劉晏汝，張建偉，包遠(yuǎn)遠(yuǎn)，林先貴，馮有智*

區(qū)域尺度下水稻土微生物群落對(duì)施肥的一致響應(yīng)①

劉晏汝1,2，張建偉1,2，包遠(yuǎn)遠(yuǎn)1,2，林先貴1,2，馮有智1,2*

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

揭示土壤微生物響應(yīng)有助于評(píng)估田間管理措施對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性的影響，但區(qū)域尺度下的指示物種尚不明確。本研究以我國(guó)亞熱帶區(qū)的6個(gè)野外試驗(yàn)站為研究對(duì)象，探究長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥和有機(jī)無(wú)機(jī)配施對(duì)水稻土微生物的影響。研究首先通過(guò)降噪排除由地理分異引起的土壤微生物群落差異，隨后分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施肥因增加土壤全氮、有效磷以及有機(jī)質(zhì)含量，使得土壤微生物群落發(fā)生一致變化，門水平上主要增加了綠彎菌(Chloroflexi)、變形菌(Proteobacteria)、酸桿菌(Acidobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospira)和綠菌(Chlorobi)的相對(duì)豐度。與化肥相比，有機(jī)無(wú)機(jī)配施進(jìn)一步增加了與大分子有機(jī)物轉(zhuǎn)化相關(guān)以及喜好富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的物種，即β-變形菌(β-Proteobacteria)、厭氧繩菌(Anaerobes)、褐藻菌(Ignavibacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)和厚壁菌(Firmicutes)。

水稻土；施肥；指示物種；農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性

施肥、耕作和灌溉等管理措施影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤化學(xué)性質(zhì)、物理結(jié)構(gòu)和生物特性，從而支持和維系農(nóng)業(yè)生態(tài)功能和服務(wù)[1]。微生物占有農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中一大部分的生物量，參與幾乎所有的土壤過(guò)程，直接或間接地影響土壤養(yǎng)分循環(huán)、土壤肥力和作物產(chǎn)量[2]。因此微生物群落的變化，特別是指示物種(主要指顯著增加或者降低的物種)可以反映農(nóng)田土壤對(duì)管理措施的動(dòng)態(tài)響應(yīng)和反饋[3]。過(guò)去10年中，大量工作研究了施肥對(duì)農(nóng)田土壤微生物群落的影響。研究發(fā)現(xiàn)，施肥通過(guò)改變土壤理化性質(zhì)，例如增加養(yǎng)分或外源碳輸入改變土壤微生物群落和功能[4]。長(zhǎng)期不施肥的土壤微生物群落以寡營(yíng)養(yǎng)型偏好物種為主，群落功能多樣但分散，而施肥后的土壤具有更多降解復(fù)雜有機(jī)質(zhì)的微生物，如酸桿菌(Acidobacteria)和厚壁菌(Firmicutes)[2]。此外，不同位點(diǎn)的施肥指示微生物不同。位于江西南昌的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施用無(wú)機(jī)肥后顯著增加放線菌(Actinobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、變形菌(Proteobacteria)，而有機(jī)無(wú)機(jī)配施后厚壁菌、變形菌、擬桿菌(Bacteroides)、己科河菌(Rokubacteria)和綠彎菌顯著增加[5]。位于封丘的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施用無(wú)機(jī)肥會(huì)引起少數(shù)微生物豐度的劇烈波動(dòng)，施用有機(jī)肥對(duì)多數(shù)微生物的影響更為溫和，其中酸桿菌、擬桿菌、厚壁菌和變形菌是施有機(jī)肥后的主要響應(yīng)物種，只有擬桿菌在施用無(wú)機(jī)肥后顯著增加[6]。

