黃海濤， 魏旭青,2， 楊峻乙， 黃艷茹， 王莉麗， 楊 旭，勵(lì)建榮， 孫 彤,*

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心， 遼寧 錦州 121013; 2.成都先導(dǎo)藥物開發(fā)股份有限公司， 四川 成都 610000；3.民澤龍羊峽生態(tài)水殖有限公司， 青海 海南州 811800)

微生物污染是影響水產(chǎn)品加工運(yùn)輸過程中食品安全的重要因素，會(huì)影響食品品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失，甚至危及人體健康[1]。腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)屬于革蘭氏陰性菌，能在低溫條件下良好生長(zhǎng)，代謝水產(chǎn)品的肌肉蛋白，釋放臭味氣體，并且導(dǎo)致水產(chǎn)品發(fā)黏，是水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一[2]。

生物被膜是微生物應(yīng)對(duì)逆性環(huán)境衍生出的針對(duì)性生長(zhǎng)狀態(tài)，具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和屏障性能，能夠使細(xì)菌獲得良好的抗清洗能力和耐藥性[3-4]。生物被膜的形成受細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境及細(xì)菌接觸材料表面性質(zhì)的影響。傳統(tǒng)抗菌劑或者抗生素對(duì)已經(jīng)在材料表面定植的生物被膜的抑制效率較低，目前新興的無機(jī)納米材料(碳納米材料、金屬及金屬氧化物等)、水溶性大分子物質(zhì)(肽、酶和合成聚合物等)均能憑借其獨(dú)特的性質(zhì)殺滅細(xì)菌[5-6]。Rago等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子能夠造成細(xì)菌細(xì)胞壁損傷；Sin等[8]通過計(jì)算胞外多糖(exopolysacchari-des, EPS)的含量變化證明了ZnO-羥基磷灰石具有優(yōu)異的抗生物被膜性能。超雙疏材料具有較低的表面能并能形成三相界面，擁有良好的疏水疏油和抑制生物被膜黏附性能，具有成為抗生物被膜新材料的潛能[9]，若能防止細(xì)菌黏附的同時(shí)殺滅細(xì)菌，將是構(gòu)建抗菌材料的絕佳選擇[10-11]。納米ZnO是安全無毒的金屬氧化物，具有持久的抗菌性能和生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[12]。相較于昂貴的氟硅烷修飾的超疏水材料，二甲基硅氧烷(PDMS)具有無氟環(huán)保、價(jià)格低廉、制備方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是構(gòu)建超雙疏表面的良好選擇[13]。目前同時(shí)利用ZnO納米顆粒構(gòu)建超雙疏表面和抗菌表面的研究較少。

為充分利用微納米粒子構(gòu)建薄膜的超雙疏微觀結(jié)構(gòu)，并借助ZnO的抗菌性能增強(qiáng)薄膜的抗生物被膜性能，本研究擬采用流延法制備聚PDMS薄膜及超雙疏ZnO-PDMS薄膜，分析薄膜的理化性能，進(jìn)而揭示ZnO-PDMS薄膜抗水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的機(jī)理，旨在為食品儲(chǔ)運(yùn)過程中微生物污染的防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水醋酸鋅(CP，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%～101.0%)，廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司；PDMS(CAS：68083-19-2)，天津希恩思奧普德科技有限公司；正己烷(AR，體積分?jǐn)?shù)97%)，上海麥克林生化科技有限公司；腐敗希瓦氏菌(ATCC8071)，美國(guó)微生物菌種保藏中心；PVC板，0.2 mm，東莞市巨邦塑料材料有限公司；XTT溶液、考馬斯亮藍(lán)G250、超微量Na+/K+-ATP酶測(cè)定試劑盒，北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；堿性磷酸酶(AKP/ALP)測(cè)試盒，北京潤(rùn)澤康生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Rigaku Ultima Ⅳ型X射線粉末衍射儀，日本理學(xué)公司；Scimitar 2000 Near型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)安捷倫公司；S- 4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Jem- 2100F型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；OCA15EC型接觸角測(cè)量?jī)x，北京東方德菲有限公司；SW- CJ- 2FD型潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Victor X3型酶標(biāo)儀，上海珀金埃爾默儀器有限公司；TCP- SP5Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡(CLSM)，德國(guó)徠卡儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1超雙疏ZnO-PDMS薄膜的制備

