陳文凱, 王 新, 冼俊思, 鐘楊生, 陳芳艷

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣州 510642)

感染是導(dǎo)致傷口修復(fù)效率較低甚至失敗的主要原因[1-2],因此,開(kāi)發(fā)具有抗菌、抗感染的多功能生物材料是生物醫(yī)學(xué)研究的持續(xù)目標(biāo)。臨床上常利用膠原蛋白、絲素蛋白、殼聚糖等醫(yī)用生物材料作為基料,這些基料能夠在分子、細(xì)胞和個(gè)體水平上加速傷口的愈合,其降解產(chǎn)物為安全無(wú)毒的氨基酸、糖類等物質(zhì)[3-5]。柞蠶絲素、桑蠶絲膠和明膠三種材料均具有良好的生物相容性、可降解性和成膜性,有利于細(xì)胞的黏附和增殖,安全無(wú)毒而且來(lái)源廣泛。三種材料各有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),明膠(GEL)是膠原蛋白水解產(chǎn)物,含有亞氨基、醛基等活性極強(qiáng)的基團(tuán),易發(fā)生交聯(lián),成膜性好,但其力學(xué)強(qiáng)度低,需與其他材料復(fù)合使用[6-8]。柞蠶絲素蛋白由于富含天然的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列,特別有利于動(dòng)物細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)[9-11]。與絲素蛋白相比,絲膠蛋白含親水性氨基酸較多,具有較強(qiáng)的吸水能力,可防止水分流失,具有促進(jìn)膠原增殖和遷移的能力,并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有較理想的抑菌效果[12-14]。由于絲素、絲膠中絲氨酸的醇羥基、酪氨酸的酚羥基、賴氨酸的氨基、組氨酸的咪唑基等都具有活潑H的基團(tuán),可通過(guò)與聚乙二醇、戊二醛等交聯(lián)劑交聯(lián)成具有一定力學(xué)性能的生物材料[15-17]。雖然戊二醛交聯(lián)效果好,但是它有基因毒性和誘變的潛在危害[18],相比之下,聚乙二醇在安全性方面更有優(yōu)勢(shì)[19]。

抗菌性能對(duì)生物基材料的應(yīng)用十分重要。然而,大多數(shù)的生物基材料本身不具備抗菌性能或抗菌能力較弱,因此,通過(guò)不同的抗菌劑修飾,可以有效提高生物材料的抗菌性能。目前用于制備抗菌生物材料的抗菌劑主要有黃酮類、多酚類、蒽醌類、季銨鹽類、抗生素類及溶菌酶等有機(jī)抗菌劑[20-23]和Ag、Zn、TiO2、石墨烯等無(wú)機(jī)抗菌劑[24-27]。醫(yī)藥領(lǐng)域的生物抗菌材料更趨向于選擇具有優(yōu)異抗菌殺菌能力、不產(chǎn)生耐藥性、進(jìn)而能夠廣譜抗菌、生物低毒/無(wú)毒的抗菌劑[28]?？咕?Antimicrobial peptides,AMPs)是一類相對(duì)分子質(zhì)量小的多肽,作為天然高效抗菌劑,是替代傳統(tǒng)抗生素最有潛力的新型藥物[29-30]。它具有抗菌譜廣、特異性高、耐藥性極低的特點(diǎn),對(duì)多種耐藥菌具有殺傷作用,而且熱穩(wěn)定性和水溶性好,對(duì)高等動(dòng)物的正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒害作用,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有一定的優(yōu)勢(shì)[31]。

因此,本研究選用柞蠶絲素蛋白、明膠和桑蠶絲膠蛋白作為生物膜的基材,以聚乙二醇為交聯(lián)劑,首先探討桑蠶絲膠/柞蠶絲素/明膠基共混膜的制備方法,并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化配方,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)吸附的方式載入AMPs,獲得抗菌生物膜。本研究拓寬了蠶絲的應(yīng)用領(lǐng)域,可為蠶絲蛋白在生物敷料等醫(yī)用抗菌生物材料研制和開(kāi)發(fā)提供新的途徑。

