐮刀菌屬，我國(guó)甘蔗梢腐病病發(fā)的主要病原菌有等[9]。研究甘蔗鐮孢菌的能量代謝機(jī)制是甘蔗梢腐病防治的基礎(chǔ)性工作，對(duì)甘蔗梢腐病的防治具有重要意義。

線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（mitochondrial carrier family, MCF）是位于線粒體膜上的跨膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)與線粒體之間的能量交換，將在線粒體中產(chǎn)生的多余的能量傳遞至細(xì)胞質(zhì)中[10]。腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（adenine nucleotide translocase, ANT），又稱ADP /ATP載體蛋白（ADP/ATP carrier protein, AAC）或ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶（ADP/ATP translocase, AAT），是MCF家族的成員并且是含量最豐富的線粒體內(nèi)膜蛋白[11, 10-13]。MCF motif中的RRRMMM氨基酸序列位于ANT轉(zhuǎn)運(yùn)的重要位置，負(fù)責(zé)吸引ADP結(jié)合到ANT蛋白上，進(jìn)而激發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)生[10, 14-17]。ANT蛋白富含N-豆蔻酰化位點(diǎn)，N-豆蔻?；揎棸l(fā)生在多肽鏈N端的甘氨酸殘基上，賦予蛋白靈活可變的膜結(jié)合能力[18-19]。ANT介導(dǎo)ATP與ADP的跨線粒體膜交換，利用產(chǎn)電轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，在底物濃度梯度和電子傳遞鏈產(chǎn)生的線粒體膜電位的驅(qū)動(dòng)下[11, 20]，通過(guò)ANT載體2種狀態(tài)的循環(huán)實(shí)現(xiàn)ADP/ATP的交換，ANT載體的中心結(jié)合位點(diǎn)在線粒體基質(zhì)開放狀態(tài)（matrix-open state）下結(jié)合ATP并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞器膜內(nèi)腔，在細(xì)胞質(zhì)開放狀態(tài)（cytoplasmic-open state）下專一地與細(xì)胞器內(nèi)等量的ADP分子結(jié)合并轉(zhuǎn)移到膜外釋放，完成ADP/ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)[13, 21-22]。由于ANT在氧化磷酸化及能量代謝中發(fā)揮著重要作用，已經(jīng)在線蟲、哺乳動(dòng)物、真菌等多種生物體中被廣泛研究[10]。除了介導(dǎo)ADP/ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中ANT也發(fā)揮著重要作用[23]。作為線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵步驟，線粒體外膜的通透化作用（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）觸發(fā)凋亡因子（如細(xì)胞色素c等）的釋放，使其從線粒體膜間隙進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中，這些因子確保了凋亡級(jí)聯(lián)的傳播和細(xì)胞死亡的執(zhí)行，但該機(jī)制仍存在爭(zhēng)議[24]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore compiex, mPTPC）的打開導(dǎo)致線粒體膨大和線粒體外膜破裂，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物MOMP發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。雖然該孔的分子組成尚未完全確定，但有研究認(rèn)為其主要成分是ANT、電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel, VDAC）和親環(huán)素D（cyclophilin D）[25-27]。ANT作為PTPC最主要的成分之一在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有重要貢獻(xiàn)[28]。

