石麗麗， 李 婷， 李昊澤， 曹學(xué)麗

(北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心/北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100048)

調(diào)制乳是以不低于80%的生牛(羊)乳或復(fù)原乳為主要原料，添加其他原料或食品添加劑或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，采用適當(dāng)?shù)臍⒕驕缇裙に囍瞥傻囊后w產(chǎn)品[1]。調(diào)制乳中含有脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、灰分，還有一些礦物質(zhì)、維生素、天然的酶類(lèi)等，還可以強(qiáng)化部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如鈣、鐵、鋅和維生素D等，使其含量高于純牛奶產(chǎn)品，滿(mǎn)足不同人群的多樣化需求。同時(shí)香精的加入也為產(chǎn)品賦予了不同風(fēng)味，市面上比較常見(jiàn)的是香蕉風(fēng)味、巧克力風(fēng)味和草莓風(fēng)味的調(diào)制乳。

食品用香精是指由食品用香料與食品用香精輔料組成的用來(lái)起香味作用的濃縮調(diào)配混合物[2]。香料，是一種能被嗅感嗅出氣味或味感品出香味的物質(zhì)，是用以調(diào)制香精的原料，分為天然香料和人造香料。香精在調(diào)制乳中使用普遍，可起到提供、補(bǔ)充、穩(wěn)定風(fēng)味的作用[3]，我國(guó)乳制品中香精的使用依據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行，可按生產(chǎn)需要適量添加，并無(wú)限量規(guī)定。由于其使用具有“自我限量”的特性，用量較低[4]，其安全性經(jīng)常被人們忽視。但是也有大量研究表明，一些香精成分如果大量使用或接觸是存在安全風(fēng)險(xiǎn)的[5-11]。

香精在調(diào)制乳中的添加情況十分普遍，除了奶味香精外，各種果味香精及其他多種香精的使用構(gòu)成眾多風(fēng)味的調(diào)制乳。但是目前關(guān)于調(diào)制乳中香精成分的含量及其安全性關(guān)注較少。前期本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)我國(guó)乳制品中常用香精的組成成分進(jìn)行分析，依據(jù)毒理學(xué)數(shù)據(jù)、檢出率及相對(duì)含量，共篩選出19種香精關(guān)注成分[12]。本研究首先采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法對(duì)市售調(diào)制乳樣品中的19種香精關(guān)注成分的含量進(jìn)行了大樣本量分析，然后基于對(duì)于不同人群調(diào)制乳日攝入量的調(diào)查結(jié)果，對(duì)其暴露水平和安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估。希望該研究對(duì)于了解我國(guó)調(diào)制乳中香精的使用現(xiàn)狀具有一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分：反-2-已烯醛、己酸烯丙酯、芳樟醇、4-萜烯醇和菠蘿酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.0%，2,3-丁二酮、乳酸乙酯、麥芽酚、乙基麥芽酚、鄰氨基苯甲酸甲酯、香蘭素和苯甲酸芐酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.0%，正己醇、苯甲醛、苯甲酸乙酯、乙酸芐酯、苯甲醇、苯乙醇和丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.5%，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于99.8%)，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

通過(guò)市場(chǎng)和網(wǎng)購(gòu)的方式采購(gòu)了25種乳制品品牌的共100個(gè)調(diào)制乳樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

PC- 420D型固相微萃取平臺(tái)，美國(guó)Corning公司；7890B- 7000C型氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent科技有限公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)型萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司；電子分析天平，DENVER公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1調(diào)制乳中香精關(guān)注成分的定量分析方法

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

取19種香精關(guān)注成分標(biāo)準(zhǔn)樣品分別用乙醇配制成一定濃度的單體標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋后，置于冰箱4 ℃貯存?zhèn)溆?。分析前，取一定體積的不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以一個(gè)本底干凈的不添加任何其他物質(zhì)的生牛乳樣品作為空白基質(zhì)，制備系列含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品。該生牛乳樣品經(jīng)SPME- GC- MS/MS(MRM)檢測(cè)，除含有少量的2,3-丁二酮和苯甲醛外，不含有其他目標(biāo)成分。少量的兩種成分在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和加標(biāo)回收率計(jì)算時(shí)進(jìn)行了折算。

1.3.1.2 樣品前處理方法

取1 g乳樣品，加4 g純凈水于15 mL頂空瓶?jī)?nèi)，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，旋緊裝有聚四氟乙烯/聚硅氧烷(PTFE/Silicone)蓋墊的螺紋蓋，置于固相微萃取平臺(tái)上。設(shè)置萃取溫度為60 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min，預(yù)熱攪拌平衡10 min；插入老化好的萃取頭，并保證纖維頭萃取部分距離液面1.5 cm；萃取50 min后取出，立即插入GC進(jìn)樣口(溫度250 ℃)，解析時(shí)間5 min。

1.3.1.3 GC- MS/MS分析條件

GC檢測(cè)方法。HP- INNOWAX型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)；恒流模式，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；不分流進(jìn)樣。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升至95 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，最后以6 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min。