1 試 驗(yàn)

1.1 材料及儀器

材料:柞蠶繭殼(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所),桑蠶繭殼(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶絲科學(xué)系),抗菌肽(Mw=2 512 Da)(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶絲科學(xué)系蠶桑資源利用實(shí)驗(yàn)室),活性檢測(cè)指示菌希埃氏大腸桿菌(K12D31)、金黃色葡萄球菌(SA)(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶絲科學(xué)系蠶桑資源利用實(shí)驗(yàn)室)。

試劑:硝酸鈣和明膠(廣州化學(xué)試劑廠),碳酸鈉(天津大茂化學(xué)試劑廠),聚乙二醇200(PEG 200)(廣州金華大化學(xué)試劑有限公司),無(wú)水乙醇(乙醇含量≥99.7%)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司),均為分析純;透析袋(Mw=8～10 kDa)(上海源葉生物科技有限公司)。

儀器:AGS-X型萬(wàn)能機(jī)械測(cè)試機(jī)(日本Shimadzu公司),VERTEX型傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)BRUKER公司),XRD-6100型X-射線衍射儀(日本Shimadzu公司),XL-30-ESEM型掃描電子顯微鏡(荷蘭FEI公司),UV-1800型紫外分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)。

1.2 方 法

1.2.1 桑蠶絲膠溶液的制備

稱取桑蠶繭殼10 g,置于500 mL圓底燒瓶中,然后加入120 mL蒸餾水,于100 ℃冷凝回流提取30 min后過(guò)濾,收集濾液,得到質(zhì)量濃度為4.50 μg/mL絲膠溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柞蠶絲素溶液的制備

稱取柞蠶繭殼10 g,置于含500 mL 1% Na2CO3的燒杯中,于100 ℃的條件下攪拌15 min;脫膠結(jié)束后,用60 ℃蒸餾水沖洗干凈,以上過(guò)程重復(fù)3次,得到脫膠柞蠶絲素;最后將其在75 ℃條件下干燥2.5 h,扯松,獲得網(wǎng)狀絲素纖維。然后,參照肖露等[33]的方法制備柞蠶絲素溶液。首先稱取180 g的硝酸鈣于燒杯中,80 ℃下攪拌30 min后,得到熔融的硝酸鈣,用量筒量取100 mL熔融的硝酸鈣,置于圓底燒瓶中;然后加入10 g剪碎的柞蠶絲素纖維,放置于油浴鍋中,加熱到120 ℃并攪拌2 h,得到柞蠶絲素溶液,待其冷卻后,裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為8～10 kDa的透析袋中,透析除鹽,得到質(zhì)量濃度為27.5 mg/mL柞蠶絲素溶液,置于4 ℃下儲(chǔ)藏備用。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按Bradford法測(cè)定絲膠蛋白和絲素蛋白的含量[33],并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.2.4 桑蠶絲膠/柞蠶絲素/明膠基(BS-TSF-GEL)共混膜制備單因素試驗(yàn)

稱取3.6 g明膠粉末,加入到6.4 mL蒸餾水中,磁力攪拌至完全溶解,配制溫度為60 ℃,靜置除去氣泡,制得質(zhì)量濃度為360 mg/mL的明膠溶液。量取一定體積的桑蠶絲膠(4.50 μg/mL)、柞蠶絲素(27.5 mg/mL)、明膠(360 mg/mL)溶液和聚乙二醇200(質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)交聯(lián)劑,室溫下混合均勻后,取5 mL混合液倒入直徑6 cm的培養(yǎng)皿中,在溫度為30 ℃的條件下,放置48 h,成膜后浸泡于一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇中處理24 h,在通風(fēng)櫥中自然干燥即可得到BS-TSF-GEL共混膜。設(shè)置單因素試驗(yàn)考察絲膠、絲素、聚乙二醇、明膠溶液的添加量對(duì)共混膜溶失率的影響。