參考魏旭青[14]的方法制備了棒狀、絨球狀和花狀的ZnO微納米粒子。參考Li等[15]的方法改性ZnO微納米粒子，制備超雙疏ZnO微納米粒子。

配制體積比為1∶10的PDMS-正己烷溶液，分別稱取0.100 0 g不同微觀形貌的ZnO超雙疏微納米粒子加入至2.0 mL PDMS-正己烷溶液中，磁力攪拌18 min混勻。將混勻的溶液流延在超聲去油后的PVC板上，于60 ℃烘干，得到ZnO-PDMS超雙疏薄膜。采用相同方法，制備不加ZnO超雙疏粉末的PDMS薄膜。

1.3.2ZnO微納米粒子及ZnO-PDMS薄膜的表征和表面潤(rùn)濕性測(cè)定

采用X射線粉末衍射儀對(duì)不同形貌的ZnO微納米粒子及ZnO-PDMS薄膜進(jìn)行表征，進(jìn)行X射線衍射(XRD)分析。測(cè)試條件為40 kV、50 mA，靶材CuKα，步寬0.02°，掃描范圍20°～80°。對(duì)ZnO微納米粒子進(jìn)行KBr壓片處理，測(cè)定其傅里葉變換紅外光譜(FTIR)，測(cè)試條件為步寬2 cm-1，波長(zhǎng)范圍4 000～400 cm-1。采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察PDMS薄膜和ZnO-PDMS薄膜表面的微觀形貌；采用SEM、透射電子顯微鏡(TEM)、高分辨率透射電鏡(HRTEM)觀察ZnO微納米粒子的微觀形貌，并進(jìn)行選區(qū)電子衍射(SAED)和電子能譜(EDX)分析。以去離子水和丙三醇為疏水疏油測(cè)定介質(zhì)，用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定PDMS薄膜和ZnO-PDMS薄膜表面的水和油靜態(tài)接觸角，接觸角測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.3.3薄膜表面腐敗希瓦氏菌黏附性能測(cè)定

1.3.3.1 生物被膜的培養(yǎng)

將保藏的腐敗希瓦氏菌菌懸液活化處理至OD595≈0.5，配置0.000 3 g/mL的氯化鈉堿性蛋白胨水，將菌懸液稀釋200倍。將3 mL稀釋后的菌懸液和PDMS薄膜或ZnO-PDMS薄膜(0.5 cm×0.5 cm)置于無菌離心管中，28 ℃培養(yǎng)一定時(shí)間后得生物被膜。

1.3.3.2 薄膜表面被膜菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用Saral等[16]的方法測(cè)定薄膜表面被膜菌生長(zhǎng)曲線。取對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的薄膜置于無菌離心管中，注入1 mL無菌磷酸鹽PBS緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=7.4)搖晃清洗3次，洗去表面浮游菌，取出薄膜置于10 mL滅菌PBS中，室溫超聲(53 kHz，224 W)10 min。將超聲后的菌懸液梯度稀釋并涂布于培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱(28 ℃，24 h)培養(yǎng)，根據(jù)菌落數(shù)量繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3.3 生物被膜微觀形貌觀察

采用Bumunang等[17]的方法觀察生物被膜的微觀形貌。取對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的薄膜置于無菌離心管中，用 1 mL 0.008 5 g/mL的無菌生理鹽水SPSS清洗3次，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液溶液于4 ℃固定4 h。固定后的薄膜用PBS溶液清洗3次，依次于體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%乙醇水溶液中浸泡30 min，最后用無水乙醇浸漬脫水2次，每次脫水30 min，取出后置于無菌超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。經(jīng)噴金處理后，使用SEM觀察生物被膜的表面微觀形貌。