MS/MS檢測(cè)方法。電子轟擊離子源(EI源)；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；輔助加熱區(qū)溫度250 ℃；電子能量70 eV；溶劑延遲5 min；質(zhì)譜掃描范圍(m/z)29～300 u；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下，19種香精關(guān)注成分的母、子離子對(duì)及碰撞電壓設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 MRM模式下調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分質(zhì)譜分析參數(shù)設(shè)置

1.3.1.4 定量分析方法

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。不同濃度的生牛乳基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法進(jìn)行分析，以平均峰面積為縱坐標(biāo)，以樣品中香精關(guān)注成分的濃度為橫坐標(biāo)，繪制19種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中19種成分的濃度以實(shí)際樣品中的含量為參照而定。

1.3.2調(diào)制乳中香精關(guān)注成分的暴露水平評(píng)估方法

首先采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所通過(guò)問(wèn)卷所得不同人群調(diào)制乳日攝入量的調(diào)查結(jié)果，調(diào)查人數(shù)2 121人，分兒童、女性組和男性組3組人群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別得到全人群人均日調(diào)制乳攝入量和3個(gè)不同人群人均日調(diào)制乳攝入量。

按式(1)計(jì)算香精關(guān)注成分的人均日攝入量(per capita daily intake，PCI)。

PCI=F×w。

(1)

式(1)中，PCI為香精成分人均日攝入量，μg/(人·d)；F為人均調(diào)制乳日攝入量，kg/(人·d)；w為香精成分測(cè)得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg。

1.3.3調(diào)制乳中香精關(guān)注成分的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

在暴露水平評(píng)估基礎(chǔ)上，依據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)進(jìn)行安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。TTC是將各物質(zhì)通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行評(píng)估和分類(lèi)，共分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)，其對(duì)應(yīng)3種不同的人體暴露閾值，分別為1 800、540、90 μg/(人·d)，當(dāng)某個(gè)物質(zhì)的人體暴露量低于該物質(zhì)的閾值時(shí)，認(rèn)為其可能產(chǎn)生的安全風(fēng)險(xiǎn)很低，無(wú)須對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。該方法是FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)、歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)、食品香料萃取物制造者協(xié)會(huì)(Flavour Extract Manufacturers’Association，F(xiàn)EMA)等機(jī)構(gòu)均采用的安全性評(píng)估方法[13-15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

調(diào)制乳樣品的分析中，每個(gè)樣品重復(fù)分析3次，采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

表2給出了調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、定性檢測(cè)限(LOD，3倍信噪比)、定量檢測(cè)限(LOQ，10倍信噪比)、日內(nèi)精密度(1 d之內(nèi)連續(xù)3次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)和日間精密度(連續(xù)3 d測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)。結(jié)果表明：19種關(guān)注成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2≥0.990 1)，日內(nèi)精密度小于等于9.03%，日間精密度小于等于9.90%。

表2 SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分的線性范圍、檢測(cè)限和精密度

以生牛乳樣品為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，向樣品中分別添加3個(gè)不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(低、中、高濃度范圍)，進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。方法平均回收率在86.48%～109.74%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在4.41%～8.55%。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果基本滿(mǎn)足定量分析要求，說(shuō)明利用SPME- GC- MS/MS(MRM)法對(duì)調(diào)制乳中香精關(guān)注成分進(jìn)行定量分析是可靠的。

表3 SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分的加標(biāo)回收率

續(xù)表3

2.2 調(diào)制乳中香精關(guān)注成分的定量分析結(jié)果

圖1展示了SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分混合標(biāo)準(zhǔn)樣品和某調(diào)制乳樣品的總離子流色譜圖。對(duì)25個(gè)品牌100個(gè)調(diào)制乳樣品中的19種香精關(guān)注成分的定量分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 100個(gè)市售調(diào)制乳樣品中19種香精關(guān)注成分的含量

圖中峰編號(hào)同表1。

通過(guò)對(duì)定量分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析可知：

1)19種關(guān)注成分中，檢出率最高的是苯甲醛和2,3-丁二酮，分別為100%和96%。苯甲醛和2,3-丁二酮是牛(羊)乳本身就含有的成分，在本研究中雖然無(wú)法分辨是本身含有還是后期添加或產(chǎn)生的，但與一些不加食用香精的純牛奶樣品相比，調(diào)制乳中這兩個(gè)物質(zhì)的含量要遠(yuǎn)高于純牛奶。其次，檢出率大于80%的有2個(gè)：芳樟醇(88%)和正己醇(86%)。

2)19種關(guān)注成分中，平均含量大于1 000 μg/kg的關(guān)注成分有4個(gè)：香蘭素(18 886.03 μg/kg)、乙基麥芽酚(6 271.15 μg/kg)、麥芽酚(2 522.64 μg/kg)和苯甲醇(1 937.60 μg/kg)。其檢出率分別是47%、71%、40%和30%。

3)從定量分析結(jié)果的數(shù)值上能夠看出香精成分在不同的樣品中的含量差異很大，即使相同口味的樣品，不同品牌之間也存在很大的差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些具有特征香氣的關(guān)注成分，在某些口味樣品中含量比較大，如苯甲醛在核桃口味的樣品中、己酸烯丙酯和菠蘿酯在香蕉和芒果口味的樣品中、苯乙醇在巧克力味的樣品中、丁香酚和乙酸芐酯在香蕉味樣品中、香蘭素在香草味和巧克力味樣品中含量較多。