1)桑蠶絲膠與柞蠶絲素體積比對(duì)BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響。將絲膠與絲素溶液分別按體積比3︰0、2.5︰0.5、2︰1、1.5︰1.5、1︰2、0.5︰2.5、0︰3的比例混合,得到體積比不同的絲膠/絲素混合液,分別取3 mL不同體積比的絲膠/絲素混合液于燒杯中,再依次加入3 mL聚乙二醇200和1.5 mL明膠溶液,固定絲膠/絲素混合液占整個(gè)體系的比例為40%。成膜后測(cè)定不同絲膠、絲素體積比對(duì)共混膜溶失率的影響。

2)聚乙二醇200添加量對(duì)BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響。依次吸取0.000、0.500、1.125、1.930、3.000、4.500、6.750 mL的聚乙二醇200于燒杯中,然后加入3 mL體積比為2︰1的絲膠/絲素混合液,1.5 mL明膠溶液,使聚乙二醇200占整個(gè)體系的比例分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%。成膜后測(cè)定聚乙二醇200添加量對(duì)共混膜溶失率的影響。

3)明膠添加量對(duì)BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響。依次吸取0.00、0.32、0.67、1.06、1.50、2.00、2.57 mL明膠溶液于燒杯中,再依次加入3 mL體積比為2︰1的絲膠/絲素混合液,3 mL聚乙二醇200,使明膠溶液占整個(gè)體系的比例為0、5%、10%、15%、20%、25%、30%。成膜后測(cè)定明膠添加量對(duì)共混膜溶失率的影響。

1.2.5 BS-TSF-GEL共混膜制備的正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,綜合考察絲膠與絲素體積比、聚乙二醇200和明膠添加量三因素對(duì)BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響,設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn),如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Orthogonal test factors and levels

1.2.6 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BS-TSF-GEL共混膜溶失率的影響

取6塊上述最優(yōu)配方條件下制備的BS-TSF-GEL膜,分別置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中浸泡24 h后取出,待乙醇揮發(fā)后,測(cè)定共混膜的溶失率。

1.2.7 BS-TSF-GEL共混膜溶失率測(cè)試方法

溶失率的測(cè)定參考謝瑞娟等[34]的方法,并作適當(dāng)改進(jìn)。將采用同一方法制備的膜平分為質(zhì)量相同的兩份,一份在100 ℃的烘箱中烘至恒重后,在50%相對(duì)濕度下平衡48 h,稱取質(zhì)量(Wi);另一份在37 ℃的PBS中以1 (g)︰30 (mL)的浴比振蕩1 h,收集余膜,置于100 ℃烘箱中烘至恒重,50%相對(duì)濕度下平衡48 h后,稱取質(zhì)量(Wt)。溶失率測(cè)試重復(fù)3次,溶失率(R)計(jì)算公式如下:

(1)

式中:Wi為初始樣品的干重,g;Wt為樣品溶失率測(cè)試結(jié)束后的干重,g。

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

將BS-TSF-GEL膜切割成5 mm×5 mm大小,臨界點(diǎn)干燥,放置在導(dǎo)電膠上,然后覆蓋金薄層。使用掃描電子顯微鏡對(duì)BS-TSF-GEL膜的微觀形貌進(jìn)行分析。

1.2.9 拉伸性能測(cè)試

將BS-TSF-GEL共混膜切割成20 mm×10 mm大小,厚度為3.2 mm的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)條形試樣,在50%的相對(duì)濕度下平衡48 h,按照GB/T 1040—2006《塑料 拉伸性能的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn),使用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)以10 mm/min的恒定速率進(jìn)行拉伸測(cè)試。