1.3.4ZnO-PDMS薄膜對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜抑制機(jī)制的研究

1.3.4.1 生物被膜生物被膜及被膜菌狀態(tài)觀察

采用Dai等[18]的方法用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜，取對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的薄膜置于無菌離心管中，用1 mL無菌PBS溶液(0.1 mol/L，pH=7.4)清洗3次，配制10 μL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的碘化丙啶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的吖啶橙混合PBS溶液，將清洗后的薄膜置入混合溶液避光染色15 min，而后用滅菌PBS清洗3次，用吸水紙吸干多余水分，滴加10 μL抗熒光猝滅封片劑，置于4 ℃下避光保存。使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜形成及活菌和死菌的分布情況。

1.3.4.2 被膜菌代謝活性測(cè)定

采用XTT比色法測(cè)定生物被膜中被膜菌的代謝活性變化[20]，取對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的薄膜置于無菌離心管中，用1 mL無菌PBS溶液(0.1 mol/L，pH=7.4)清洗3次，分別加入100 μL LB營(yíng)養(yǎng)肉湯和50 μL XTT試劑，放入恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃，24 h)培養(yǎng)后用酶標(biāo)儀測(cè)OD490值。

1.3.4.3 生物被膜中胞外多糖測(cè)定

采用硫酸- 蒽酮法測(cè)定生物被膜中胞外多糖含量[19]，配制0.2 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.02 g/mL的蒽酮溶液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、50、100、200、300、400、500 μL)于10 mL比色管中，加入無菌水至1.0 mL，然后依次加入250 μL蒽酮溶液和2.5 mL 940 mL/L的濃硫酸，混勻后置于沸水浴中恒溫處理6 min，冷卻至室溫，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的薄膜置于無菌離心管中，用1 mL無菌PBS溶液(0.1 mol/L，pH=7.4)沖洗3次后，置入10 mL滅菌PBS中室溫超聲處理(53 kHz，224 W)10 min，取1.0 mL液體相同方法測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物被膜中胞外多糖的含量。

1.3.4.4 生物被膜中總蛋白質(zhì)測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定生物被膜中蛋白質(zhì)含量的變化[21]，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(50 mg/mL,1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50 μL)加入到96孔板中，用0.008 5 g/mL PBS補(bǔ)充至10 μL，分別加入200 μL考馬斯亮藍(lán)染色液，混勻后于室溫靜置5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的薄膜置于無菌離心管中，用1 mL無菌PBS溶液(0.1 mol/L，pH=7.4)清洗3次，室溫超聲處理(53 kHz，224 W)10 min后加入20 μL細(xì)胞裂解液，混勻后4 ℃靜置20 min，于冰浴中超聲(53 kHz，224 W)40 min，9 500 r/min、4 ℃離心15 min后備用。吸取離心后上清液5 μL至96孔板中，加5 μL生理鹽水，測(cè)定OD595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物被膜中總蛋白質(zhì)含量。

1.3.4.5 ATP和AKP酶活性測(cè)定

生物被膜菌中ATP和AKP酶活性的變化采用ATP和AKP酶活性試劑盒測(cè)定，依照試劑盒方法要求配制試劑并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0和Origin 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用沃勒- 鄧肯比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，P<0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZnO微納米粒子的化學(xué)表征

