肖志文， 胡 帥， 金雪玲， 陳紅兵， 武 涌

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室， 江西 南昌 330047；2.南昌大學 食品學院， 江西 南昌 330047；3.南昌大學 中德聯(lián)合研究院， 江西 南昌 330047；4.江西省農業(yè)科學院 農產(chǎn)品加工研究所， 江西 南昌 330200;5.南昌大學 第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科， 江西 南昌 330006)

腰果(AnacardiumoccidentaleLinn.)是被子植物門(Angiospermae)木蘭綱(Magnoliopsida)無患子目(Sapindales)漆樹科(Anacardiaceae)腰果屬(Anacardium)植物的果實，又稱槚如果。原產(chǎn)于西印度群島和巴西東北部，全球熱帶地區(qū)已廣泛引種栽培。腰果過敏是一種僅次于核桃過敏的常見堅果過敏，其全球發(fā)生率呈上升趨勢[1]。腰果在我國也是較為常見的致敏食物之一，研究表明腰果處于我國食入性過敏原的前3位[2-4]。腰果過敏臨床癥狀涉及多個器官或系統(tǒng)，根據(jù)國內早期的病例報道，腰果過敏患者多表現(xiàn)為過敏性休克、體溫下降、全身瘙癢、腹部疼痛及呼吸困難等，甚至有因腰果過敏死亡的案例[5]。

腰果中過敏原蛋白主要分為3類：7S豌豆球蛋白(Ana o 1)、11S豆球蛋白(Ana o 2)和2S白蛋白(Ana o 3)。這3種蛋白被歸類為種子貯藏蛋白[6]，且都屬于I類食物過敏原[7]。其中，腰果過敏原Ana o 3蛋白是分子質量為16.3 kDa的2S白蛋白，由5個α-螺旋組成，包含2個由半胱氨酸二硫鍵連接的亞基。國內外已圍繞腰果過敏原Ana o 3蛋白的純化進行了相關的研究。迄今為止，Reitsma等[8]通過多步硫酸銨沉淀結合超濾法分離出腰果過敏原Ana o 3蛋白，Mattison等[9]采用硫酸銨分級沉淀結合羥基磷灰石低壓色譜系統(tǒng)純化出腰果過敏原Ana o 3蛋白。然而，目前腰果過敏原Ana o 3蛋白分離純化的效果較低，且分離過程復雜，而僅通過陰離子交換層析高效純化出高純度的腰果過敏原Ana o 3蛋白尚未見報道。此外，通過腰果過敏原Ana o 3蛋白的氨基酸序列預測其理論等電點為5.68，與另外兩種過敏原的預測等電點相差較大，故采用弱陰離子交換層析純化腰果過敏原Ana o 3蛋白。

熱加工會使蛋白質發(fā)生變性，空間結構展開、內部疏水基團暴露，從而促進與其他物質的相互作用，生成各種高聚物和交聯(lián)產(chǎn)物[10]，最終導致構象型表位[11]、IgE結合表位和T細胞反應[12]發(fā)生變化。如烘焙處理會使花生過敏原Ara h 2蛋白的分子結構和核心表位發(fā)生改變[13]。目前的研究主要關注烘焙加工對腰果致敏性的影響，而對腰果主要過敏原Ana o 3蛋白的結構變化及熱穩(wěn)定性的研究相對較少。食品工業(yè)中腰果常用加工方法主要是先經(jīng)150 ℃加熱25～35 min以去除外殼，而后120 ℃或160 ℃烘焙20 min，或93 ℃逐漸增加至135 ℃緩慢油炸35～40 min[14]。因此研究腰果過敏原Ana o 3蛋白在160 ℃熱處理過程中的結構變化及穩(wěn)定性對研究腰果過敏具有重要意義。