1.2.10 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)測(cè)試

利用傅里葉變換紅外光譜儀的ATR附件,以空氣為背景測(cè)定BS-TSF-GEL膜的紅外光譜。掃描范圍400～4 000 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)16次。用OPUS軟件對(duì)波數(shù)在1 600～1 700 cm-1內(nèi)的圖譜進(jìn)行剪切,之后進(jìn)行二階求導(dǎo),作為分峰位置的參照;再退卷積處理,各子峰的峰位由二階導(dǎo)數(shù)圖譜確定;再對(duì)圖譜進(jìn)行譜線擬合,得到曲線擬合數(shù)值,統(tǒng)計(jì)α螺旋、無(wú)規(guī)卷曲、β折疊和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量。

1.2.11 X-射線衍射分析(XRD)

利用日本島津XRD-6100型射線衍射儀測(cè)定BS-TSF-GEL共混膜的X射線衍射譜。參數(shù)設(shè)定:管電流40 mA,管電壓40 kV,銅靶,λ=15.406 nm,掃描范圍2θ=5°～45°,掃描速度3 (°)/min。

1.2.12 BS-TSF-GEL共混抗菌膜的制備

將BS-TSF-GEL共混膜分別浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%的抗菌肽溶液中,30 min后取出,用蒸餾水將吸附在膜表面的抗菌肽沖洗干凈,風(fēng)干后獲得抗菌膜。

1.2.13 抗菌性能測(cè)試

采用Kirby-Bauer擴(kuò)散法[35]對(duì)載有抗菌肽的BS-TSF-GEL共混膜進(jìn)行抗菌能力評(píng)價(jià)。以革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌SA)和革蘭氏陰性菌(希埃氏大腸桿菌K12D31)為指示菌。

將滅菌后的LB培養(yǎng)基置于室溫,待其冷卻至48～50 ℃時(shí),向100 μL無(wú)菌LB培養(yǎng)基中加入8 μL濁度為1×108cfu/mL的菌液(金黃色葡萄球菌SA或希埃氏大腸桿菌K12D31),搖勻。吸取含菌LB培養(yǎng)基15 mL,均勻攤平在60 mm培養(yǎng)皿底部,放置在超凈工作臺(tái)的臺(tái)面上使其冷卻凝固后,將直徑為2.5 mm的抗菌膜鋪在LB培養(yǎng)基表面,靜置30 min后,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,倒置培養(yǎng)過(guò)夜,觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.14 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后,用SPSS 24.0軟件完成統(tǒng)計(jì),得到平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BS-TSF-GEL共混膜制備

2.1.1 BS-TSF-GEL共混膜制備的單因素條件優(yōu)化

溶失率通常用來(lái)評(píng)價(jià)生物醫(yī)學(xué)材料在體內(nèi)和體外的穩(wěn)定性[36-37]。本試驗(yàn)首先設(shè)置了7個(gè)體積比不同的絲膠/絲素混合液制備共混膜,探究絲膠/絲素溶液體積比對(duì)共混膜溶失率的影響,結(jié)果如圖1所示。

圖1 桑蠶絲膠/柞蠶絲素體積比對(duì)BS-TSF-GE共混膜溶失率的影響Fig.1 Effect of volume ratio of bombyx mori sericin and tussah silkfibroin on the dissolution rate of BS-TSF-GE blended films

當(dāng)絲膠與絲素體積比低于2︰1時(shí),膜的溶失率保持在65%左右,變化不大;當(dāng)絲膠與絲素體積比達(dá)到2︰1后,繼續(xù)增加柞蠶絲素溶液比例,共混膜的溶解率開(kāi)始隨著絲素含量的增加而提高,這一變化趨勢(shì)與馬芳等[15]研究結(jié)果一致。這是因?yàn)榻z素分子之間主要以氫鍵結(jié)合,在水溶液中絲素大分子之間的氫鍵易被水與絲素大分子形成的氫鍵取代,所以容易溶解[36]。因此,考慮柞蠶絲素在細(xì)胞促生長(zhǎng)方面優(yōu)異的生物學(xué)特性,本研究將絲膠與絲素體積比確定為2︰1。