2.3 調(diào)制乳中香精關(guān)注成分的暴露水平評(píng)估結(jié)果

表5為不同人群調(diào)制乳日攝入量問(wèn)卷調(diào)查的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將其分為兒童、女性組和男性組3組人群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)算全人群人均每日調(diào)制乳攝入量為46.253 g，人均體重為60.233 kg。據(jù)此計(jì)算香精關(guān)注成分的全人群人均攝入量(PCI)見(jiàn)表6。同理，可以依據(jù)不同人群的人均調(diào)制乳攝入量，計(jì)算不同人群的PCI，表7列出了不同人群的最大PCI值。

表5 不同人群調(diào)制乳日消費(fèi)量

表6 調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分全人群PCI及其與TTC的比較

2.4 調(diào)制乳中香精關(guān)注成分的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

將全人群的人均日攝入量PCI與TTC作對(duì)比，見(jiàn)表6，其中超出數(shù)為超出TTC的個(gè)數(shù)，超出率為超出數(shù)除以檢出數(shù)，表6中加粗部分?jǐn)?shù)據(jù)表示暴露量超出TTC。由表6可知，基于全人群人均每日調(diào)制乳攝入量為46.253 g進(jìn)行評(píng)估，本研究中的100個(gè)調(diào)制乳樣品中的香精關(guān)注成分，按平均PCI計(jì)算均小于對(duì)應(yīng)的毒理學(xué)關(guān)注閾值TTC，顯示無(wú)風(fēng)險(xiǎn)；按最大PCI計(jì)算，超出TTC的有4個(gè)，按超出率從高到低分別是乙基麥芽酚(16.90%)、香蘭素(12.77%)、麥芽酚(2.50%)和芳樟醇(1.44%)。

將不同人群的最大PCI[μg/(人·d)]與對(duì)應(yīng)的TTC[μg/(人·d)]比較，見(jiàn)表7。表8統(tǒng)計(jì)出了幾種超出TTC的香精關(guān)注成分在各人群中的情況。苯甲醇僅在男性60歲以上的人群分組中有3.3%的超出率；芳樟醇和麥芽酚分別在一些人群中有超出，超出率低于10.0%；乙基麥芽酚和香蘭素在所有消費(fèi)人群分組中均有超出情況，而且在男性60歲以上的消費(fèi)人群中的超出率最高(39.4%和31.9%)。提示以各人群的平均調(diào)制乳攝入量計(jì)算，某些人群存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，但是總體風(fēng)險(xiǎn)較低。

表7 調(diào)制乳中19種香精關(guān)注成分不同人群PCI及其與TTC的比較

表8 基于TTC的不同消費(fèi)人群的安全性評(píng)價(jià)

3 結(jié) 論

本研究采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法對(duì)25種品牌共100個(gè)調(diào)制乳樣品中的19種香精關(guān)注成分進(jìn)行了定量分析，并依據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值進(jìn)行了安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：19種關(guān)注成分中，檢出率最高的是苯甲醛和2,3-丁二酮，分別為100%和96%，其次是芳樟醇(88%)和正己醇(86%)。19種關(guān)注成分中，平均含量較高的有4種，分別是香蘭素(18 886.03 μg/kg)、乙基麥芽酚(6 271.15 μg/kg)、麥芽酚(2 522.64 μg/kg)、苯甲醇(1 937.60 μg/kg)，其檢出率分別是47%、71%、40%和30%。不同的樣品中的含量差異很大，相同口味不同品牌之間也存在很大的差異?；诙纠韺W(xué)關(guān)注閾值TTC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提示，按全人群的調(diào)制乳人均日攝入量計(jì)算PCI，香精關(guān)注成分的平均暴露水平PCI均小于對(duì)應(yīng)的毒理學(xué)關(guān)注閾值TTC，最大PCI超出TTC情況的有4個(gè)，超出率從高到低分別是乙基麥芽酚(16.90%)、香蘭素(12.77%)、麥芽酚(2.50%)、芳樟醇(1.44%)。按不同人群的調(diào)制乳人均日攝入量，計(jì)算各人群的最大PCI，乙基麥芽酚和香蘭素在所有消費(fèi)人群分組中均有超出情況，而且在男性60歲以上的消費(fèi)人群中的超出率最高(39.4%和31.9%)，此外，麥芽酚、芳樟醇和苯甲醇在一定人群中也有超出TTC的情況。全人群和不同人群的暴露分析均顯示，存在一定的乙基麥芽酚和香蘭素暴露風(fēng)險(xiǎn)，不同人群的風(fēng)險(xiǎn)不同，但總體安全風(fēng)險(xiǎn)較低。此外，本文的研究是基于一定數(shù)量的市售產(chǎn)品和一定范圍的消費(fèi)人群攝入量調(diào)查進(jìn)行的，評(píng)價(jià)結(jié)果具有一定參考價(jià)值。