目前，已經(jīng)在多種病原微生物中對(duì)ANT蛋白進(jìn)行了功能初步探究。在小麥白粉病菌（）中，王俊美等[17]通過(guò)RCAE技術(shù)鑒定到1個(gè)保守的ANT蛋白BgtAACPx，該蛋白含有ANT蛋白的所有特征，并且該基因在侵染后48～ 72 h表達(dá)量顯著提升，推測(cè)該蛋白可能在形成吸器及菌絲過(guò)程中提供能量。在小麥條銹病菌（），TANG等[29]通過(guò)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)1個(gè)保守的PstANT蛋白，通過(guò)免疫膠體金發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于真菌線粒體，其3個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ芫哂兄匾饬x，qRT-PCR顯示在侵染階段顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該蛋白可能與病原菌生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。綜上作為MCF家族成員的基因在病原菌能量代謝以及轉(zhuǎn)換途徑中發(fā)揮重要作用。本研究在課題組前期獲得的甘蔗鐮孢菌全基因組數(shù)據(jù)（未公布）的基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)分析，鑒定得到一個(gè)腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因。qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)貫穿甘蔗鐮孢菌細(xì)胞的生命活動(dòng)周期，可能與細(xì)胞生命活動(dòng)中的能量供應(yīng)相關(guān)，為進(jìn)一步解析該基因在致病過(guò)程中的作用和制定甘蔗梢腐病防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及菌株 本研究以‘中蔗1號(hào)’為供試甘蔗品種，取蔗莖于溫室大棚（廣西大學(xué)）內(nèi)桶栽，光周期為16∶8（光照∶黑暗），5葉展齊后用于接種實(shí)驗(yàn)，該品種對(duì)表現(xiàn)為感病。供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離純化的甘蔗鐮孢菌（）菌株，于28℃恒溫下PDA/PDW培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）于37℃恒溫條件下LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

1.1.2 試劑 高純度DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)（北京）有限公司；TB Green?Premix Ex Taq? II、pMD?18-T Vector Cloning Kit購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由在線工具ExPASy-Proparam（https://web.expasy.org/ protparam/）分析得到。蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)通過(guò)在線工具TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）以及TMPRED（http://www. ch.embnet.org/software/TMPRED form.html/）進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域通過(guò)在線工具Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）預(yù)測(cè)分析。蛋白的功能位點(diǎn)由在線工具Scanprosite（https://prosite.expasy.org/scanprosite/ scanprosite_doc.html）預(yù)測(cè)分析。亞細(xì)胞定位由在線工具Euk-mPLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/euk-multi-2/）預(yù)測(cè)分析。利用BLAST比對(duì)分析軟件對(duì)克隆目的片段進(jìn)行同源性分析，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成 甘蔗鐮孢菌（）于PDA平板上28℃恒溫培養(yǎng)72、144、216 h后，提取菌絲RNA。接種甘蔗后，分別于0、12、24、72、120、168 h采集甘蔗葉片，參照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品RNA的完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照試劑盒（TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）說(shuō)明書。

1.2.3 目的基因克隆 利用在線工具Primer- BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer- blast/）設(shè)計(jì)基因的特異性引物F/R（表1），以菌絲cDNA為模板，用高保真酶（2× Phanta?Max Master Mix）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50 μL）為：

2×Phanta Max Master Mix25 μL Forward Primer (10 μmol/L)1 μL Reverse Primer (10 μmol/L)1 μL cDNA1–5 μL ddH2Oup to 50 μL

PCR反應(yīng)程序參照2×Phanta?Max Master Mix說(shuō)明書。反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用DNA純化回收試劑盒純化回收目的基因后，利用DNA A-Tailing Kit（TaKaRa）在DNA片段的3￠末端加“A”尾，連接至pMD18-T Vector克隆載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1，挑取陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 目的基因的表達(dá)模式分析 使用LightCycler 96定量PCR儀器進(jìn)行反應(yīng)，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，在Primer-BLAST （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）上進(jìn)行qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)（表1），選取核糖體18s基因作為內(nèi)參基因。利用TB Gree（TaKaRa）染料法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，按照2–??CT法[30]分析基因在菌絲生長(zhǎng)時(shí)期以及侵染甘蔗時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。用GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪圖。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 FsANT序列分析及同源比對(duì)