在確定絲膠與絲素體積比后,考察聚乙二醇200添加量對(duì)共混膜溶失率的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,隨著聚乙二醇200添加量的增加,共混膜的溶失率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)聚乙二醇200添加量為40%時(shí),共混膜的溶失率最低(63.44%)。聚乙二醇的兩個(gè)活潑羥基容易與絲素、絲膠的氨基酸殘基中的活潑基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),從而增加共混膜的穩(wěn)定性[36]。但聚乙二醇200添加到一定量后,膜的溶失率上升,這可能是由于聚乙二醇較強(qiáng)的親水性所致。因此,聚乙二醇200添加40%較為適宜。

圖2 聚乙二醇200添加量對(duì)BS-TSF-GE共混膜溶失率的影響Fig.2 Effect of polyethylene glycol 200 concentration on thedissolution rate of BS-TSF-GE blended films

探究明膠添加量對(duì)共混膜溶失率的影響,結(jié)果如圖3所示。共混膜的溶失率隨著明膠添加量的增大呈現(xiàn)顯著降低,最后趨于穩(wěn)定。當(dāng)明膠溶液添加量為20%時(shí),溶失率為61.74%。由于絲素和絲膠的等電點(diǎn)低于7.0,而明膠等電點(diǎn)大于7.0,在pH 7.0的環(huán)境中,絲膠、絲素和明膠帶相反的電荷,正負(fù)電荷相互作用,有利于交聯(lián)[38]。

圖3 明膠添加量對(duì)BS-TSF-GE共混膜溶失率的影響Fig.3 Effect of gelatin concentration on the dissolutionrate of BS-TSF-GE blended films

2.1.2 BS-TSF-GEL共混膜制備的正交試驗(yàn)條件優(yōu)化

通過(guò)設(shè)置正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化BS-TSF-GEL共混膜各組分間的配比,正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從表3的極差分析可知,3個(gè)因素影響B(tài)S-TSF-GEL共混膜溶失率的主次為:桑蠶絲膠與柞蠶絲素體積比(A)>PEG 200質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)>明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)。對(duì)應(yīng)的最優(yōu)配方是A2B3C2,即體積比為2︰1的絲膠/絲素溶液、聚乙二醇200、明膠溶液,它們分別占總體系的35%、40%和25%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳組合A2B3C2的真實(shí)性,進(jìn)行了3次重復(fù)表征試驗(yàn),BS-TSF-GEL共混膜的平均溶失率為(59.19±1.23)%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results

表3 極差分析結(jié)果Tab.3 Range analysis results

2.2 BS-TSF-GEL共混膜穩(wěn)定性及拉伸性能優(yōu)化

現(xiàn)有的研究表明,乙醇處理可有效改善絲素蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性,同時(shí),乙醇是對(duì)絲素蛋白材料水不溶性處理的有效手段[15,39]。為進(jìn)一步提高BS-TSF-GEL共混膜的穩(wěn)定性,本研究將膜浸入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇中浸泡處理,對(duì)膜的性能進(jìn)行優(yōu)化,檢測(cè)膜的溶失率,結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇處理對(duì)BS-TSF-GEL膜溶失率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ethanol treatment onthe dissolution rate of BS-TSF-GEL blended films

由圖4可知,隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,溶失率呈現(xiàn)下降趨勢(shì);但溶失率下降的幅度隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而變小,當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí),繼續(xù)增加乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)膜的溶失率下降不顯著。這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇處理后共混膜中蛋白大分子的結(jié)構(gòu)趨向穩(wěn)定,此后膜的溶失率隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化很小。乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%時(shí),溶失率為34.62%,與未經(jīng)乙醇處理的共混膜相比,膜溶失率降低了24.57%。

測(cè)定60%～100%乙醇處理后的BS-TSF-GEL共混膜的力學(xué)性能,結(jié)果如圖5所示。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,膜的斷裂伸長(zhǎng)率逐漸減小,斷裂強(qiáng)度逐漸增加。乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%時(shí),膜的斷裂強(qiáng)度最高,為578.8 kPa,此時(shí)斷裂伸長(zhǎng)率可達(dá)到34.15%,優(yōu)于桑蠶絲的平均斷裂伸長(zhǎng)率(15%～25%)。因此,選擇100%為最優(yōu)處理質(zhì)量分?jǐn)?shù),由于乙醇可以增強(qiáng)蛋白大分子多肽鏈之間的部分氫鍵和范德華力,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)從α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲向β折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)變[39],從而使共混膜的斷裂強(qiáng)度得到提高。

