吳書(shū)東， 黃蘭英， 彭 建， 國(guó) 果， 修江帆， 吳建偉， 尚小麗*

(1.貴州省感染免疫與抗體工程特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410008)

0 引言

【研究意義】我國(guó)是世界上秸稈產(chǎn)出量最多的國(guó)家之一，僅農(nóng)作物秸稈的纖維產(chǎn)量高達(dá)2億t，對(duì)秸稈進(jìn)行資源化利用的關(guān)鍵要素是對(duì)其所含木質(zhì)纖維素的降解[1-2]。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了由纖維素和半纖維素組成的內(nèi)部纖維絲外，還有木質(zhì)素與半纖維素交聯(lián)在外部形成的保護(hù)屏障，從而嚴(yán)重阻礙木質(zhì)纖維素的增值利用[3]。利用生物酶可針對(duì)性地破壞植物細(xì)胞壁，使得胞內(nèi)的成分更容易降解，從而達(dá)到增加酶解糖化率的目的[4]。近年來(lái)，很多植食性昆蟲(chóng)因可以高效利用富含纖維素的植物作為能量來(lái)源，被視為挖掘新型高效木質(zhì)纖維素酶的重要研究對(duì)象[5]。家蠅(Muscadomestica)屬雙翅目(Diptera)蠅科(Muscidae)昆蟲(chóng)，其蠅蛆食性雜，能夠通過(guò)生物降解多種有機(jī)廢棄物，包括酒糟、秸稈等[6-7]。實(shí)現(xiàn)此過(guò)程首先需要支撐固定作用的包裹纖維素和半纖維素的木質(zhì)素水解[8]。漆酶(Laccase，Lac)屬多酚氧化酶，是木質(zhì)素降解酶系重要成員之一，能夠降解木質(zhì)素，使交聯(lián)其內(nèi)的纖維素和半纖維素充分暴露并最終促進(jìn)木質(zhì)纖維素的整體降解[9]。因此，對(duì)家蠅漆酶展開(kāi)研究意義重大。【前人研究進(jìn)展】漆酶屬于木質(zhì)素酶，是一種廣泛存在于植物、真菌、細(xì)菌和及昆蟲(chóng)體內(nèi)的含銅的多酚氧化酶[10]，來(lái)源不同的漆酶其功能不盡相同，其中，真菌產(chǎn)生的漆酶被認(rèn)為是自然環(huán)境中木質(zhì)素分解的重要環(huán)節(jié)之一[11]；植物源漆酶主要參與木質(zhì)素的合成[12]、抗蟲(chóng)、抗病[13]等；此外，現(xiàn)已有多種昆蟲(chóng)均被證實(shí)含內(nèi)源性漆酶，如煙草天蛾(Manducasexta)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)[14]、家蠶(Bombyxmori)[15]、果蠅(Drosophila)[16]、煙粉虱(Bemisiatabaci)[17]、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[18]、松墨天牛(Monochamusalternatus)[19]等，不同種類的昆蟲(chóng)其漆酶的組成不同，在昆蟲(chóng)各組織器官的分布和功能存在差異?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】貴州省感染免疫與抗體工程特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室尚小麗副教授課題小組，前期通過(guò)對(duì)NCBI家蠅基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，已篩選出被預(yù)測(cè)為家蠅漆酶基因的Lac基因，但尚未以家蠅漆酶為對(duì)象展開(kāi)相關(guān)研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆家蠅漆酶并獲得完整的cDNA序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析初步預(yù)測(cè)該cDNA序列的特性，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)漆酶2(Lac-2)基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及家蠅3齡幼蟲(chóng)脂肪體、唾液腺、前腸、中腸及后腸中的表達(dá)特征，為后續(xù)深入研究家蠅漆酶的生物學(xué)功能奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 家蠅(Muscadomestica)于貴州醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代繁殖，溫度28℃，相對(duì)濕度70%，光照周期12L∶12D。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 克隆質(zhì)粒pMD19-T、感受態(tài)細(xì)胞E.coli-DH5α均購(gòu)買于大連TaKaRa生物有限公司。