目前對(duì)施肥響應(yīng)微生物的研究多在單一田塊尺度下展開(kāi)，由于土壤微生物較強(qiáng)的地理學(xué)分布特征，導(dǎo)致施肥的指示物種存在爭(zhēng)議，需要整合的、跨站點(diǎn)的試驗(yàn)調(diào)查土壤微生物對(duì)施肥響應(yīng)的共性，以更全面地了解土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能如何隨著農(nóng)田管理措施而變化，并找出具有指導(dǎo)意義的指示物種。研究表明，雖然跨位點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu)差異巨大，但養(yǎng)分添加會(huì)引發(fā)全球草地生態(tài)系統(tǒng)微生物的一致響應(yīng)，其中富營(yíng)養(yǎng)型微生物因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)和代謝功能多樣而快速生長(zhǎng)和富集[7]。此外，施肥會(huì)降低區(qū)域尺度下微生物群落的beta多樣性[8]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，存在于不同位點(diǎn)的微生物對(duì)施肥的響應(yīng)一致，盡管這樣的微生物數(shù)量較少[9]。以上信息暗示了大空間尺度下施肥會(huì)引起微生物群落中特定物種(指示物種)的規(guī)律性響應(yīng)。但是，也要認(rèn)識(shí)到區(qū)域尺度下地理位置對(duì)微生物群落的影響大于施肥[8]，即空間分異引起的微生物群落差異會(huì)干擾對(duì)施肥指示微生物的識(shí)別。因此，在闡明區(qū)域尺度下農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落對(duì)施肥的一致響應(yīng)并找出相應(yīng)的指示物種之前，需要降低地理分異導(dǎo)致的微生物群落差異。

基于此目的，本研究以中國(guó)亞熱帶地區(qū)的6個(gè)農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)位點(diǎn)的水稻土為對(duì)象，在每個(gè)位點(diǎn)開(kāi)展多年大田施肥試驗(yàn)，施肥處理包括CK(不施肥料)、NPK(施用含氮磷鉀的礦質(zhì)肥料)和OMN(施用有機(jī)肥+氮磷鉀肥料)。這6個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)覆蓋了廣闊的地理區(qū)域，有助于在區(qū)域尺度上了解農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中不同施肥策略下的微生物特性。研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)在得到原始微生物群落數(shù)據(jù)后，篩去帶有地理特征的物種，保留不同處理下6個(gè)位點(diǎn)普遍存在的微生物，隨后通過(guò)與不施肥處理的土壤微生物群落進(jìn)行比較，以識(shí)別兩種施肥策略下響應(yīng)微生物群落及其變化與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系。通過(guò)比較我國(guó)亞熱帶區(qū)多個(gè)長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)土壤細(xì)菌群落，有助于識(shí)別區(qū)域尺度下2種典型施肥措施下的指示物種，以更好地利用和調(diào)控微生物來(lái)服務(wù)和指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從中國(guó)亞熱帶地區(qū)的6個(gè)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站采集土壤樣品，6個(gè)站點(diǎn)的具體描述見(jiàn)表1。試驗(yàn)點(diǎn)跨越約1 000 km，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)都有一個(gè)施肥小區(qū)試驗(yàn)，設(shè)置3種處理：CK(不施肥料)、NPK(施用含氮磷鉀的礦質(zhì)肥料)和OMN(施用有機(jī)肥+氮磷鉀肥料)，各處理詳細(xì)信息見(jiàn)表2。樣品于2014年水稻收獲后采集，每個(gè)位點(diǎn)3種處理分別采集3個(gè)重復(fù)樣本，6個(gè)位點(diǎn)共54個(gè)樣品。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干以去除過(guò)多水分。隨后用凍存管取樣分裝并保存于–20℃冰箱中用于提取土壤細(xì)菌基因組DNA，剩余樣品完全風(fēng)干并過(guò)篩用于測(cè)定土壤基本性質(zhì)。

表1 6個(gè)野外試驗(yàn)位點(diǎn)的信息描述

1.2 土壤基本性質(zhì)測(cè)定

土壤pH由土水質(zhì)量比1∶2.5浸提，pH計(jì)(Thermo，USA)測(cè)定[10]；土壤全氮(TN)用凱氏定氮法測(cè)定；土壤全磷(TP)和全鉀(TK)先用氫氟酸–高氯酸消煮，然后分別用鉬藍(lán)比色法和火焰光度法測(cè)定；土壤有效氮(AN)采用2 mol/L KCl提取，流動(dòng)分析儀測(cè)定；土壤有效磷(AP)采用0.5 mol/L NaHCO3提取，鉬藍(lán)比色法測(cè)定；土壤速效鉀(AK)由乙酸銨提取，由火焰光度法測(cè)定。