圖5 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BS-TSF-GEL共混膜的拉伸性能Fig.5 Effect of ethanol mass fraction on the tensile propertiesof BS-TSF-GEL blended films

2.3 BS-TSF-GEL共混膜的形貌及結(jié)構(gòu)

BS-TSF-GEL共混膜外觀形貌如圖6(a)所示,可見(jiàn)共混膜外觀均勻,呈淡黃色,無(wú)相分離現(xiàn)象,手感順滑柔軟,富有彈性。BS-TSF-GEL共混膜的微觀形貌如圖6(b～c)所示,可見(jiàn)共混膜表面存在微小的孔隙。有研究認(rèn)為,膜的表面孔隙可以增大吸附的比表面積,提高載藥量,吸收傷口滲出液,促進(jìn)傷口愈合[17]。孔隙大小、分布、孔隙率的多少,以及添加PEG和乙醇處理對(duì)孔隙的影響有待于今后開(kāi)展深入的研究。

圖6 BS-TSF-GEL共混膜的形貌Fig.6 Morphology of BS-TSF-GEL blended films

進(jìn)一步地,采用傅里葉紅外光譜(FTIR)法分析共混膜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。FTIR光譜法可量化蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),酰胺Ⅰ帶對(duì)研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值[40]。酰胺Ⅰ帶中1 610～1 640 cm-1譜峰屬于β折疊,1 640～1 650 cm-1譜峰屬于無(wú)規(guī)卷曲,1 650～1 660 cm-1譜峰屬于α螺旋,1 660～1 700 cm-1譜峰屬于β轉(zhuǎn)角[41]。BS-TSF-GEL共混膜的傅里葉紅外光譜如圖7(a)所示。BS-TSF-GEL共混膜在1 630 cm-1處有很強(qiáng)的吸收峰,這是β折疊結(jié)構(gòu)的特征吸收峰膜;1 647 cm-1有一個(gè)較弱的吸收峰,這是無(wú)規(guī)卷曲的特征吸收峰;1 662、1 678 cm-1和1 692 cm-1處的吸收峰歸屬于β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

將傅里葉自去卷積應(yīng)用于共混膜的酰胺Ⅰ帶,以確定其二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量[41],自去卷積結(jié)果如圖7(b)所示。BS-TSF-GEL共混膜主要以β折疊為主,其相對(duì)含量高達(dá)37.29%,α螺旋/無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量為14.67%,β轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量為27.77%。FTIR結(jié)果表明,BS-TSF-GEL共混膜由β折疊、α螺旋/無(wú)規(guī)卷曲、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成,且以β折疊為主,屬于Silk Ⅱ結(jié)晶構(gòu)型。通常純絲素膜的構(gòu)象主要以α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主,是典型的Silk Ⅰ結(jié)晶構(gòu)型[41]。因此,可以推斷,PEG 200與蛋白大分子發(fā)生了相互作用,加之乙醇的后處理進(jìn)一步促進(jìn)了共混膜內(nèi)分子鏈之間形成了β折疊結(jié)構(gòu)。乙醇浸入共混膜內(nèi),破壞了共混膜中原有的氫鍵,分子鏈段發(fā)生重排形成了更加穩(wěn)定的蛋白質(zhì)氫鍵,從而誘導(dǎo)β折疊分子構(gòu)象的形成[39]。

圖7 BS-TSF-GEL膜的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Secondary structure of BS-TSF-GEL blended films