1.1.3 主要試劑 氯仿、異丙醇及無(wú)水乙醇等(成都金山試劑公司)，總RNA提取試劑TRIzol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、瓊脂糖、溴化乙啶(EB)溶液及甘油(Glycerol，貴州凱信生物科技有限責(zé)任公司)，2×Prime Taq、DNA marker DL 2 000和DEPC水(Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 家蠅總RNA的提取及cDNA的合成 根據(jù)RNAiso PLUS 的步驟提取家蠅3齡幼蟲(chóng)總RNA，通過(guò)電泳檢測(cè)和ND2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值、濃度，選擇A260/A280為1.8～2.0的樣品，并以1 μg總RNA作為模板按Takara試劑盒說(shuō)明書(shū)經(jīng)兩步法合成cDNA。

1.2.2Lac-2基因的cDNA序列克隆與測(cè)序 根據(jù)NCBI家蠅全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到家蠅Lac-2基因序列，以其cDNA序列為模板，使用DNA Club和Primer 5.0設(shè)計(jì)Lac-2基因cDNA序列的上下游克隆引物，引物序列為L(zhǎng)ac-F，5’-ATGTCAGTCAAGTGGAAAATAAATGTGC-3’；Lac-R，5’-ACGGAATGTATTGCCCTGCTG-3’。以反轉(zhuǎn)錄合成的家蠅cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系25 μL：2×Prime Taq 15 μL，上游和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性40 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行回收后與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化至E.coli-DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)平板培養(yǎng)(含氨芐)，挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將初步鑒定正確的單菌落送往公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序后比對(duì)得出Lac-2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.3 家蠅Lac-2基因的生物信息學(xué)分析 以1.2.2所獲基因序列為對(duì)象，利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System，ExPASy，http: / /ca. expasy. org /)提供的生物信息學(xué)工具分析家蠅Lac基因的特點(diǎn)；運(yùn)用NCBI Blast對(duì)基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，用ProtParam分析蛋白等電點(diǎn)、分子質(zhì)量；用ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性；用SigalP-5.0進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；用PBIL中的SOPMA分析二級(jí)結(jié)構(gòu)，Swiss-Model Workspace建模三維空間結(jié)構(gòu)；用Mega-X中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與基因擴(kuò)增 采用Primer 5. 0根據(jù)Lac-2的cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列如下：Lac-F，5’-TCCAGCTGATTGTGGTCCAA-3’；Lac-R，5’-TGGAAGGGATGCGACAAGT

T-3’；GAPDH-F，5’-GTCGTATTGGCCGTTTGGTT-3’；GAPDH-R，5’-GGGTGGAGTCGAATTTGAACA-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，59℃/60℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延伸30 s。

1.2.5 不同發(fā)育階段及3齡幼蟲(chóng)不同組織中Lac-2的表達(dá)分析 待qPCR反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real Time PCR 的擴(kuò)增曲線和融解曲線，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的CT值，采用比較 2-△△CT法，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同發(fā)育階段的結(jié)果以卵期作為參照，不同組織的以脂肪體為參照進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅Lac-2基因的PCR擴(kuò)增

以家蠅cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，Lac-2基因的全長(zhǎng)cDNA序列的PCR產(chǎn)物大小為885 bp(圖1)，與預(yù)期的Lac基因片段大小(885 bp)相符。將目的基因回收后連接到pMD19-T，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄序列一致，可用于下一步試驗(yàn)。

注：M為DL2000 DNA Marker，1為陰性對(duì)照，2為L(zhǎng)ac基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 家蠅Lac-2基因的生物信息學(xué)特征

2.2.1 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 由圖2可見(jiàn)，對(duì)測(cè)序獲得的Lac-2基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行分析顯示，該基因序列長(zhǎng)885 bp，編碼1個(gè)由294個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

