蘇星源，吳世杰，高 威,2，馬君玲，解宏圖，鮑雪蓮，王連峰*

兩種水分含量下生物質(zhì)炭對黑土N2O排放及硝化反硝化基因豐度的影響①

蘇星源1，吳世杰1，高 威1,2，馬君玲1，解宏圖3，鮑雪蓮3，王連峰1*

(1 大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116028；2 中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；3 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016)

以吉林省梨樹縣典型黑土為研究對象，通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究了不同土壤水分含量(40%WHC和100%WHC)下，生物質(zhì)炭種類(玉米秸稈生物質(zhì)炭和稻殼生物質(zhì)炭)和施加量(0%、1%、4%，/))對黑土N2O排放及硝化反硝化功能基因豐度的影響。結(jié)果表明：隨著秸稈生物質(zhì)炭施加量的增加，土壤N2O排放呈下降趨勢，4% 高量秸稈生物質(zhì)炭添加下，土壤N2O排放量僅為1% 低量添加下的33.9%。同時(shí)土壤NO–3-N含量也表現(xiàn)出一致性規(guī)律，4% 高量生物質(zhì)炭添加下土壤NO–3-N含量顯著低于1% 低量生物質(zhì)炭添加。在100%WHC土壤水分狀況下，玉米秸稈生物質(zhì)炭顯著增加了土壤N2O排放，而稻殼生物質(zhì)炭則顯著降低了土壤N2O排放。高土壤水分顯著促進(jìn)了土壤N2O排放，進(jìn)一步為實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果所證實(shí)，高土壤水分通過增加基因豐度進(jìn)而促進(jìn)了土壤反硝化作用過程，而4% 高量稻殼生物質(zhì)炭添加下基因豐度顯著高于玉米秸稈生物質(zhì)炭添加，表現(xiàn)出更強(qiáng)的N2O還原潛力。盡管-AOA基因豐度在不同生物質(zhì)炭添加量下并未發(fā)生顯著變化，但-AOB基因豐度在高量玉米秸稈生物質(zhì)炭添加下顯著下降。土壤水分含量和生物質(zhì)炭種類及其添加量通過影響土壤硝化反硝化微生物，進(jìn)而影響土壤N2O排放。

東北黑土；土壤水分；生物質(zhì)炭；N2O排放；硝化反硝化基因

氧化亞氮(N2O)作為主要溫室氣體之一[1]，其在百年尺度上的增溫潛勢為CO2的265倍[2]。農(nóng)田土壤是N2O重要的排放源[3]，農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的N2O排放量占陸地生態(tài)系統(tǒng)總N2O排放量的65%[4]。黑土作為“耕地中的大熊貓”，其在保障區(qū)域生態(tài)環(huán)境安全、國家糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為了追求作物高產(chǎn)而長期過量施用氮肥，進(jìn)而引發(fā)了一系列環(huán)境問題，如溫室氣體N2O大量排放等。在全球碳中和的背景下，實(shí)現(xiàn)溫室氣體減排對生態(tài)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

水分是調(diào)控土壤N2O排放的重要因子。土壤水分通過影響土壤透氣性和微生物活性，進(jìn)而影響土壤N2O產(chǎn)排[5]。前期的研究表明，土壤水分含量的增加顯著刺激了酸性土壤N2O的排放[6]。Szukics等[7]也發(fā)現(xiàn)，反硝化細(xì)菌受土壤水分影響顯著，在濕潤的土壤環(huán)境中反硝化細(xì)菌響應(yīng)劇烈，其豐度快速上升。反硝化微生物同時(shí)受土壤碳底物調(diào)控，而生物質(zhì)炭作為典型的高碳氮比有機(jī)物料，可以為微生物提供充足的碳底物，促進(jìn)微生物對土壤氮的固定，從而直接或間接地影響硝化反硝化作用和土壤N2O產(chǎn)排。例如，Taghizadeh-Toosi等[8]將生物質(zhì)炭(30 t/hm2)施入牧場中，土壤N2O排放量減少了近70%。生物質(zhì)炭具有多孔、強(qiáng)陽離子交換能力、高化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)[9]，施用高孔隙度、高比表面積的生物質(zhì)炭，可以吸附土壤無機(jī)氮(NH4+和NO–3)，從而影響土壤N2O產(chǎn)排過程[10-11]。然而，目前生物質(zhì)炭對土壤N2O產(chǎn)排的影響尚未得到一致性結(jié)論，生物質(zhì)炭添加表現(xiàn)出促進(jìn)[12-13]、抑制[14]或不顯著[15]作用，這種差異可能是水分、碳底物等環(huán)境因子與微生物共同作用的結(jié)果。例如，向原位棕壤撒施玉米秸稈生物質(zhì)炭顯著降低了土壤N2O排放[16]，但是水分因素并未被考慮。向菜地施加生物質(zhì)炭顯著提高了-AOB基因豐度[17]，但是其對N2O產(chǎn)排的影響效應(yīng)并不清楚。因此，迫切需要開展不同水分狀況下生物質(zhì)炭對黑土N2O產(chǎn)排的影響效應(yīng)研究。