本研究擬采用陰離子交換層析法開發(fā)一種腰果過敏原Ana o 3蛋白的高效分離純化的方法，并利用小分子蛋白電泳(Tricine-SDS- PAGE)、液相色譜- 串聯(lián)質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC- MS/MS)和免疫印跡(Western Blotting)技術對分離純化的腰果過敏原Ana o 3蛋白進行鑒定，同時探究在腰果常用加工160 ℃條件下對腰果過敏原Ana o 3蛋白結構的影響，旨在為腰果過敏原Ana o 3蛋白的分離純化及結構穩(wěn)定性、致敏性研究提供理論及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生腰果(已高壓蒸煮脫殼)，市售；人抗腰果過敏原Ana o 3蛋白的IgE單克隆抗體E- 2F5，美國INDOOR公司；低分子質量蛋白質Maker，美國Thermo公司；DEAE- Sepharose Fast Flow，美國GE公司；生物素標記的羊抗人IgE，美國Sigma公司；HRP標記的鏈霉親和素，欣博盛生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(2-amino-2-(hgdroxymethyl)-1,3-propanediol，Tris)、pH=7.2的磷酸鹽緩沖液、甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、過硫酸銨(ammonium persulphate，AP)、吐溫- 20(Tween-20)，北京索萊寶科技有限公司；四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)、增強型化學發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色液、40%儲液(丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺總質量分數(shù)為40%的水溶液)，上海生工科技公司；考馬斯亮藍R250，上海藍季科技發(fā)展有限公司；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜，美國PALL公司；氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉，西隴科學科技公司；封阻液，上海翌圣生物科技股份有限公司；3 kDa超濾管，德國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PHS- 3C型pH計，上海儀電科學儀器公司；1658004型迷你蛋白電泳儀、GS- 800型光密度掃描儀，美國Bio- Rad公司；Chemi XRQ型凝膠成像系統(tǒng)，美國Syngene公司；EPS- 601型電轉儀，美國GE公司；5804R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SCIENTZ- 10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白純化系統(tǒng)，上海青浦滬西儀器廠；MOS- 450/AF- CD型色譜儀，法國Biologic公司；UV WinLab型紫外分光光度計，美國Perkin Elmer公司。

1.3 實驗方法

1.3.1腰果粉的制備

取新鮮生腰果用高速粉碎機于液氮環(huán)境中粉碎至糊狀，稱取一定質量的腰果糊于燒杯中，以m(腰果糊)∶V(提取溶劑)=1 g∶10 mL的比例加入沸程為30～60 ℃石油醚脫脂6 h；然后于4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min去除上清液，沉淀物再次脫脂，離心后于通風櫥中自然干燥后即得脫脂腰果粉。脫脂腰果粉末于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2腰果粗蛋白的提取

稱取脫脂腰果粉，以m(脫脂腰果粉)∶V(提取溶劑)=1 g∶10 mL的比例加入pH=7.2的磷酸鹽緩沖液，在4 ℃條件下磁力攪拌12 h后，于4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液；取沉淀重復上述操作，合并兩次上清液。上清液于蒸餾水中透析(透析袋截留分子質量為6～8 kDa)，4 ℃磁力攪拌48 h，換液5次，透析完后經(jīng)冷凍干燥得到粗蛋白凍干粉。利用Bradford法測定蛋白濃度并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3蛋白質分子質量的測定

稱取36.3 g Tris和0.3 g SDS溶于85 mL超純水中，用鹽酸調至pH=8.45后定容為100 mL制成凝膠緩沖液；稱取1.0 g AP粉末溶解于10 mL超純水中配制成質量濃度為0.1 mg/mL的AP溶液；將3 000 μL凝膠緩沖液，3 750 μL 40%儲液，2 250 μL超純水，30 μL AP溶液，3 μL TEMED混勻后配制成質量分數(shù)為16.5%致密膠；將990 μL凝膠緩沖液，780 μL 40%儲液，960 μL超純水，99 μL AP溶液，1.5 μL TEMED混勻后配制成質量分數(shù)為10%夾層膠；將1 125 μL凝膠緩沖液，450 μL 40%儲液，2 745 μL超純水，30 μL AP溶液，3 μL TEMED混勻后配制成質量分數(shù)為16.5%濃縮膠；將50 mL甲醇、75 mL乙酸和875 mL超純水混勻配制成脫色液。