ZnO改性前后微納米粒子的XRD和FTIR分析見圖1。由圖1(a)可知，在2θ=31.78°、34.42°、36.24°、47.52°、56.60°、62.79°、67.91°、69.06°處出現(xiàn)的衍射峰與ZnO[PDF(36-1451)]的(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)、(112)和(201)晶面相對(duì)應(yīng)，即制備的ZnO微納米粒子均為六方纖鋅礦型ZnO。各衍射峰峰型尖銳，表明樣品晶粒尺寸較大，結(jié)晶狀態(tài)良好。經(jīng)超雙疏改性后，各樣品中的衍射峰仍然對(duì)應(yīng)于六方纖鋅礦型ZnO晶體的衍射峰，且衍射峰強(qiáng)度與位置均未改變。改性后樣品在2θ=22.82°、30.02°、31.02°、32.60°、46.45°處出現(xiàn)了衍射峰且各衍射峰強(qiáng)度不同，分別對(duì)應(yīng)于單斜晶體SiO2[PDF(51-1377)]的(113)、(-253)、(- 413)、(204)和(175)晶面，說明在ZnO微納米粒子超雙疏改性后，PDMS中的Si以單斜晶體SiO2的形式附著到了ZnO微納米粒子表面。改性后棒狀ZnO微納米粒子在2θ=30.02°、31.02°、32.60°處出現(xiàn)了強(qiáng)衍射峰，說明SiO2在(-253)、(- 413)、(204)晶面處優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)；改性后絨球狀ZnO微納米粒子在2θ=22.82°、32.60°、46.45°處出現(xiàn)了強(qiáng)衍射峰，說明SiO2在(113)、(204)和(175)晶面處優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)；改性后花狀ZnO微納米粒子在2θ=32.60°處出現(xiàn)了強(qiáng)衍射峰，說明SiO2僅在(204)晶面處優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。結(jié)果表明：改性劑與ZnO微納米粒子作用并在其表面形成了單斜晶體SiO2，但各樣品晶體的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)方向有很大差異，這可能是由于不同形狀ZnO微納米粒子有不同優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)晶面，使ZnO晶體的表面經(jīng)改性劑附著生長(zhǎng)形成的晶體產(chǎn)生了差異。

1、2、3分別為改性前棒狀、絨球狀、花狀ZnO微納米粒子，4、5、6分別為改性后棒狀、絨球狀、花狀ZnO微納米粒子。

ZnO微納米粒子的微觀形貌及晶格結(jié)構(gòu)見 圖2。由圖2可知，棒狀ZnO微納米粒子長(zhǎng)約 1.7 μm，寬約0.3 μm；絨球狀ZnO微納米粒子是由厚20～30 nm的納米片交錯(cuò)組成的直徑2～3 μm的微球；花狀ZnO微納米粒子是由直徑約130 nm、長(zhǎng)0.8～1.0 μm的納米棒組成的直徑約2 μm的微球。不同形貌的ZnO微納米粒子均形貌均一，分散性良好，無團(tuán)聚。由HRTEM分析可見，不同微觀形貌ZnO微納米粒子具有相同的相鄰平面之間的晶格條紋間距，均為0.52 nm，與ZnO(0001)的晶面間距對(duì)應(yīng)。SAED分析結(jié)果表明：各形狀的ZnO微納米粒子均具有單一的六方纖鋅礦晶體結(jié)構(gòu)，與XRD、HRTEM的表征結(jié)果一致。EDX分析結(jié)果表明：粒子的組成元素為O元素和Zn元素，無雜質(zhì)，且Zn元素略多于O元素，這可能是因?yàn)閆nO晶格中存在Zn填位和O空位等缺陷[31]。

圖2 ZnO微納米粒子的微觀形貌及晶格結(jié)構(gòu)

2.2 PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜表面濕潤(rùn)性表征

薄膜表面濕潤(rùn)性的分析和疏水疏油性能模式分析見圖3。由圖3(a)可見，ZnO微納米粒子的特征衍射峰未在ZnO-PDMS薄膜的XRD譜中出現(xiàn)，可能是因?yàn)橹苽鋾r(shí)PDMS包裹在ZnO微納米粒子表面，只有少量ZnO能暴露在薄膜表面導(dǎo)致未能被檢出。在2θ=22.06°、24.46°、27.26°、28.42°存在強(qiáng)峰，可能是因?yàn)镻DMS包裹在微納米粒子表面后經(jīng)過干燥固化后形成晶體產(chǎn)生了衍射峰。3個(gè)樣品的衍射峰大小位置無差異，表明PDMS膜晶體的形成不受ZnO微納米粒子微觀結(jié)構(gòu)的影響。