生物質(zhì)炭對土壤N2O排放影響研究大多為單獨(dú)添加生物質(zhì)炭或者單獨(dú)研究不同水分調(diào)控，很少涉及不同水分狀況下生物質(zhì)炭對N2O排放影響的綜合效應(yīng)。本文以東北黑土為研究對象，通過設(shè)置不同類型和不同量生物質(zhì)炭添加，并調(diào)控兩種土壤水分含量(40%和100% 田間持水量(WHC))，采用室內(nèi)培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)技術(shù)，研究黑土N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的變化，探討不同水分模式下生物質(zhì)炭對黑土N2O產(chǎn)排及相關(guān)功能基因豐度的影響效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和生物質(zhì)炭

供試土壤采自吉林省四平市梨樹縣高家村中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所保護(hù)性耕作研發(fā)基地(43°18′ N，124°19′ E)。該地屬北溫帶半濕潤大陸季風(fēng)性氣候，四季分明，雨熱同季，作物生長期日照、降水較充足，年平均氣溫6.9 ℃，年平均降水量614 mm，年均日照時(shí)數(shù)2 644.2 h，其中作物生長季節(jié)4—9月日照時(shí)數(shù)1 435.5 h，占全年日照總時(shí)數(shù)59%，無霜期150 d左右。試驗(yàn)土壤采自深度為0 ～ 20 cm的耕層土壤，置于陰涼干燥通風(fēng)的環(huán)境下風(fēng)干至土壤基本保持恒重，取出一部分土樣過2 mm篩后用于試驗(yàn)。該土樣基本理化性質(zhì)如下：pH 7.37、有機(jī)質(zhì)14.3 g/kg、全氮1.42 g/kg、全磷0.64 g/kg和容重1.35 g/cm3。試驗(yàn)所用生物質(zhì)炭分別以玉米秸稈、稻殼為原料，經(jīng)機(jī)械研磨后過1 mm篩，并于500 ℃管式爐高溫?zé)峤庵频?，生物質(zhì)炭所含基本元素占比見表1。

表1 生物質(zhì)炭基本元素含量占比(%)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，包括：①未施生物質(zhì)炭+100%WHC(W2)；②1%(/)玉米秸稈生物質(zhì)炭+100%WHC(1%MB+W2)；③4%(/)玉米秸稈生物質(zhì)炭+100%WHC(4%MB+W2)；④4%(/)稻殼生物質(zhì)炭+100%WHC(4%RB+W2)；⑤4%(/)玉米秸稈生物質(zhì)炭+40%WHC(4%MB+W1)。其中，生物質(zhì)炭的添加比例表示培養(yǎng)瓶中生物質(zhì)炭質(zhì)量與土壤和生物質(zhì)炭混合后總質(zhì)量(25 g)之比。例如，1% 和4% 生物質(zhì)炭添加量分別為10.10 mg/g和41.67 mg/g。將生物質(zhì)炭和土壤按照設(shè)定比例添加到120 ml已滅菌的玻璃血清瓶中，添加碳酸氫銨和硝酸鉀混合溶液使土壤中NH4+-N、NO–3-N初始含量為50 mg/kg(干土)，并調(diào)節(jié)含水量至設(shè)定值。用瓶塞、鋁箔外加封口膜壓實(shí)密封，防止瓶內(nèi)氣體擴(kuò)散，并于25℃恒溫箱中培養(yǎng)4周，每周進(jìn)行破壞性取樣。取樣后，一部分土壤樣品用2 mol/LKCl浸提，立即測定NH4+-N和NO–3-N含量，另一部分樣品保存于–80 ℃冰箱，用于DNA提取。培養(yǎng)過程中動(dòng)態(tài)測定N2O排放，表征土壤硝化和反硝化活性，氣體采集測定時(shí)間為培養(yǎng)開始后1、2、3、5、8、10、13、15、17、19和22 d。取一支針筒注射器，采氣前抽吸空氣3次，然后插入瓶內(nèi)，上下抽吸3次混勻培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體，再抽取5 ml氣體緩緩注入氣相色譜進(jìn)樣口(進(jìn)樣口安裝帶橡膠墊封口的螺絲帽)。在培養(yǎng)期間每天固定時(shí)間打開培養(yǎng)瓶換氣30 min刷新氣體條件，并每隔2 d用稱重法及時(shí)補(bǔ)充去離子水，以保持土壤含水量恒定。