研究采用Tricine- SDS- PAGE電泳法測定蛋白質的分子質量。采用質量分數(shù)為16.5%致密膠，質量分數(shù)為10%夾層膠和質量分數(shù)為4%濃縮膠進行腰果過敏原Tricine- SDS- PAGE電泳分析，上樣量為10 μL，電泳條件為濃縮膠恒壓30 V，60 min；夾層膠和分離膠恒壓100 V，120 min。電泳結束后，膠塊用蒸餾水清洗5 min，固定液固定15 min，考馬斯亮藍染色15 min，而后用脫色液進行脫色過夜。次日以GS- 800型光密度掃描儀進行成像，并利用Quantity One軟件分析蛋白純度。

1.3.4腰果過敏原Ana o 3蛋白的分離純化

采用DEAE- Sepharose Fast Flow柱材進行弱陰離子交換層析以分離純化蛋白，層析柱內徑為1.6 cm，長度為30 cm。利用腰果過敏原Ana o 3蛋白的氨基酸序列預測其等電點約為5.68，為使蛋白質與樹脂的結合力強弱適中，緩沖體系pH值應與蛋白質的等電點相差一個單位，故選用pH值為6.8。用磷酸鹽緩沖液(將3.51 g十二水合磷酸氫二鈉和1.59 g二水合磷酸二氫鈉溶于2 000 mL蒸餾水配制成磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8的磷酸鹽緩沖液)平衡離子交換柱后，將腰果粗蛋白100 mg溶于5 mL平衡緩沖液后進行上樣，并用磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8)洗脫未結合蛋白，待基線平衡后，用含0.1～0.3 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8)連續(xù)梯度洗脫，洗脫速度為2 mL/min，280 nm處檢測紫外吸收峰，收集各洗脫峰。利用Bradford法測定蛋白含量并計算腰果過敏原Ana o 3蛋白的得率。

1.3.5腰果過敏原Ana o 3蛋白的質譜鑒定

將經(jīng)Tricine- SDS- PAGE電泳脫色后電泳膠上的目標條帶裁切下來，保存于超純水中送至上海中科新生命有限公司進行質譜鑒定。

1.3.6腰果過敏原Ana o 3蛋白的免疫印跡鑒定

稱取4.84 g Tris和58.48 g NaCl溶于850 mL超純水中，用鹽酸調至pH=7.5后定容為1 000 mL，而后向其中加入1 mL Tween 20，經(jīng)混勻后配制成洗滌緩沖液(tris-buffered saline and Tween 20，TBST)。

將Tricine- SDS- PAGE電泳未經(jīng)染色的電泳膠置于3層濾紙和NC膜中間，轉印程序設置如下：電壓為100 V，電流為400 mA，時間為1 h。轉印完成后將帶有蛋白的NC膜蛋白面朝上置于50 mL離心管中，加入10 mL封阻液于室溫封阻10 min，棄去封阻液后用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min；傾去TBST，將體積分數(shù)為0.01%的人抗腰果過敏原Ana o 3 蛋白的IgE單克隆抗體E- 2F5的TBST溶液(一抗)5 mL加入至離心管中，于4 ℃孵育12 h，孵育結束后棄去一抗，用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min；傾去TBST，將體積分數(shù)為0.02%的生物素標記羊抗人IgE的TBST溶液(二抗)12.5 mL加入至離心管中，于室溫孵育1 h，孵育結束后棄去二抗，用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min；用TBST按體積比為1∶60的比例稀釋HRP標記的鏈霉親和素稀釋液，傾去TBST，加入鏈霉親和素稀釋液10 mL于室溫孵育1 h，孵育結束后棄去鏈霉親和素稀釋液，用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min。洗滌結束后，轉移NC膜至化學發(fā)光成像儀，加入ECL顯色液，成像并保存結果。

1.3.7腰果過敏原Ana o 3蛋白的熱穩(wěn)定性測定

將分離純化所得的腰果過敏原Ana o 3蛋白溶液用3 kDa超濾管濃縮并除鹽，用Braford法測定蛋白濃度，然后用磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8)配制成質量濃度為0.2 mg/mL的蛋白溶液。取2 mL溶液裝在密封的耐高溫玻璃管中，置于160 ℃油浴中恒溫加熱10、15、20、25、30 min，加熱完成后置于冰水中冷卻備用。