注：圖中下劃線區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽。

2.2.2 序列比對(duì) 在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行氨基酸序列Blastp比對(duì)顯示，Lac-2具有Cu-oxidase_3這個(gè)典型的高度保守離子結(jié)構(gòu)域，位于168～245位氨基酸(圖3)，進(jìn)一步證明克隆的全長(zhǎng)cDNA序列為漆酶基因，屬銅藍(lán)氧化酶蛋白家族。

圖 3 家蠅Lac-2基因的序列比對(duì)

2.2.3 編碼蛋白的理化性質(zhì) 家蠅Lac-2成熟肽編碼蛋白的理論分子量為25 kDa，等電點(diǎn)為7.19。其成熟肽N端為纈氨酸時(shí)，家蠅Lac-2編碼蛋白在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為100 h，在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為43.37，大于域值40，在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定，總平均親水性(GRAVY)-0.333，ProtScaler對(duì)家蠅Lac-2編碼蛋白的疏水性分析表明，家蠅Lac-2蛋白為親水蛋白(圖4)。

圖 4 家蠅Lac-2編碼蛋白的疏水性

2.2.4 信號(hào)肽位點(diǎn) 通過(guò) SignalP-5.0 進(jìn)行信號(hào)肽分析，家蠅Lac-2基因編碼蛋白具有信號(hào)肽，信號(hào)肽位置在第1～26位氨基酸(圖5)。

圖 5 家蠅Lac-2編碼的信號(hào)肽

2.2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu) 從圖6可知，家蠅Lac-2基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α-螺旋，11.90%；β-折疊，19.33%；β-轉(zhuǎn)角，7.06%；無(wú)規(guī)卷曲，61.71%。

圖 6 家蠅Lac-2編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu) 如圖7所示，家蠅Lac-2蛋白含α-螺旋、β-折疊，并通過(guò)不規(guī)則卷曲相連。

圖 7 家蠅Lac-2編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 從包括家蠅Lac-2在內(nèi)的20種昆蟲(chóng)Lac基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖8)可知，家蠅Lac-2與廄螫蠅(Stomoxyscalcitrans)的Lac-2(XP 013106835.1)、柑橘小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)的Lac-1(XP 011203333.1)及地中海實(shí)蠅(Ceratitiscapitata)的Lac-1(XP 004520735.2)的遺傳距離最小。

圖 8 昆蟲(chóng)Lac基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 Lac-2基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

由圖9可見(jiàn)，以家蠅GAPDH為內(nèi)參基因，以卵期作為參照，Lac-2基因在家蠅整個(gè)發(fā)育歷期呈先升高后降低趨勢(shì)，3齡幼蟲(chóng)中Lac-2的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，各發(fā)育階段Lac-2表達(dá)量整體趨勢(shì)為3日齡幼蟲(chóng)>蛹期>2日齡幼蟲(chóng)>1日齡幼蟲(chóng)>成蟲(chóng)>卵。

注：圖柱上方不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

2.4 Lac-2在家蠅3齡幼蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)

以家蠅GAPDH為內(nèi)參基因，以脂肪體為參照，發(fā)現(xiàn)家蠅Lac-2基因主要在消化道中表達(dá)，其中，腸表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，各組織Lac-2表達(dá)量為中腸>唾液腺>后腸>前腸>脂肪體(圖10)。