1.3 土壤理化和生物指標(biāo)測定

土壤含水量的測定采用烘干法，田間持水量(WHC)的測定采用環(huán)刀法[18]，NH4+-N含量測定采用KCl浸提–納氏試劑分光光度法，NO–3-N含量測定采用KCl浸提–紫外分光光度法。采用安捷倫氣相色譜儀(Agilent 7890A)測定N2O樣品濃度，電子捕獲檢測器(ECD)溫度為300 ℃，柱箱溫度60 ℃，載氣為高純氮?dú)鈁19]，流速為25 ml/min。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)依次檢測-AOA、-AOB、和基因拷貝數(shù)，之后用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，在CFX Connect Real-time PCR Detection System上進(jìn)行定量PCR的分析，PCR擴(kuò)增的引物和反應(yīng)條件如表2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用含有目標(biāo)基因的克隆進(jìn)行制備，將含有目標(biāo)基因的克隆在液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，使用 Mini BEST Plas mid Purification Kit(Takara)試劑盒提取質(zhì)粒并純化，通過測定DNA濃度結(jié)合其分子質(zhì)量計(jì)算得出原始基因拷貝數(shù)，將質(zhì)粒連續(xù)稀釋8 ～ 10個(gè)數(shù)量級(jí)，得到相應(yīng)目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

表2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的引物和反應(yīng)條件

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

N2O排放通量()按下式計(jì)算：

式中：為N2O排放通量(μg/(kg·h))；為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O的密度，為1.25 kg/m3；為培養(yǎng)瓶中氣體的有效空間(m3)；為培養(yǎng)瓶內(nèi)烘干土的質(zhì)量(kg)；/為在一特定時(shí)間內(nèi)N2O濃度變化速率；為測定氣體時(shí)的溫度(℃)。

N2O累積排放量()按下式計(jì)算：

=Σ(F1+F)/2×(t1–t)×24 (2)

式中：為N2O累積排放量(μg/kg)；為氣體排放通量(μg/(kg·h))；為采樣次數(shù)，為采樣時(shí)間(d)。

文中試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)處理分析采用Microsoft Excel 2019和SPSS 21軟件進(jìn)行，利用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤N2O排放的動(dòng)態(tài)變化特征

土壤水分增加在一定程度上促進(jìn)了土壤N2O的排放。然而隨著秸稈生物質(zhì)炭添加量的增加，土壤N2O排放量呈現(xiàn)下降趨勢，但不同類型生物質(zhì)炭添加展現(xiàn)出不同的N2O排放特征。培養(yǎng)期內(nèi)，4%MB+W1處理的N2O排放通量與累積排放量均顯著低于其他4種處理(<0.01)，其N2O累積排放量僅為4%MB+ W2處理的1.2%(圖1B)。與W2處理相比，4%RB+W2處理的N2O排放通量較低并呈現(xiàn)下降趨勢(圖1A)，且其N2O累積排放量顯著降低，達(dá)到68.1%。1%MB+W2和4%MB+W2處理均在培養(yǎng)2 d時(shí)出現(xiàn)N2O排放峰并明顯高于W2處理，分別為2 354.5和827.7 μg/(kg·h)，之后迅速降低。這兩組處理的N2O累積排放量也均高于W2處理，但4%MB+W2處理N2O累積排放量顯著低于1%MB+W2處理(<0.05)。在培養(yǎng)5 d以后，各處理N2O排放通量均維持在極低水平(< 5 μg/(kg·h))。方差分析進(jìn)一步表明，土壤含水量、生物質(zhì)炭種類、施加量及其交互作用均顯著影響N2O排放通量與累積排放量(<0.01)。