采用圓二色光譜儀測定熱處理前后腰果過敏原Ana o 3蛋白的二級結構變化。樣品質量濃度為0.2 mg/mL，比色皿為1 mm厚，波長范圍為190～250 nm，速度為100 nm/min。

采用紫外分光光度計分析熱處理前后腰果過敏原Ana o 3蛋白空間結構變化。將樣品蛋白溶液稀釋成質量濃度為0.1 mg/mL，波長掃描范圍為210～350 nm，掃描速率中等。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗進行3次平行實驗并取平均值，圓二光譜數(shù)據(jù)用Dichroweb網(wǎng)站進行分析，紫外和圓二光譜結果由Origin 2019軟件繪圖，并采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件的單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.05)，表格用Excel軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 腰果粗蛋白電泳分析結果

生腰果經(jīng)低溫粉碎、脫脂、浸提、冷凍干燥等操作后獲得的腰果粗蛋白凍干粉，而后進行蛋白粗提物的Tricine- SDS- PAGE電泳分析，結果見圖1。研究表明2S白蛋白是低鹽濃度下的水溶性蛋白家族[7]，為減少其他蛋白的浸出，故采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液進行蛋白浸提。由圖1可知，腰果粗蛋白成分較為復雜，至少含11種蛋白成分，且大部分蛋白組分主要分布在10～80 kDa，粗蛋白中含量較高的蛋白條帶在10～15 kDa。此外，采用二次浸提方法可使原料利用率提高，且整個粗提過程始終處于低溫環(huán)境，可較大程度保留蛋白的天然活性。

圖1 腰果粗蛋白Tricine- SDS- PAGE電泳

2.2 腰果過敏原Ana o 3蛋白的分離純化結果

采用弱陰離子交換層析分離腰果過敏原Ana o 3蛋白純化峰型及電泳分析見圖2。腰果粗蛋白復溶后上樣，待未結合蛋白流出后，用0.1～0.3 mol/L NaCl洗脫液進行連續(xù)的線性梯度洗脫，流速為2 mL/min。結果表明：根據(jù)圖2(a)和圖2(b)，峰2為NaCl洗脫后的第一個峰，其在NaCl濃度為0.12 mol/L時被洗脫下來，該峰收集組分經(jīng)Tricine- SDS- PAGE電泳和飛行時間質譜(見圖3)檢測為腰果過敏原Ana o 3蛋白，其分子質量約為12.6 kDa，與Reitsma等[8]純化的腰果過敏原Ana o 3蛋白分子質量相同。用Quantity One軟件對比圖2(c)條帶灰度值，發(fā)現(xiàn)該條帶的純度在98%以上。此外，通過圖2(a)可知，2號峰為洗脫后的第一個峰，且整個2號峰的洗脫過程約為15 min，說明該純化方法簡單高效。

圖2 純化腰果過敏原Ana o 3蛋白Tricine- SDS- PAGE電泳分析結果

圖3 腰果過敏原Ana o 3蛋白飛行時間質譜

純化出的腰果過敏原Ana o 3蛋白的分子質量為12.6 kDa，與Uniprot上的16.3 kDa存在一定質量差異，主要原因是2S白蛋白是植物細胞液泡中經(jīng)蛋白水解后的小型球狀蛋白，其全長前體蛋白通常被裂解成由2個二硫鍵連接的大亞基和小亞基，并經(jīng)翻譯后加工，信號肽、短連接子和側翼序列被切除，產(chǎn)生較小的成熟產(chǎn)物[15]。此類現(xiàn)象在巴西堅果、芝麻、蓖麻等植物中也有同樣的體現(xiàn)，如巴西堅果的前體蛋白為15 kDa，但從其浸提物得到的成熟2S白蛋白僅有13 kDa[16]。