1.3 土壤可溶性有機(jī)質(zhì)含量和組分測(cè)定

稱取10.00 g新鮮土壤與100 ml蒸餾水(土水質(zhì)量比1∶10)混合進(jìn)行可溶性有機(jī)質(zhì)的提取，用超聲波振蕩儀振蕩2 h后轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，靜置后停止萃取，取出上清液過(guò)0.45 μm濾膜，濾液分為兩份，一份測(cè)定濃度，另一份進(jìn)行傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜測(cè)定可溶性有機(jī)質(zhì)組分[11]。在本研究中，可溶性有機(jī)質(zhì)被分為8個(gè)主要家族：脂質(zhì)(0

表2 6個(gè)試驗(yàn)位點(diǎn)不同處理的施肥情況

1.4 土壤DNA提取

土壤樣品DNA依照土壤基因組DNA提取試劑盒(MP Biochemicals, Solon, OH, USA)使用步驟提取。提取的基因組DNA溶解于50 μl TE(tris-EDTA)緩沖液中，并用分光光度計(jì)定量和凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。之后，采用核酸定量?jī)x NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)對(duì)DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.5 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

本研究使用引物519F(3′-CAGCMGCCGCGGT AATWC-5′)和907R(3′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT T-5′) 對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4 ～ V5可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物3′端加入5 bp已知堿基序列的分類標(biāo)簽(Barcode) 以區(qū)分不同樣品。50 μl PCR體系包括：1.25 μmol/L的dNTP，2 μl (15 μmol/L)正向和反向引物，2 μmol/L TaqDNA聚合酶(TaKaRa, Japan)和1 μl (50 ng)的DNA模板。所有樣品擴(kuò)增3份后混合檢測(cè)以消除PCR過(guò)程中的偏好性和隨機(jī)性誤差，陰性對(duì)照以無(wú)菌水代替DNA模板。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s)，最后72℃延長(zhǎng)10 min。所有PCR產(chǎn)物均通過(guò)1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行條帶特異性檢測(cè)。使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)純化試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用NanoDrop ND-2000測(cè)定產(chǎn)物濃度。將不同樣品的PCR產(chǎn)物按照等摩爾原則進(jìn)行混合，使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。16S rRNA測(cè)序基因序列使用Quantitati-ve Insights Into Microbial Ecology(QIIME)平臺(tái)進(jìn)行分析。質(zhì)量低于25、長(zhǎng)度小于200 bp的序列被去除，并根據(jù)Barcode序列與樣品進(jìn)行匹配。使用 Usearch算法按照97% 的相似性對(duì)序列進(jìn)行聚類并進(jìn)行嵌合體去除，將樣品劃分為不同的OTU(操作分類單元)，其中每個(gè)OTU中豐度最高的序列被選作代表序列。物種注釋選擇SILVA 119 database(http://www.arbsilva.de/download/archive/ qiime/)數(shù)據(jù)庫(kù)。將所有樣品的序列統(tǒng)一抽平到5 370條以便于后續(xù)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基于Bray-Curtis距離的非度量多緯尺度分析(NMDS)用以展示群落結(jié)構(gòu)差異，置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA)用以檢驗(yàn)群落結(jié)構(gòu)差異顯著性，PERMDISP(多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析)用以展示群落內(nèi)離散程度。使用R軟件vegan包進(jìn)行以上分析。利用R軟件中的DEseq2包篩選兩種施肥策略與不施肥對(duì)照相比差異表達(dá)的物種，即響應(yīng)物種，其閾值設(shè)定為| log2(fold change)|>0和校正后的≤0.05，log2(fold change)>0和≤0.05表示物種顯著富集，log2(fold change)<0和≤0.05表示物種顯著下降。利用冗余分析(redundancy analysis，RDA)進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析，揭示驅(qū)動(dòng)群落結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子。方差分析(ANOVA)用于處理間土壤理化性質(zhì)和有機(jī)組分差異分析，使用SPSS16.0計(jì)算。本文所有統(tǒng)計(jì)分析顯著和極顯著水平分別為<0.05和<0.01。