圖3 ZnO-PDMS薄膜表面濕潤(rùn)性分析和微觀形貌分析

根據(jù)材料表面的水接觸角和油接觸角可判斷其親水親油性能，通常水和油接觸角均大于150°為超雙疏材料，均小于90°為親水親油材料[32]。由圖3(b)薄膜潤(rùn)濕性能檢測(cè)結(jié)果可知，PDMS薄膜對(duì)水和油的接觸角分別為83.9°和84.9°，具有親水親油性；棒狀ZnO-PDMS薄膜的水接觸角和油接觸角的分別為144.0°和149.4°，均小于150°，為疏水疏油薄膜；絨球狀和花狀ZnO-PDMS薄膜對(duì)水和油的接觸角均高于150°，兩者均具有超雙疏性能。

由圖3(c)可知，PDMS薄膜表面光滑，無褶皺。加入ZnO微納米粒子后，PDMS薄膜表面出現(xiàn)不同程度的孔洞和凸起。棒狀ZnO-PDMS薄膜表面形成的凸起大小不均，孔洞最多；絨球狀ZnO-PDMS薄膜次之；花狀ZnO-PDMS薄膜表面的孔洞和凸起分布相對(duì)均勻，均形成了超雙疏薄膜的粗糙微納米結(jié)構(gòu)。ZnO-PDMS薄膜表面的不規(guī)則凸起能夠包含空氣形成固- 氣- 固的空間結(jié)構(gòu)，當(dāng)液滴接觸到薄膜表面時(shí)，能夠形成一個(gè)立體三相接觸結(jié)構(gòu)，薄膜與液滴的接觸面積明顯減小[33]。此外，由于ZnO微納米粒子均勻分散于薄膜表面，使成功接枝到ZnO微納米粒子表面的改性劑非極性基團(tuán)均勻分布于薄膜表面，進(jìn)而使ZnO-PDMS薄膜的疏油性能增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的雙疏性能。由于各涂膜采用的改性ZnO微納米粒子形貌不同，其疏水疏油性能略有差異。

2.3 PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能分析

PDMS薄膜和ZnO-PDMS薄膜表面生物被膜菌生長(zhǎng)曲線見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各樣品薄膜表面被膜菌數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在0～2 h，細(xì)菌通過鞭毛接觸薄膜表面，進(jìn)入初始可逆黏附階段；在2～8 h，細(xì)菌數(shù)量繼續(xù)增加并通過分泌黏附蛋白緊密粘連在薄膜表面，此時(shí)生物被膜由可逆黏附階段轉(zhuǎn)化為不可逆黏附階段；在8～12 h，薄膜表面腐敗菌穩(wěn)定增長(zhǎng)，表明黏附的腐敗希瓦氏菌開始形成微菌落，生物被膜進(jìn)入生長(zhǎng)期；在12～24 h，薄膜表面被膜菌快速繁殖，細(xì)菌總量迅速增加，生物被膜進(jìn)入成熟期；在24～48 h，各樣品被膜菌總量均減少，生物被膜進(jìn)入衰退期。由于對(duì)照組PDMS薄膜中無任何抗菌成分，且表面親水親油，能夠充分被菌懸液浸潤(rùn)，為細(xì)菌提供充足的附著位點(diǎn)，有利于細(xì)菌的黏附及黏附后胞外基質(zhì)的分泌，形成的生物被膜對(duì)黏附的被膜菌有保護(hù)作用，故該薄膜表面的被膜活菌數(shù)量最多。ZnO-PDMS薄膜表面具有超雙疏性能，具有優(yōu)異的抗黏附能力，不利于被膜菌的初始黏附及生長(zhǎng)，薄膜表面初始黏附細(xì)菌數(shù)量較少，且被膜菌總數(shù)與薄膜的疏水疏油性能呈正相關(guān)，且花狀ZnO-PDMS薄膜表面初始細(xì)菌數(shù)最少。由于PDMS薄膜中的ZnO微納米粒子的抗菌有效成分向薄膜表面遷移需要一定的時(shí)間，不能立即殺滅與薄膜表面接觸或黏附的細(xì)菌[34]，在生物被膜形成的初始可逆黏附階段，ZnO-PDMS薄膜表面的被膜菌數(shù)量與PDMS薄膜差異不大，而在不可逆黏附階段至被膜成熟期，ZnO-PDMS薄膜表面的被膜菌數(shù)量顯著低于PDMS薄膜。在生物被膜的形成和成熟階段，隨著游離出的Zn2+數(shù)量逐漸增多并直接接觸細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞塌陷，內(nèi)容物流出，抑制細(xì)菌的進(jìn)一步增殖。在生物被膜衰退期，各樣品表面被膜活菌總數(shù)均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，是因?yàn)榇藭r(shí)存在大量的被膜菌，其中部分被膜老化脫落，并且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的消耗已經(jīng)不能滿足細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的需要，導(dǎo)致被膜菌因缺乏營(yíng)養(yǎng)而脫落和死亡。