2.2 土壤無機(jī)氮含量的動(dòng)態(tài)變化特征

高水分狀況下(100%WHC)土壤NO–3-N含量較低，且添加秸稈生物質(zhì)炭處理NO–3-N含量在開始培養(yǎng)一周內(nèi)迅速下降至極低水平(<15 mg/kg)。本試驗(yàn)中，土壤NO–3-N含量在培養(yǎng)第1周顯著下降(<0.05)，培養(yǎng)前期土壤反硝化作用強(qiáng)烈(圖2A)。與W2和4%MB+W2處理相比，4%RB+W2處理的土壤NO–3-N含量更高。4%MB+W1處理的土壤NO–3-N含量在培養(yǎng)一周后逐漸增加并明顯高于4%MB+W2處理。添加玉米秸稈生物質(zhì)炭增加了土壤NH4+-N含量，而添加稻殼生物質(zhì)炭卻一定程度上降低了土壤NH4+-N含量，除4%MB+W2處理外，不同處理土壤樣品的NH4+-N含量在培養(yǎng)第1周內(nèi)均呈現(xiàn)下降趨勢(圖2B)，且整個(gè)培養(yǎng)期間4%MB+W2與4%MB+W1處理土壤的NH4+-N含量均顯著高于其他3種處理(<0.05)，均在第2周達(dá)到峰值，分別為177.6 mg/kg和157.0 mg/kg。W2與4%RB+W2處理的NH4+-N含量在培養(yǎng)第1周內(nèi)顯著下降后呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。方差分析也表明，不同處理、培養(yǎng)時(shí)間以及其交互作用均顯著影響土壤NO–3-N、NH4+-N含量(圖2，<0.05)。

(柱圖上方不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05))

(*和**表示各因素在P<0.05和P<0.01水平上影響顯著；下同)

2.3 土壤硝化反硝化功能基因豐度的動(dòng)態(tài)變化特征

硝化與反硝化功能基因的qPCR分析結(jié)果表明，土壤水分增加在一定程度上提高了基因豐度，且隨著秸稈生物質(zhì)炭添加量的增加，土壤基因豐度有所降低。培養(yǎng)期間各處理的土壤基因豐度在第1周顯著增加(<0.05)，與N2O排放通量變化特征相似，除W2處理外，豐度均達(dá)到對應(yīng)峰值(圖3A)。4%MB+W2處理的基因豐度顯著高于4%MB+W1處理(<0.05)。與W2處理相比，1%MB+W2和4%MB+W2處理的土壤基因豐度均有所增加，但后者豐度增量較前者低。4%RB+W2處理的基因豐度在培養(yǎng)初期大幅增加而后大幅下降，與土壤NO–3-N含量的變化特征一致。此外，研究結(jié)果表明，高水分狀況下添加兩種含量的秸稈生物質(zhì)炭都在一定程度上降低了基因豐度；4%RB+W2與4%MB+W1處理的土壤基因豐度顯著高于其他處理(<0.05，圖3B)，表現(xiàn)出極強(qiáng)的N2O還原潛力，培養(yǎng)期間各處理土壤的基因豐度均呈先上升后下降的趨勢。相關(guān)分析表明，基因豐度與NO–3-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(= –0.5，<0.05，表3)。

添加高量(4%)玉米秸稈生物質(zhì)炭顯著降低了AOB豐度。開始培養(yǎng)后，4%RB+W2、1%MB+W2和W2處理的土壤-AOB功能基因豐度迅速上升，顯著高于4%MB+W2和4%MB+W1處理(<0.05)，與土壤NH4+-N含量變化規(guī)律吻合。相關(guān)分析表明，N2O排放通量與-AOB基因豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(= 0.48，<0.05，表3)。除1%MB+W2處理外，4%RB+W2和W2處理的土壤-AOB基因豐度均在第1周達(dá)到峰值，分別為59.9×107和48.1×107copies/kg，之后呈緩慢降低趨勢。土壤-AOA功能基因豐度在第3周迅速上升，且4%RB+W2和1%MB+W2處理-AOA豐度在第3周達(dá)到峰值并顯著高于其他處理(<0.05)，其-AOA基因豐度分別為52.4×108和4.39×107copies/kg(圖3C、3D)。方差分析進(jìn)一步表明，不同處理、培養(yǎng)時(shí)間及其交互作用顯著影響了、、-AOA、-AOB功能基因豐度(<0.05)。