2 結(jié)果分析

2.1 物種過(guò)濾

研究發(fā)現(xiàn)，區(qū)域尺度下地理分異是引起微生物群落差異的主要原因，施肥對(duì)微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的影響不顯著[8]。但對(duì)6個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在其中4個(gè)位點(diǎn)(鷹潭、常熟、惠州和桂林)施肥對(duì)微生物群落有顯著影響(表3)，說(shuō)明地理分異導(dǎo)致的微生物群落差異會(huì)掩蓋施肥對(duì)微生物群落的影響。因此，在數(shù)據(jù)分析前，本研究利用過(guò)濾OTU的方法減少由地理分異引起的位點(diǎn)間細(xì)菌群落的巨大噪音，并挑選出不同處理下6個(gè)位點(diǎn)共同存在的物種。通過(guò)排除不同施肥處理下6個(gè)位點(diǎn)≥50% 樣本(9/18)中OTU豐度≤3的稀少物種，過(guò)濾得到區(qū)域尺度下各處理普遍存在的微生物，并把它們定義為“共有微生物”。降噪后得到CK處理下159個(gè)共有OTU，NPK處理下203個(gè)共有OTU，OMN處理下211個(gè)共有OTU。

表3 PERMANOVA展示區(qū)域和局域尺度下3種處理間水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(Bray-Curtis距離)的差異

注：*和**分別表示在<0.05和<0.01水平3種處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

2.2 不同施肥策略下水稻土細(xì)菌群落變化

如圖1A所示，過(guò)濾后各樣本的微生物群落和過(guò)濾前各樣本的微生物群落具有極強(qiáng)的相關(guān)性(=0.97,<0.01)，說(shuō)明過(guò)濾后的物種可以代表各個(gè)樣本的主要信息。PERMANOVA結(jié)果顯示(圖1B和表3)，過(guò)濾后不同施肥策略下水稻土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在極顯著差異(<0.01)。因此，過(guò)濾后的微生物可以作為區(qū)域尺度下不同施肥策略中普遍存在且關(guān)鍵的物種。PERMDISP結(jié)果顯示，過(guò)濾后OMN處理組內(nèi)物種離散程度最小，其次是NPK處理，而CK處理最大(OMN(0.317 3)

圖1 基于Bray-Curtis距離的過(guò)濾物種(263種OTU)與原始物種(5 370種OTU)的β多樣性(群落不相似性)關(guān)系(A)，及過(guò)濾微生物基于Bray-Curtis距離的NMDS分析(B)

如圖2所示，過(guò)濾后2種施肥處理，特別是無(wú)機(jī)肥配施有機(jī)肥后，多位點(diǎn)共有OTU比長(zhǎng)期不施肥處理多(OMN(211)>NPK(203)>CK(159))。3種處理都存在的共有OTU有122個(gè)。CK處理特有17個(gè)OTU，NPK處理特有21個(gè)OTU，以及OMN處理特有37個(gè)OTU，說(shuō)明施肥，特別是有機(jī)無(wú)機(jī)配施后區(qū)域尺度下特異性共有物種增加。

2.3 不同施肥策略下顯著變化的水稻土微生物物種

為了探明長(zhǎng)期施肥對(duì)微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的具體變化，對(duì)過(guò)濾后的微生物相對(duì)豐度進(jìn)行差異分析，結(jié)果如圖3A ～ 3C所示。與CK處理相比，NPK處理顯著富集67種OTU，顯著減少24種OTU；OMN處理顯著富集88種OTU，顯著減少37種OTU。此外，與NPK處理相比，OMN處理顯著富集45種OTU，顯著減少36種OTU。