圖 10 家蠅Lac-2基因在3齡幼蟲(chóng)不同組織的表達(dá)差異

3 討論

家蠅是一種分布廣泛的資源昆蟲(chóng)，在復(fù)雜孽生環(huán)境中能夠?qū)⑸锝斩掝愑袡C(jī)廢棄物有效降解[19]，使其質(zhì)地變松軟，為自身的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量和養(yǎng)分，原因在于家蠅體內(nèi)具有能夠降解木質(zhì)纖維素的一系列內(nèi)源性木質(zhì)纖維素酶。本研究以富含木質(zhì)纖維素的高粱秸稈飼料飼養(yǎng)家蠅幼蟲(chóng)，激活幼蟲(chóng)體內(nèi)木質(zhì)素酶基因的高效表達(dá)。成功克隆家蠅木質(zhì)素酶Lac-2生物信息學(xué)分析表明，其具有Cu-oxidase_3這個(gè)典型的高度保守離子結(jié)構(gòu)域，位于168～245位氨基酸，且具有昆蟲(chóng)漆酶特有的C-X-R-X-C結(jié)構(gòu)，與其他昆蟲(chóng)的Lac基因全長(zhǎng)cDNA比較發(fā)現(xiàn)，家蠅Lac-2與親緣關(guān)系較近的物種廄螫蠅、柑橘小實(shí)蠅及地中海實(shí)蠅的同源性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的關(guān)系比較近，說(shuō)明克隆的基因確為家蠅漆酶基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析初步預(yù)測(cè)家蠅Lac-2基因編碼蛋白的特性，為該基因重組表達(dá)和酶功能深入研究奠定基礎(chǔ)。

目前，已有研究表明不同種類的昆蟲(chóng)所含漆酶不同，其功能及組織表達(dá)也存在差異[20]，如黑尾葉蟬的NcLac-1僅表達(dá)于唾液腺，該酶在昆蟲(chóng)體內(nèi)主要參與植物次生酚類物質(zhì)的降解[21]；煙粉虱MEAM1的Lac-1在取食能力較強(qiáng)的若蟲(chóng)期及成蟲(chóng)期表達(dá)量較高，在中腸中也遠(yuǎn)高于其他組織，說(shuō)明其在食物消化中有重要作用[13]；具備強(qiáng)木質(zhì)纖維素降解能力的白蟻，其Lac-1較中腸及后腸高于唾液腺及前腸[22]；亞洲玉米螟的Lac-1于成蟲(chóng)期表達(dá)量最高，主要在馬氏管、中腸、表皮及氣管中，推測(cè)其可能參與代謝或免疫；亞洲玉米螟的Lac-2在預(yù)蛹期表達(dá)量最高，主要存在于中腸、絲腺、氣管及表皮中，認(rèn)為該酶參與昆蟲(chóng)的蛻皮過(guò)程，參與表皮褐化。為進(jìn)一步探明克隆家蠅Lac-2在體內(nèi)的具體功能，以富含木質(zhì)纖維素的純高粱飼養(yǎng)家蠅，在家蠅不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和3齡幼蟲(chóng)不同組織中檢測(cè)Lac-2基因的表達(dá)差異表明，Lac-2基因在3齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量最高，由于家蠅是完全變態(tài)昆蟲(chóng)，其蛻皮過(guò)程發(fā)生于1齡及2齡期，本研究發(fā)現(xiàn)Lac-2基因在3齡表達(dá)更高，推測(cè)其與家蠅蛻皮無(wú)關(guān)，但可能參與家蠅生長(zhǎng)發(fā)育中化蛹活動(dòng)的調(diào)控；同時(shí)，組織表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，該基因主要表達(dá)于消化道的中腸、唾液腺及后腸，推測(cè)家蠅Lac-2可能是在食物消化中發(fā)揮作用。后續(xù)將通過(guò)家蠅Lac-2基因原核重組蛋白功能和RNAi等方法進(jìn)一步對(duì)該基因功能進(jìn)行深入探究。

4 結(jié)論

成功克隆得到家蠅Lac-2基因，其cDNA序列全長(zhǎng)為885 bp，編碼269個(gè)氨基酸，成熟肽編碼蛋白的理論分子量為25 kDa，等電點(diǎn)為7.19。Lac-2基因在家蠅3齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量最高，在中腸表達(dá)水平最高，其次是唾液腺及后腸。推測(cè)Lac-2基因可能參與家蠅生長(zhǎng)發(fā)育與食物消化，為深入研究家蠅Lac-2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。