2.3 腰果過敏原Ana o 3蛋白的得率分析

參考Reitsma等[8]的純化計算公式，對分離純化的得率進行分析。生腰果中蛋白質含量約為19%～21%[17-18]，腰果過敏原Ana o 3蛋白占腰果蛋白的5%[19]。由于粗蛋白浸提時無法完全浸提生腰果中的蛋白，且采用低鹽提取粗蛋白后各組分的比重發(fā)生改變，故以1 g生腰果所含腰果過敏原Ana o 3蛋白為基準來計算腰果過敏原Ana o 3蛋白的得率，陰離子法分離得到腰果過敏原Ana o 3蛋白的含量及得率見表1。該陰離子交換法分離所得的腰果過敏原Ana o 3蛋白得率為25.36%，相比于Reitsma等[8]純化得率的3%具有大幅度提升。這是由于2次提取和低鹽浸提法可盡量收集腰果過敏原Ana o 3蛋白，而Reitsma的方法中大部分的腰果過敏原Ana o 3蛋白在樣品硫酸銨沉淀步驟中損失，從而導致較低的產(chǎn)率，由此可見在純化前的樣品處理中應盡量提高目的蛋白的含量。

表1 陰離子法分離得到的腰果過敏原Ana o 3蛋白的得率

2.4 腰果過敏原Ana o 3蛋白的質譜鑒定結果

研究采用胰蛋白酶對蛋白質樣品進行酶解，然后使用LC- MS/MS對酶解后的樣品進行鑒定，利用MASCOT等質譜匹配軟件對質譜數(shù)據(jù)進行分析，質譜鑒定的總離子流圖見圖4，肽段序列比對結果見表2，主要特征肽段的二級質譜圖及肽段序列展示見圖5。

峰標數(shù)值分別為出峰時間和分子離子峰質荷比

表2 腰果過敏原Ana o 3蛋白質譜鑒定肽段序列鑒定

圖5 腰果過敏原Ana o 3蛋白主要特征肽段的二級質譜及肽段序列

結果表明：本研究純化所得蛋白與腰果過敏原Ana o 3蛋白相匹配，匹配度為60%。該蛋白在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中的序列號是Q8H2B8，分子質量為16.3 kDa，匹配度為60%的原因也是腰果過敏原Ana o 3蛋白在成熟過程中會丟失信號肽、短連接子和側翼序列導致較小的成熟產(chǎn)物。結合Tricine- SDS- PAGE電泳鑒定目標蛋白的結果，LC- MS/MS鑒定進一步證實了陰離子法純化蛋白為腰果過敏原Ana o 3蛋白。

2.5 腰果過敏原Ana o 3蛋白的免疫印跡鑒定結果

對陰離子法純化所得的目標蛋白進行免疫印跡鑒定，結果見圖6。結果表明，與Tricine- SDS- PAGE電泳相對應的腰果過敏原Ana o 3蛋白組分的泳道在分子質量約12.6 kDa處出現(xiàn)單一的條帶，說明人抗腰果過敏原Ana o 3蛋白的IgE單克隆抗體能夠特異性識別腰果過敏原Ana o 3蛋白，并且在其他分子質量處無明顯的條帶，進一步證明本研究純化出的腰果過敏原Ana o 3蛋白純度較高。

圖6 腰果過敏原Ana o 3蛋白的Western Blotting分析

2.6 腰果過敏原Ana o 3蛋白的熱穩(wěn)定性分析

2.6.1熱處理對Ana o 3蛋白二級結構的影響

利用圓二光譜分析熱處理前后腰果過敏原Ana o 3蛋白的二級結構變化，結果見圖7和表3。由 圖7 可知，未經(jīng)熱處理的腰果過敏原Ana o 3蛋白光譜曲線在220 nm、209 nm處呈負峰，在193 nm附近有一正峰，說明未加熱腰果過敏原Ana o 3蛋白具有典型的α-螺旋結構[20]。隨著腰果過敏原Ana o 3蛋白處理時間的升高，雙負峰的峰值發(fā)生了稍許的紅移，峰值明顯減小，α-螺旋有解旋趨勢。表明α-螺旋構象比例下降，β-折疊構象比例增加。