對(duì)這些顯著富集的OTU進(jìn)行門水平上的統(tǒng)計(jì)(圖4A)，發(fā)現(xiàn)施肥均顯著富集綠彎菌(Chloroflexi)、變形菌(Proteobacteria)、酸桿菌(Acidobacteria)、綠菌(Chlorobi)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、藍(lán)菌(Cyanobacteria)、芽單胞菌(Gemmatimonadetes)、浮霉菌(Planctomycetes)、擬桿菌(Bacteroidetes)。其中，綠彎菌、變形菌、酸桿菌、綠菌、硝化螺旋菌是主要的富集類群，分別占NPK處理和OMN處理下富集微生物的79.41% 和80.66%。NPK處理下這5種細(xì)菌門相對(duì)豐度排序?yàn)榫G彎菌>變形菌>酸桿菌>綠菌>硝化螺旋菌，但OMN處理的排序?yàn)樽冃尉?綠彎菌>酸桿菌>硝化螺旋菌>綠菌。進(jìn)一步在更高的分辨率下識(shí)別不同施肥處理的響應(yīng)物種，施肥尤其是OMN處理下顯著富集的綠彎菌以厭氧繩菌(Anaerolineae)為主 (圖4B)。施肥顯著富集的變形菌以δ-變形菌(Gammaproteobacteria)和β-變形菌(Betaproteobacteria)為主，NPK處理富集的δ-變形菌最多，但OMN處理下富集的β-變形菌最多 (圖4C)。施肥尤其是OMN處理下顯著富集的酸桿菌門以酸桿菌綱(Acidobacteria)為主(圖4D)。施肥顯著富集的綠菌門以綠菌綱(Chlorobia)和褐藻菌綱(Ignavibacteria)為主，且OMN處理的褐藻菌相對(duì)豐度更高 (圖4E)。在兩種施肥策略下富集的硝化螺旋菌都屬于硝化螺旋菌綱(Nitrospira)，且OMN處理下富集數(shù)量和比例更多(圖4F)。此外，OMN處理的擬桿菌富集程度明顯高于NPK處理(圖4G)，厚壁菌是其特有的富集門類(圖4H)。

圖2 過(guò)濾后各處理OTU個(gè)數(shù)韋恩圖

(圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)OTU，高于中軸線(y=0)的為顯著富集的OTU，低于中軸線的為顯著減少的OTU，中軸線附近的為差異不顯著的OTU。圖A：與CK相比，NPK處理下顯著富集和減少的微生物；圖B：與CK相比，OMN處理下顯著富集和減少的微生物；圖C：與NPK相比，OMN處理下顯著富集和減少的微生物)

2.4 施肥引起的土壤化學(xué)性質(zhì)變化與響應(yīng)物種的關(guān)系

將差異分析得到的施肥響應(yīng)微生物與土壤化學(xué)性質(zhì)以及有機(jī)質(zhì)組分進(jìn)行RDA分析，以探明三者的相關(guān)性，結(jié)果如圖5A所示。不同處理下的響應(yīng)微生物各自聚集在一起，并在主坐標(biāo)1 (RDA1) 上明顯分開(kāi)，其中NPK處理和OMN處理的微生物群落分離程度較小。不同處理下的響應(yīng)微生物群落與土壤性質(zhì)和有機(jī)質(zhì)組分呈現(xiàn)不一樣的關(guān)系，全氮、有效磷、有機(jī)質(zhì)、縮合烴含量以及pH與響應(yīng)微生物群落相對(duì)豐度的相關(guān)性最強(qiáng)：施肥后土壤全氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)含量與兩個(gè)施肥處理的響應(yīng)微生物群落相對(duì)豐度呈正相關(guān)，縮合烴含量、pH與長(zhǎng)期不施肥處理土壤中的微生物群落相對(duì)豐度呈正相關(guān)。對(duì)5種影響因子的總體(圖5B)和單個(gè)位點(diǎn)(表4和表5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)全氮、有效磷、有機(jī)質(zhì)含量在施肥后尤其是有機(jī)無(wú)機(jī)配施后增加，而縮合烴含量、pH在施肥后有降低的趨勢(shì)。盡管惠州站點(diǎn)的土壤有效磷含量在施肥后降低和進(jìn)賢、鷹潭站點(diǎn)的土壤pH在施肥后略微升高，但不影響總體趨勢(shì)。