根據(jù)前期測(cè)得的甘蔗鐮孢菌（）基因組，通過(guò)BlastP軟件分析得到了一個(gè)腺苷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白序列，基因的ORF框長(zhǎng)度為936 bp，編碼311個(gè)氨基酸。利用NCBI Conserved domian search軟件對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)sANT基因編碼的氨基酸序列含有1個(gè)保守的ADP/ATP transproter結(jié)構(gòu)域（圖1）。小麥白粉菌[17]和小麥條銹菌[29]中的ANT蛋白已經(jīng)報(bào)道，下載其蛋白序列。通過(guò)軟件的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)FsANT與已經(jīng)報(bào)道的BgtAACPx，PstANT同源性較高，并且含有相似的結(jié)構(gòu)域（Repeat 1、Repeat 2和Repeat 3）。說(shuō)明該基因編碼的蛋白可能是一個(gè)ANT蛋白（圖2）。

圖1 FsANT保守結(jié)構(gòu)域

圖2 FsANT與已知ANT蛋白的多序列比對(duì)

2.2 目的基因的克隆

根據(jù)已經(jīng)獲得的甘蔗鐮孢菌基因ORF設(shè)計(jì)基因特異性引物-F/R（表1），以菌絲cDNA為模板，進(jìn)行目的基因克隆。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到長(zhǎng)度約936 bp大小的條帶（圖3），克隆測(cè)序獲得序列與基因組測(cè)序結(jié)果一致（圖4）。

2.3 FsANT生物信息學(xué)分析

通過(guò)ExPASy-Proparam軟件分析其理化性質(zhì)（表2），其編碼蛋白分子量為33 761.390 Da，理論pI值為9.890，親水性平均系數(shù)為0.031，被歸類為疏水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為24.800（小于40），為穩(wěn)定蛋白。利用TMHMM和TMPRED軟件分析表明（圖5），F(xiàn)sANT蛋白含有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分別為9～34，116～141，180～204，216～241，280～307位氨基酸，屬于跨膜蛋白。Scanprosite分析結(jié)果表明ANT蛋白含有3種功能位點(diǎn)，其中3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和14個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)（表3）。其中富含N-豆蔻?；稽c(diǎn)作為ANT蛋白的一個(gè)重要特征，說(shuō)明FsANT可能是一個(gè)保守的功能蛋白。利用Euk-mPLoc 2.0軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)結(jié)果表明ANT蛋白亞細(xì)胞定位于線粒體。

圖3 FsANT基因ORF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 FsANT基因測(cè)序結(jié)果

表 2 FsANT蛋白的基本理化性質(zhì)

圖5 FsANT跨膜結(jié)構(gòu)分析

表3 FsANT蛋白的功能位點(diǎn)

ANT的一級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白有3個(gè)重復(fù)的同源區(qū)域，在每個(gè)重復(fù)區(qū)域都可以找到1個(gè)共同的MCF基序（圖6），即PxD/ExxK/RxK/R-（20～30個(gè)氨基酸殘基）-D/EGxxxxaK/RG（其中字母a表示芳香族殘基）。Repeat 1、Repeat 2和Repeat 3與已報(bào)道的基序基本相同，其中只有單個(gè)氨基酸的突變，可能與物種差異性有關(guān)。同時(shí)Repeat 3出現(xiàn)了RRRMMM序列，這是所有屬于MCF的ANT載體蛋白都具有的特征。

2.4 FsANT表達(dá)模式分析

通過(guò)qRT-PCR分析基因的表達(dá)模式，菌絲時(shí)期以在PDA平板生長(zhǎng)72 h的表達(dá)量作為對(duì)照（CK，設(shè)相對(duì)表達(dá)量為1）；侵染時(shí)期以在菌絲時(shí)期的表達(dá)量作為對(duì)照（CK，設(shè)相對(duì)表達(dá)量為1），GraphPad Prism軟件繪制表達(dá)模式圖?；蛟谏L(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)且表達(dá)無(wú)顯著差異（圖7A）。基因的表達(dá)貫穿于侵染甘蔗的整個(gè)時(shí)期，接種后12 h該基因開始上調(diào)表達(dá)，24 h表達(dá)量顯著升高，72 h達(dá)到表達(dá)高峰，與在菌絲體的表達(dá)量存在極顯著差異，約為菌絲表達(dá)量的2.6倍，72 h后表達(dá)量開始下降（圖7B）。根據(jù)先前的研究基礎(chǔ)，甘蔗鐮孢菌在侵染甘蔗24 h后，分生孢子長(zhǎng)出芽管，伸入植物氣孔或毛狀體；侵染后72 h，菌絲加快生長(zhǎng)，從氣孔伸出，纏繞毛狀體進(jìn)一步向周邊擴(kuò)散[31]。這表明基因在甘蔗鐮孢菌在甘蔗表面定殖及擴(kuò)散過(guò)程中發(fā)揮了重要功能，推測(cè)可能主要參與能量代謝。