圖4 PDMS薄膜和ZnO-PDMS薄膜表面 生物被膜菌生長(zhǎng)曲線

2.4 PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制機(jī)制分析

PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜表面生物被膜菌SEM分析見圖5。由圖5可知，在生物被膜培養(yǎng)至2 h時(shí)，少量游離菌黏附于薄膜表面，菌體表面光滑，無褶皺，形態(tài)完整。培養(yǎng)至12 h，薄膜表面的細(xì)菌數(shù)量增多，有胞外基質(zhì)分泌。PDMS薄膜表面的菌體完整，數(shù)量較多。ZnO-PDMS薄膜表面部分細(xì)菌的細(xì)胞膜出現(xiàn)褶皺，菌體表面附著較多顆粒狀物質(zhì)，可能是由于薄膜中Zn2+溶出，破壞并穿透細(xì)胞膜，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)變性和細(xì)胞增殖能力喪失，并破壞了菌體結(jié)構(gòu)[35]。培養(yǎng)至24 h，薄膜表面細(xì)菌數(shù)量繼續(xù)增多，PDMS薄膜表面的菌體仍完整，無被破壞的跡象。此時(shí)，ZnO-PDMS薄膜表面的不完整菌體增多，說明有大量被膜菌被殺死，這是薄膜中ZnO微納米粒子較強(qiáng)的抗菌作用的結(jié)果。培養(yǎng)至48 h，PDMS薄膜表面的菌體數(shù)量增多，有部分不完整菌體出現(xiàn)，這是由于生物被膜菌進(jìn)入衰退期，被膜菌生長(zhǎng)繁殖所需的養(yǎng)分不足。此時(shí)，ZnO-PDMS薄膜表面的大部分菌體呈破裂狀，說明生物被膜菌進(jìn)入衰退期，且薄膜中ZnO微納米粒子具有較強(qiáng)的抗菌性能，抑制了被膜菌的生長(zhǎng)繁殖。

圖5 PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜表面生物被膜菌SEM分析

PDMS和ZnO-PDMS薄膜表面生物被膜的CLSM分析見圖6。由圖6可知，PDMS薄膜表面的被膜菌中活菌最多，在生物被膜菌成熟期后開始有部分被膜菌死亡；至生物被膜菌衰退期，被膜菌死亡數(shù)量增多，但其中的活菌數(shù)量仍較大。ZnO-PDMS薄膜表面細(xì)菌的初始黏附量較少，且在生物被膜菌開始進(jìn)入生長(zhǎng)期時(shí)就有大量被膜菌死亡；在生物被膜菌衰退期，被膜菌數(shù)量增多，但活菌很少。其中花狀ZnO-PDMS薄膜表面被膜菌死菌比例最大，該結(jié)果與SEM分析結(jié)果一致。