3 討論

3.1 施肥降低水稻土細(xì)菌群落的空間變異

種庫(kù)假說(shuō)認(rèn)為，一個(gè)地區(qū)的群落組成受到區(qū)域種庫(kù)的限制，區(qū)域種庫(kù)由地質(zhì)歷史過(guò)程、物種形成、遷移擴(kuò)散和消亡等決定，因此群落組成一般具有特定的地理分布格局[12]。處于不同地理位置的微生物群落因種庫(kù)差異存在難以忽視的不同。本研究的過(guò)濾方法即意在減小這種不同。雖然可能造成樣本微生物群落部分信息損失，如在某些位點(diǎn)相對(duì)豐度高且對(duì)施肥敏感的物種可能因別的位點(diǎn)不存在或者稀少而被排除在外，但降噪處理后的水稻土細(xì)菌群落與原始群落具有顯著且強(qiáng)烈的相關(guān)性(圖1A)，說(shuō)明本研究對(duì)微生物群落的信息提取是可靠的。降噪處理后分別得到3種處理下6個(gè)位點(diǎn)普遍存在的細(xì)菌群落，且這些群落存在顯著差異(圖1B和表3)，說(shuō)明施肥會(huì)引起特定微生物的響應(yīng)。揭示這些微生物對(duì)施肥的響應(yīng)有助于揭示施肥策略與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)系。

NMDS圖和PERMDISP結(jié)果均表明，與不施肥處理相比，施肥后6個(gè)位點(diǎn)的水稻土細(xì)菌群落更為聚集，施肥尤其是有機(jī)無(wú)機(jī)配施可降低水稻土細(xì)菌群落的空間變異。不同施肥處理過(guò)濾得到的共有微生物數(shù)量不一致，施肥尤其是有機(jī)無(wú)機(jī)配施可增加位點(diǎn)間共有物種(圖2)，意味著施肥后尤其是有機(jī)無(wú)機(jī)配施可刺激同種微生物[8]，進(jìn)而增加了多樣性。在3種處理中都存在的共有微生物(122個(gè)OTU)占據(jù)總過(guò)濾微生物的46.39%，這部分微生物作為核心微生物在不同處理下普遍存在，可能與維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的基本功能有關(guān)。

(A：門水平下顯著富集的細(xì)菌組成；B、C、D、E、F、G、H：綱水平下富集的綠彎菌、變形菌、酸桿菌、綠菌、硝化螺旋菌、擬桿菌、厚壁菌物種組成)

(柱圖上方不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05))

表4 6個(gè)試驗(yàn)位點(diǎn)不同處理下土壤基本理化性質(zhì)