圖3 不同處理nirS、nosZ、amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度變化趨勢

3 討論

3.1 生物質(zhì)炭和土壤水分對土壤N2O排放的影響

硝化反硝化作用作為土壤N2O產(chǎn)生的主要途徑[25]，受水分、無機(jī)氮底物含量等多種因素影響。培養(yǎng)期間，4%MB+W1處理土壤N2O累積排放量顯著低于其他處理(<0.05)，NO–3-N含量在培養(yǎng)結(jié)束后達(dá)到峰值(圖2)，說明硝化作用可能是該黑土N2O產(chǎn)排的主要來源。各處理土壤N2O排放通量的峰值均出現(xiàn)在培養(yǎng)前期，這是由于前期大量輸入氮源和硝化反硝化作用底物，以及生物質(zhì)炭的施加促使微生物活性顯著增加[26]，而隨著反應(yīng)底物的消耗及微生物活性的降低，使得N2O通量大幅下降，這與Shi等[27]研究結(jié)果一致。

表3 N2O排放通量與土壤無機(jī)氮含量、amoA-AOA、amoA-AOB、nirS以及nosZ功能基因豐度間的相關(guān)關(guān)系(r)

注：*和**分別表示在<0.05和<0.01水平顯著相關(guān)。

生物質(zhì)炭添加對土壤N2O具有一定的減排潛力[28]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著秸稈生物質(zhì)炭添加量的增加，土壤N2O排放呈下降趨勢。施加生物質(zhì)炭為反硝化微生物提供了作用底物，促使微生物活性加強(qiáng)，從而促進(jìn)N2O排放[29]。但是生物質(zhì)炭本身呈堿性，隨著生物質(zhì)炭施加量的增大，土壤微區(qū)堿性可能有所增強(qiáng)，由于反硝化細(xì)菌最適宜的pH為7.0 ～ 7.5，進(jìn)而不利于土壤反硝化反應(yīng)的進(jìn)行，最終降低了N2O排放。同時(shí)，施加高量生物質(zhì)炭也會(huì)提高土壤C/N比，促使NH4+-N更多地被微生物同化固定從而弱化硝化作用產(chǎn)生的N2O[30-31]。不同原料類型生物質(zhì)炭對土壤性質(zhì)的影響也不相同，在100%WHC土壤水分狀況下，玉米秸稈生物質(zhì)炭顯著增加了土壤N2O排放，而稻殼生物質(zhì)炭則顯著降低了土壤N2O排放。這種差異一方面由于4% 高量稻殼生物質(zhì)炭添加極大地促進(jìn)了基因豐度增加而表現(xiàn)出更強(qiáng)的N2O還原潛力，進(jìn)而大量的N2O被還原為N2；另一方面也可能由于稻殼生物質(zhì)炭具有高比表面積和多孔隙結(jié)構(gòu)，其對土壤NO–3具有較強(qiáng)的吸附固定作用[32-33]，從而減少了反硝化過程的作用底物，進(jìn)而降低了土壤N2O排放。