綠色為活菌，紅色為死菌。

PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜表面生物被膜的生化指標(biāo)及抗菌、抗黏附機(jī)理見圖7。EPS是組成生物被膜的主要成分之一，因此，抑制EPS的分泌是控制生物被膜的關(guān)鍵之一。由圖7(a)～(c)可知，具有超雙疏性能和抗菌性能的ZnO-PDMS薄膜中腐敗希瓦氏菌的代謝活性、分泌的EPS和蛋白質(zhì)含量均低于PDMS薄膜，其中花狀ZnO-PDMS薄膜表面的各項(xiàng)指標(biāo)最低，說明其抗腐敗希瓦氏菌生物被膜的性能最強(qiáng)。由圖7(d)可見，在PDMS薄膜上，腐敗希瓦氏菌生物被膜菌ATP和AKP酶活性最高。棒狀、絨球狀和花狀ZnO-PDMS薄膜上生物被膜的ATP和AKP酶活性依次下降，表明ZnO微納米粒子的加入降低了腐敗希瓦氏菌生物被膜菌ATP和AKP酶活性，且其抑制能力與ZnO微納米粒子的微觀形貌有關(guān)，Babayevska等[36]同樣發(fā)現(xiàn)抑菌能力與ZnO的形態(tài)有關(guān)。這是由于薄膜中溶出的Zn2+破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜，進(jìn)入菌體，抑制了細(xì)菌的ATP和AKP酶活性，使其活性降低，破壞細(xì)菌的主動(dòng)運(yùn)輸和氨基酸代謝，從而使細(xì)菌的正常生理代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[37]。并且ZnO的抗菌能力和Zn2+含量有關(guān)，與棒狀和絨球狀的ZnO-PDMS相比，花狀ZnO顆粒及ZnO-PDMS薄膜表面具有更大的比表面積，更有利于Zn2+作為殺菌劑的溶出和釋放，因此，表現(xiàn)出最好的抗生物被膜活性[38]。

圖7 PDMS薄膜及ZnO-PDMS薄膜表面生物被膜的生化指標(biāo)及抗菌、抗黏附機(jī)理

3 結(jié) 論

將不同微觀形貌的ZnO微納米粒子與PDMS結(jié)合，成功制備了具有超雙疏性能的ZnO-PDMS薄膜。水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌——腐敗希瓦氏菌在超雙疏ZnO-PDMS薄膜表面的黏附能力下降，ZnO-PDMS薄膜緩釋Zn2+，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜并使菌體死亡。此外，ZnO-PDMS薄膜可以顯著抑制被膜菌的代謝活性，減少EPS和蛋白質(zhì)的分泌，并降低生物被膜內(nèi)被膜菌ATP和AKP酶活性。ZnO微納米粒子的微觀形貌影響ZnO-PDMS薄膜的疏水疏油性能和抗生物被膜性能，其中以花狀ZnO顆粒為改性劑的ZnO-PDMS薄膜具有超雙疏性能，且對(duì)腐敗希瓦氏菌的抗生物被膜效果較優(yōu)。本研究揭示了不同形貌ZnO對(duì)PDMS薄膜抗菌、抗黏附性能的影響機(jī)制，但還需要深入探究ZnO的抗菌途徑對(duì)PDMS薄膜抑制希瓦氏菌生物被膜性能的影響機(jī)制，在基因?qū)用娼馕鯬DMS薄膜的生物被膜抑制機(jī)制，并進(jìn)一步探究其食品保鮮性能。由于ZnO-PDMS超雙疏薄膜具有優(yōu)良的抗生物被膜性能，在抗菌、抗黏附領(lǐng)域具有良好的表現(xiàn)，有望應(yīng)用于食品的抗菌包裝及器械加工中。