圖6 FsANT的3個(gè)MCF基序

ns表示差異不顯著（P>0.05），*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)蔗區(qū)甘蔗梢腐病的普遍發(fā)生，病原菌變異速度較快，所以控制病原菌的危害是一類重要難題。以病原菌生長(zhǎng)保守基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，通過(guò)抑制病原菌的繁殖來(lái)提高品種抗性，也是一種經(jīng)濟(jì)有效的手段。ANT蛋白作為重要的能量轉(zhuǎn)換蛋白，可以轉(zhuǎn)運(yùn)ADP/ATP，并且可以調(diào)控細(xì)胞凋亡。PEREIRA等[28]和ZHIVOTOVSKY等[32]發(fā)現(xiàn)ANT參與酵母、線蟲及哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡過(guò)程。王俊美等[17]發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)可能和白粉菌與小麥互作時(shí)所需的能量提供有關(guān)；TANG等[29]的研究表明基因可能參與小麥條銹菌細(xì)胞的能量供應(yīng)以及細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程。本研究從甘蔗梢腐病病原菌中克隆得到了一個(gè)936 bp的基因，該基因編碼311個(gè)氨基酸，含有ADP/ATP transporter結(jié)構(gòu)域，通過(guò)DNAMAN多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白與已知的ANT蛋白（PsANT[29], BgtAACPx[17]）結(jié)構(gòu)域特征高度相似，推測(cè)FsANT蛋白可能與PsANT, BgtAACPx等已報(bào)道的ANT蛋白具有類似的功能。

本研究得到的ANT蛋白符合MCF成員的一般特征，通過(guò)與已報(bào)道的文獻(xiàn)相比較[10]，ANT蛋白重復(fù)表達(dá)了“PxD/ExxK/RxK/R-(20～30個(gè)殘基)- D/EGxxxxa（芳香族氨基酸殘基）K/RG”基序，Repeat 1和Repeat 2中出現(xiàn)個(gè)別氨基酸的突變，這可能與物種差異性有關(guān)；位于ANT轉(zhuǎn)運(yùn)重要位置的“RRRMMM”序列在Repeat 3中檢測(cè)到，表明該ANT蛋白可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)ADP/ATP的一般特性。FsANT蛋白定位在線粒體上，這與ANT蛋白在線粒體中發(fā)揮功能的特性相一致。在菌絲生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的表達(dá)無(wú)顯著差異，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，推測(cè)該基因可能參與甘蔗鐮孢菌細(xì)胞整個(gè)生長(zhǎng)的能量供應(yīng)；同時(shí)該基因在侵染時(shí)期上調(diào)表達(dá)，接種后24 h表達(dá)量顯著升高，72 h達(dá)到表達(dá)高峰，與在菌絲體的表達(dá)量存在極顯著差異?；虻谋磉_(dá)模式在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道，小麥白粉菌基因在侵染72 h表達(dá)量最高[17]；小麥條銹菌基因在接種后24 h呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，接種48 h以及120 h為2個(gè)表達(dá)高峰期[29]。由此可見，這類基因的表達(dá)模式基本相同，表達(dá)貫穿病原菌與寄主互作的整個(gè)時(shí)期，但是主要在侵染后期發(fā)揮功能。通過(guò)比較病原菌侵染過(guò)程的顯微觀察結(jié)果，說(shuō)明該基因參與分生孢子到芽管的萌發(fā)，并且在菌絲定殖甘蔗和擴(kuò)散中發(fā)揮重要功能，推測(cè)該基因?yàn)椴≡秩具^(guò)程提供能量。綜上，基因在甘蔗鐮孢菌生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期以及侵染甘蔗過(guò)程中均發(fā)揮了重要功能，可能與細(xì)胞生命活動(dòng)中的能量供應(yīng)相關(guān)。下一步將通過(guò)真菌基因敲除，顯微觀察，致病力鑒定等進(jìn)一步探究該基因的功能，并通過(guò)HIGS技術(shù)討論該基因?qū)τ诳共》N質(zhì)材料創(chuàng)制的意義。