3.2 不同水分模式下生物質(zhì)炭對硝化反硝化功能基因豐度的影響

硝化反硝化微生物作為土壤氮循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)者，其相關(guān)功能基因豐度的變化與土壤N2O排放規(guī)律有密切聯(lián)系[34]。本研究結(jié)果表明，不論是生物質(zhì)炭施加量多少，還是生物質(zhì)炭類型的不同，施加生物質(zhì)炭處理土壤的和功能基因豐度均在培養(yǎng)前期顯著增加(<0.05，圖3)，這是由于生物質(zhì)炭中含有的溶解性有機(jī)碳刺激反硝化微生物。一方面生物質(zhì)炭使豐度增加促進(jìn)了土壤反硝化進(jìn)程產(chǎn)生N2O，另一方面由于厭氧所帶來的強(qiáng)還原環(huán)境，進(jìn)一步加速了N2O還原為N2釋放到大氣中，推動(dòng)了土壤反硝化作用完全進(jìn)行[35]。有研究表明，當(dāng)土壤中溶解性有機(jī)碳的含量增加時(shí)，N2O排放隨之增多，這可能是由于溶解性有機(jī)碳為反硝化菌的活動(dòng)提供了物質(zhì)條件[36]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，4%MB+W1處理豐度顯著低于4%MB+W2處理，主要是由于厭氧環(huán)境促進(jìn)反硝化作用；而添加高量生物質(zhì)炭處理豐度均高于添加低量處理，推測高量生物質(zhì)炭添加極可能促進(jìn)了更完全的反硝化作用。Cayuela等[37]研究了15種農(nóng)業(yè)土壤后也指出，生物質(zhì)炭作為反硝化微生物的電子受體實(shí)現(xiàn)“電子穿梭”，把電子轉(zhuǎn)化到土壤反硝化微生物基團(tuán)中，促進(jìn)N2O還原為N2，降低N2O/(N2O+N2)的比例，進(jìn)一步證明了此觀點(diǎn)。4%RB+ W2處理土壤豐度在整個(gè)培養(yǎng)階段顯著高于4%MB+W2處理土壤，可能是由于稻殼生物質(zhì)炭碳氮元素組分和內(nèi)部結(jié)構(gòu)更有利于N2O還原微生物的生長繁殖。

生物質(zhì)炭添加可以通過影響NH4+-N、NO–3-N含量，進(jìn)而影響硝化作用功能基因-AOA、-AOB[38]以及反硝化作用功能基因、豐度(圖3)。在培養(yǎng)前期，5種處理土壤的-AOA功能基因豐度均處于較低水平，表明添加生物質(zhì)炭對-AOA豐度有抑制作用，但在培養(yǎng)階段后期，除W2處理-AOA豐度在整個(gè)培養(yǎng)階段穩(wěn)定變化外，其他4種施加生物質(zhì)炭的處理土壤-AOA豐度均發(fā)生較大幅度增加，這是由于生物質(zhì)炭的老化可以刺激土壤中氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌種群增長[39]。在培養(yǎng)初期，4%RB+W2、1%MB+W2和W2處理的土壤-AOB豐度迅速增加，這種情況與-AOA相反。相關(guān)分析進(jìn)一步表明，N2O排放通量與-AOB豐度呈正相關(guān)(= 0.48，<0.05，表3)，說明AOB在該土壤硝化過程中可能起重要作用。培養(yǎng)過程中，4MB%+W2處理土壤硝化作用功能基因豐度與4%MB+W1處理總體變化趨勢一致，說明土壤含水量對氨氧化作用，尤其是AOA的影響并不顯著。而在相同土壤含水量條件下，添加少量(1%)生物質(zhì)炭顯著提高了-AOA和-AOB豐度，添加較高量(4%)生物質(zhì)炭則相反，說明生物質(zhì)炭用量對土壤硝化作用的影響更加敏感[40]。也有可能是因?yàn)樯镔|(zhì)炭施加量的增大一定程度上提高了土壤系統(tǒng)堿性，與此同時(shí)，生物質(zhì)炭帶入的營養(yǎng)物質(zhì)和致密的多孔結(jié)構(gòu)為微生物創(chuàng)造良好棲息環(huán)境，進(jìn)而對硝化過程產(chǎn)生影響。高水分狀況下添加生物質(zhì)炭處理基因豐度顯著提高，但隨著生物質(zhì)炭添加量的提高豐度有所降低，添加高量稻殼生物質(zhì)炭處理基因豐度顯著提高，促進(jìn)反硝化作用最后一步而減少N2O排放；秸稈生物質(zhì)炭添加量對-AOB基因豐度有顯著影響。

4 小結(jié)

高土壤水分顯著促進(jìn)了土壤N2O排放。然而隨著秸稈生物質(zhì)炭的增加，土壤N2O排放呈下降趨勢，但不同類型生物質(zhì)炭添加下黑土展現(xiàn)出不同的N2O排放特征。在100%WHC土壤水分狀況下，玉米秸稈生物質(zhì)炭顯著增加了土壤N2O排放，而稻殼生物質(zhì)炭則顯著降低了土壤N2O排放。4% 高量稻殼生物質(zhì)炭添加下基因豐度顯著高于玉米秸稈生物質(zhì)炭添加，表現(xiàn)出更強(qiáng)的N2O還原潛力。

[1] Oertel C, Matschullat J, Zurba K, et al. Greenhouse gas emissions from soils—A review[J]. Geochemistry, 2016, 76(3): 327–352.