3.2 區(qū)域尺度下水稻土響應(yīng)微生物與土壤化學(xué)性質(zhì)和有機(jī)質(zhì)組分的關(guān)系

5種門類微生物在施肥后顯著富集(圖4A)，意味著區(qū)域尺度下施肥會(huì)引起微生物群落一致的響應(yīng)。這些微生物的變化與土壤養(yǎng)分狀況以及有機(jī)質(zhì)組分的變化有關(guān)(圖5)。一方面，施肥通過(guò)改善養(yǎng)分條件影響微生物群落組成。施肥尤其是無(wú)機(jī)肥配施有機(jī)肥后土壤中氮、磷養(yǎng)分充足(圖5B和表4)，吸引偏好富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的微生物生長(zhǎng)并積極發(fā)揮生態(tài)功能，β-變形菌、硝化螺旋菌等微生物大量富集(圖4C和4F)。另一方面，施肥通過(guò)改變有機(jī)質(zhì)含量和組分影響微生物群落組成(圖5B和表5)，良好的有機(jī)質(zhì)分配比例促進(jìn)微生物群落生長(zhǎng)代謝和功能維持，如厭氧繩菌、褐藻菌在配施有機(jī)肥后顯著富集(圖4B和4E)。縮合烴是土壤有機(jī)質(zhì)中的一種熱穩(wěn)定化合物，性質(zhì)穩(wěn)定不易被微生物降解和利用[13]，在長(zhǎng)期不施肥的土壤中相對(duì)比例不斷提高(表5)。施肥后，尤其是有機(jī)無(wú)機(jī)配施后水稻土縮合烴相對(duì)含量不斷降低，這可能有兩個(gè)原因。其一，由于有機(jī)肥自帶有機(jī)質(zhì)，添加進(jìn)土壤后會(huì)改變有機(jī)質(zhì)結(jié)構(gòu)，難降解有機(jī)質(zhì)相對(duì)比例降低；其二，施肥富集的微生物可發(fā)揮多種降解功能，加強(qiáng)了對(duì)難降解組分的利用，有機(jī)質(zhì)組分進(jìn)一步得到平衡。因此，施肥，特別是施用有機(jī)肥通過(guò)影響土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分導(dǎo)致微生物群落的一致變化。

土壤pH可對(duì)微生物群落產(chǎn)生強(qiáng)烈影響，常被視為細(xì)菌群落組成的良好預(yù)測(cè)因子[14]。本研究中pH雖然不是首要預(yù)測(cè)因子，但施肥后土壤pH下降(圖5B和表4)，可能是酸桿菌在施肥后顯著富集的原因[15]。擬桿菌、變形菌等微生物與pH相關(guān)性并無(wú)準(zhǔn)確定論[16]，說(shuō)明單一因子并不能完全解釋土壤細(xì)菌群落的變化。綜上，不同微生物對(duì)不同土壤性質(zhì)的敏感度不同，是土壤性質(zhì)的特定變化以及變化幅度而不一定是施肥本身可能更好地預(yù)測(cè)特定景觀中微生物群落組成的變化[15]，這是不同施肥后微生物群落變化的原因，可能也是不同環(huán)境條件下同種施肥策略研究結(jié)論不一致的原因，同時(shí)也說(shuō)明了大尺度研究的必要性。

3.3 區(qū)域尺度下響應(yīng)施肥的水稻土指示物種

區(qū)域尺度下，微生物對(duì)施肥的響應(yīng)存在一致規(guī)律。在門水平上，兩種施肥策略下富集的微生物主要是綠彎菌、變形菌、酸桿菌、綠菌和硝化螺旋菌(圖4A)，可作為水稻土對(duì)施肥響應(yīng)的指示微生物。但在更高分辨率的分類水平上，兩種施肥策略的響應(yīng)微生物存在差異(圖4B ～ 4H)。有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理下，β-變形菌、酸桿菌、硝化螺旋菌富集程度更高(圖4C)，這與施肥導(dǎo)致土壤化學(xué)性質(zhì)變化有關(guān)。變形菌是水稻土的優(yōu)勢(shì)菌群之一[17-18]，β-變形菌對(duì)富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境十分敏感，養(yǎng)分充足時(shí)會(huì)大量生長(zhǎng)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，酸桿菌相對(duì)豐度和土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[15]，這與本研究施肥后水稻土pH呈下降趨勢(shì)的結(jié)論一致(圖5B和表4)。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，一些酸桿菌亞群(Acidobacteria Gp4和Gp6)在有機(jī)碳含量高的土壤中非常豐富[20]，這可能是有機(jī)無(wú)機(jī)配施富集酸桿菌程度更高的原因。硝化螺旋菌在土壤亞硝酸鹽氧化過(guò)程中起重要作用[21]，有機(jī)無(wú)機(jī)配施的土壤氮有效性增加幅度更高(圖5B和表4)，有助于硝化螺旋菌大量繁殖，進(jìn)而提高氮素的轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)氮元素在土壤與作物間的循環(huán)和流通。褐藻菌和厭氧繩菌在有機(jī)無(wú)機(jī)配施下增加更為明顯(圖4B和4E)，它們的響應(yīng)可能與土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究有機(jī)肥中秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素(表2)，可誘導(dǎo)褐藻菌和厭氧繩菌分泌纖維素酶、半纖維素酶、碳水化合物酯酶和多糖裂解酶[22-23]，促進(jìn)纖維素降解等有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。擬桿菌和厚壁菌是有機(jī)無(wú)機(jī)配施后顯著富集的特定微生物(圖4G和4H)，除了能在富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中快速生長(zhǎng)[24]，它們還參與多種代謝途徑促進(jìn)有機(jī)質(zhì)降解[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施用田間污泥后，土壤中擬桿菌和厚壁菌與抗性基因增加具有顯著相關(guān)性[26]。通過(guò)分泌抗生素抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，擬桿菌和厚壁菌有助于健康土壤系統(tǒng)的形成和維持[27]，可以作為健康土壤的指示微生物。這兩類微生物的增加有利于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展，說(shuō)明有機(jī)無(wú)機(jī)配施是環(huán)境友好型的田間管理措施。