為驗(yàn)證BS-TSF-GEL共混膜的構(gòu)象,對(duì)共混膜做了X-射線衍射分析,BS-TSF-GEL共混膜的XRD圖譜如圖8所示。Silk Ⅰ(α螺旋和β轉(zhuǎn)角)的衍射主要出現(xiàn)在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°和40.1°;Silk Ⅱ(β折疊)的衍射主要出現(xiàn)在9.10°、18.9°、20.7°、24.3°和39.7°[42]。BS-TSF-GEL共混膜在2θ=24.49°附近出現(xiàn)了很強(qiáng)的衍射峰,表明BS-TSF-GEL共混膜以β折疊結(jié)構(gòu)為主,結(jié)晶結(jié)構(gòu)為Silk Ⅱ型。而在2θ=40.97°附近出現(xiàn)了一個(gè)弱而寬的“饅頭峰”,說(shuō)明BS-TSF-GEL膜有少量的Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)存在。XRD測(cè)試結(jié)果表明,BS-TSF-GEL共混膜以Silk Ⅱ?yàn)橹?并有少量的Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)存在,該結(jié)果與FTIR結(jié)果一致。相對(duì)于Silk Ⅰ和無(wú)定型結(jié)構(gòu),Silk Ⅱ結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,BS-TSF-GEL共混膜的這種結(jié)構(gòu)使其在溶失率較低的同時(shí)機(jī)械性能也較好。

圖8 BS-TSF-GEL共混膜的X-射線衍射圖譜Fig.8 X-ray diffraction pattern of BS-TSF-GEL blended films

2.4 負(fù)載抗菌肽BS-TSF-GEL共混膜的抗菌性能

用抑菌圈大小評(píng)價(jià)BS-TSF-GEL共混膜的抑菌效果和負(fù)載能力,BS-TSF-GEL共混膜抑菌性能如圖9和表4所示。

圖9 載有抗菌肽的BS-TSF-GEL共混膜平板抑菌圈Fig.9 Plate inhibition zone of BS-TSF-GEL blended films loaded with antimicrobial peptides

表4 BS-TSF-GEL共混抗菌膜的抑菌圈直徑Tab.4 Diameter of inhibition zone of BS-TSF-GELblended antibacterial biofilms

由圖9可見(jiàn),在共混膜的周圍會(huì)形成透明的抑菌圈,隨著抗菌肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,抑菌圈增大,當(dāng)抗菌肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí),對(duì)金黃葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)的抑菌圈直徑為3.93 mm,對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌圈直徑為3.55 mm(表4),說(shuō)明BS-TSF-GEL共混膜對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌效果,同時(shí)也表明共混膜對(duì)抗菌肽有較強(qiáng)的負(fù)載能力。這主要是因?yàn)榭咕?正電荷)能夠以靜電吸附的方式,負(fù)載到帶有負(fù)電荷的絲素和絲膠共混膜中[28,38]。

此外,作為對(duì)照,沒(méi)有負(fù)載抗菌肽的BS-TSF-GEL共混膜周圍也觀察到一點(diǎn)點(diǎn)的透明圈,說(shuō)明未負(fù)載抗菌肽的共混膜也有微弱的抑菌作用,這是由于共混膜中絲膠蛋白本身具有良好的抗菌性能。研究表明絲膠蛋白可以改變細(xì)菌形狀,破壞細(xì)菌細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄而發(fā)揮抑菌作用[12]。共混膜負(fù)載抗菌肽后,其抗菌效果增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

采用柞蠶絲素蛋白、明膠和桑蠶絲膠蛋白作為生物膜的基材,以聚乙二醇200作為交聯(lián)劑成功制備共混膜;利用乙醇對(duì)共混膜進(jìn)行改性,提高其強(qiáng)度和結(jié)晶度;通過(guò)負(fù)載抗菌肽獲得抗菌效果。制備的共混抗菌膜穩(wěn)定性好,溶失率34.62%,斷裂伸長(zhǎng)率34.15%,斷裂強(qiáng)度578.8 kPa,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有良好的抑菌效果。BS-TSF-GEL共混抗菌膜在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢(shì),本研究為蠶絲蛋白的應(yīng)用探索了新的途徑。

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