綜上，本研究克隆得到了甘蔗鐮孢菌的一個(gè)腺苷酸轉(zhuǎn)位酶基因，推測(cè)該基因可能參與甘蔗鐮孢菌的能量代謝。但是，對(duì)基因參與能量代謝的機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

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Cloning of anGene inand Analysis on Its Expression Pattern During Infection Process

WANG Caixia1,2, HUANG Zhen1,3*, LI Huixue1,2, ZHOU Yuming1,2, DUAN Zhenzhen1,3, BAO Yixue1,3, ZHANG Muqing1,3**, YAO Wei1,2,3**

1. State Key Lab of Conservation and Utilization of Agric-Biological Resources, Nanning, Guangxi 530004, China; 2. Guangxi Key Lab of Sugarcane Biology, Nanning, Guangxi 530004, China; 3. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China

Sugarcane is the main sugar crop in China and the most important raw material for sugar production. The threat of diseases and insect pests in sugarcane production has caused serious losses to the sugar industry. Tip rot caused byis a fungal disease that seriously affects sugarcane crop production. It is of great significance to study the pathogenic genes of. Adenine nucleotide translocase (ANT) mediates the exchange of ADP/ATP between mitochondria and cytoplasmic matrix, which plays an important role in eukaryotic cell energy metabolism and is closely related to cell growth, development and apoptosis. In this study, a 936 bp ANT gene sequence ofwith a complete open reading frame (ORF) was cloned, tentatively named, encoding 311 amino acids.protein ofwas found to cluster with ANT protein of other pathogens, indicating thatmay had the similar function. Softwares analysis showed that the protein encoded by this gene was a stable hydrophobic protein, containing five transmembrane structures. In addition, ANT has three homologous and repeated MCF motifs in one ADP/ATP transporter domain, which conforms to the basic structural characteristics of Mitochondrial carrier family (MCF). The software predicted that the gene might target mitochondria. qRT-PCR results showed thatgene expression was relatively stable during mycelia growth period without significant difference. In the process of interaction with sugarcane, the expression pattern of this gene began to be up-regulated 12 h after inoculation, and increased significantly 24 h after inoculation, and reached its peak at 72 h. It is speculated that the expression ofgene was not only related to the growth ofcells, but also maight participate in the interaction betweenand sugarcane, and mainly played a role in the later stage of infection. The study of pathogenic growth conserved genes would provide a new idea for sugarcane breeding against pokkah boeng disease.

sugarcane pokkah boeng disease;; adenine nucleotide translocase (ANT); gene clone; expression analysis

S435.661

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.007

2022-01-25；

2022-03-21

廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB21238008）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 32001603）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)糖料產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（No. CARS-170726）。

王彩霞（1998—），女，碩士研究生，研究方向：甘蔗遺傳育種；*同等貢獻(xiàn)作者：黃 振（1994—），男，博士研究生，研究方向：甘蔗遺傳育種。**通信作者（Corresponding author）：姚 偉（YAO Wei），E-mail：yaoweimail@163.com；張木清（ZHANG Muqing），E-mail：zmuqng@163.com。