圖7 熱處理不同時間腰果過敏原Ana o 3蛋白的 圓二色譜

從表3的數(shù)據(jù)可知，與未經(jīng)加熱的腰果過敏原Ana o 3蛋白相比，160 ℃條件下不同時間的加熱會使腰果過敏原Ana o 3蛋白的α-螺旋向其他二級結構轉化。此外，隨著時間的延長，α-螺旋含量降低，β-轉角含量變化較小，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量稍有增加。與未加熱腰果過敏原Ana o 3蛋白相比，在加熱25 min時無規(guī)則卷曲含量下降，分子結構更為有序，這可能是適當熱處理可使天然腰果過敏原Ana o 3蛋白向更穩(wěn)定的形態(tài)轉化。160 ℃加熱可使腰果過敏原Ana o 3蛋白的二級結構發(fā)生改變，但破壞程度較小，表明腰果過敏原Ana o 3蛋白的二級結構較為穩(wěn)定。

表3 熱處理不同時間腰果過敏原Ana o 3蛋白二級結構的含量

2.6.2熱處理對Ana o 3蛋白空間結構的影響

利用紫外光譜分析不同時間熱處理后腰果過敏原Ana o 3蛋白的空間結構變化，結果見圖8。天然腰果過敏原Ana o 3蛋白的紫外光譜圖在280 nm附近有特征吸收峰，主要是由蛋白肽鏈上色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環(huán)π→π*躍遷引起的[21]。所有樣品的特征吸收峰均在280 nm附近，未發(fā)生藍移或紅移，說明腰果過敏原Ana o 3蛋白的色氨酸和酪氨酸殘基的側鏈基團分布并未發(fā)生顯著變化。與未加熱樣品相比，加熱后特征吸收峰的吸光度升高,表明：加熱會使其變性，結構展開，將更多的色氨酸和酪氨酸殘基暴露，空間結構變得松散。隨著加熱時間的延長，特征吸收峰的吸光度整體趨勢逐漸升高，但加熱15 min的吸光度較未處理時有所下降，這可能是蛋白質分子發(fā)生自聚集，芳香族氨基酸殘基的包埋所致[22]。總體而言，加熱可使腰果過敏原Ana o 3蛋白分子展開，空間結構變得松散，芳香族氨基酸殘基暴露在分子表面，最終導致蛋白空間結構發(fā)生破壞。

圖8 熱處理不同時間腰果過敏原Ana o 3蛋白的紫外光譜

2.6.3熱處理對Ana o 3蛋白致敏性的影響

為明確不同時間熱處理后腰果過敏原Ana o 3蛋白的致敏性變化，對熱處理前后的樣品進行了電泳和免疫印跡分析，結果見圖9。從電泳圖可知，160 ℃加熱可導致腰果過敏原Ana o 3蛋白發(fā)生降解，并且隨著加熱時間的延長，降解程度也越高，這也印證了紫外結果中加熱會導致腰果過敏原Ana o 3蛋白的空間結構發(fā)生破壞。通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)160 ℃加熱后，腰果過敏原Ana o 3蛋白與商業(yè)化人抗腰果過敏原Ana o 3蛋白的IgE單克隆抗體的免疫活性喪失，表明：熱處理后空間結構的改變會導致構象型表位發(fā)生變化，且與商業(yè)化單抗結合的表位已被破壞[23]，但腰果過敏原Ana o 3蛋白降解的部分是否仍具有致敏性，需要結合腰果過敏原患者血清進行進一步的研究。結合電泳和免疫印跡結果表明：160 ℃的高溫加熱是降低腰果過敏原Ana o 3蛋白致敏性的潛在方法。

圖9 熱處理不同時間腰果過敏原Ana o 3蛋白的致敏性變化

3 結 論

本研究得到了一種以新鮮生腰果為原料的腰果過敏原Ana o 3蛋白的純化方法，得到的腰果過敏原Ana o 3蛋白的純度大于95%。腰果過敏原Ana o 3蛋白經(jīng)160 ℃加熱后，二級結構較為穩(wěn)定，但空間結構會發(fā)生較大破壞；此外熱處理后的腰果過敏原Ana o 3蛋白會發(fā)生降解，并且降解程度隨著加熱時間延長而增高，部分表位被破壞。160 ℃ 熱處理可作為降低腰果過敏原Ana o 3蛋白致敏性的潛在方式，但在致敏性評價中使用的是單克隆抗體，后續(xù)研究中可使用腰果過敏患者血清進行致敏性評價和進一步表征過敏原表位。希望本研究可為腰果過敏研究提供原材料和相關低致敏性腰果蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供理論與技術參考。