4 結(jié)論

在過(guò)濾排除土壤微生物自身地理學(xué)分布引起的變異度后，本研究系統(tǒng)評(píng)估了區(qū)域尺度下不同施肥對(duì)水稻土細(xì)菌群落的影響。研究發(fā)現(xiàn)，區(qū)域尺度下水稻土細(xì)菌群落對(duì)施肥策略具有一致的響應(yīng)規(guī)律。長(zhǎng)期施肥可增加土壤全氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)含量，使得不同位點(diǎn)的土壤微生物群落發(fā)生趨于一致的變化，指示微生物綠彎菌、變形菌、酸桿菌、硝化螺旋菌和綠菌的相對(duì)豐度顯著增加。有機(jī)無(wú)機(jī)配施進(jìn)一步增加了與有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)以及富營(yíng)養(yǎng)型的β-變形菌、厭氧繩菌、褐藻菌、擬桿菌和厚壁菌。這些指示微生物在土壤性質(zhì)改善和土壤生態(tài)保持方面發(fā)揮積極的功能，它們的豐度和多樣性影響碳循環(huán)、氮循環(huán)過(guò)程和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，尤其有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理下，特定的指示微生物擬桿菌、厚壁菌對(duì)維持土壤健康有重要的積極意義。

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Convergent Responses of Paddy Soil Microbial Community to Fertilization at Regional Scale

LIU Yanru1,2, ZHANG Jianwei1,2, BAO Yuanyuan1,2, LIN Xiangui1,2, FENG Youzhi1,2*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Revealing soil microbial responses is helpful to guide field management practices, whichis promising to promote the sustainability of farmland ecosystems. But the indicator species at theregional scale are unclear. In this study, six paddy experiment sites spanning across subtropical China were used to investigate the effects of long-term application of chemical fertilizer and chemical fertilizer plus organic fertilizer on soil microbial community. The inconsistent of microbial species caused by soil geographical distribution were firstly denoted. After that, paddy soil microbial community shifted in a consistent manner with nutrient addition. Long-term fertilization increased soil total nitrogen, available phosphorus and organic matter contents, which changed soil microbial community, mainly increasing relative abundance of Chloroflexi, Proteobacteria, Acidobacteria, Nitrospira and Chlorobi. Compared with chemical fertilizer, chemical fertilizer plus organic fertilizer application further increased the species that are associated with macromolecular organic matter conversion and that mostly belong to copiotrophic bacterial taxa, such as β-Proteobacteria, Anaerobes, Ignavibacteria, Bacteroidetes and Firmicutes.

Paddy soil; Fertilization; Indicator species; Farmland ecosystem sustainability

S154.1；S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.05.013

劉晏汝，張建偉，包遠(yuǎn)遠(yuǎn), 等. 區(qū)域尺度下水稻土微生物群落對(duì)施肥的一致響應(yīng). 土壤, 2022, 54(5): 968–977.

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (42177297)資助。

(yzfeng@issas.ac.cn)

劉晏汝(1998—)，女，四川宜賓人，碩士研究生，主要從事土壤微生物群落變化研究。Email：liuyanru@issas.ac.cn