[2] IPCC.2021. Climate Change 2021: The physical science basis [M]. Cambridge, United Kingdom and New York, USA: Cambridge University Press.

[3] Trost B, Prochnow A, Baumecker M, et al. Effects of nitrogen fertilization and irrigation on N2O emissions from a sandy soil in Germany[J]. Archives of Agronomy and Soil Science, 2015, 61(5): 569–580.

[4] Garrido F, Hénault C, Gaillard H, et al. N2O and NO emissions by agricultural soils with low hydraulic potentials[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(5): 559–575.

[5] Oswald R, Behrendt T, Ermel M, et al. HONO emissions from soil bacteria as a major source of atmospheric reactive nitrogen[J]. Science, 2013, 341(6151): 1233–1235.

[6] 王連峰, 蔡祖聰. 淹水與濕潤水分前處理對旱地酸性土壤氧化亞氮和二氧化碳排放的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(8): 1736–1744.

[7] Szukics U, Abell G C J, H?dl V, et al. Nitrifiers and denitrifiers respond rapidly to changed moisture and increasing temperature in a pristine forest soil[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2010, 72(3): 395–406.

[8] Taghizadeh-Toosi A, Clough T J, Sherlock R R, et al. Biochar adsorbed ammonia is bioavailable[J]. Plant and Soil, 2012, 350(1/2): 57–69.

[9] 潘逸凡, 楊敏, 董達(dá), 等. 生物質(zhì)炭對土壤氮素循環(huán)的影響及其機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 24(9): 2666–2673.

[10] Li Y F, Hu S D, Chen J H, et al. Effects of biochar application in forest ecosystems on soil properties and greenhouse gas emissions: A review[J]. Journal of Soils and Sediments, 2018, 18(2): 546–563.

[11] Bakken L R, Bergaust L, Liu B B, et al. Regulation of denitrification at the cellular level: A clue to the understanding of N2O emissions from soils[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2012, 367(1593): 1226–1234.

[12] Lin Y X, Ding W X, Liu D Y, et al. Wheat straw-derived biochar amendment stimulated N2O emissions from rice paddy soils by regulating thegenes of ammonia- oxidizing bacteria[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 113: 89–98.

[13] Saarnio S, Heimonen K, Kettunen R. Biochar addition indirectly affects N2O emissions via soil moisture and plant N uptake[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 58: 99–106.

[14] Li B, Bi Z C, Xiong Z Q. Dynamic responses of nitrous oxide emission and nitrogen use efficiency to nitrogen and biochar amendment in an intensified vegetable field in southeastern China[J]. GCB Bioenergy, 2017, 9(2): 400–413.

[15] Wang J, Chen Z, Xiong Z, et al. Effects of biochar amendment on greenhouse gas emissions, net ecosystem carbon budget and properties of an acidic soil under intensive vegetable production[J]. Soil Use and Management, 2015, 31(3): 375–383.

[16] 程效義, 劉曉琳, 孟軍, 等. 生物炭對棕壤NH3揮發(fā)、N2O排放及氮肥利用效率的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 35(4): 801–807.

[17] 王先芳, 任天志, 智燕彩, 等. 添加生物炭改善菜地土壤氨氧化細(xì)菌群落并提高凈硝化率[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2020, 26(3): 502–510.

[18] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000.

[19] Wang L F, Cai Z C, Yan H. Nitrous oxide emission and reduction in a laboratory-incubated paddy soil response to pretreatment of water regime[J]. Journal of Environmental Sciences (China), 2004, 16(3): 353–357.

[20] 郭赟, 吳宇澄, 林先貴, 等. 3次連續(xù)重復(fù)提取DNA能較好反映土壤微生物豐度[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2012, 52(7): 894–901.

[21] Francis C A, Roberts K J, Beman J M, et al. Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing Archaea in water columns and sediments of the ocean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(41): 14683–14688.

[22] Rotthauwe J H, Witzel K P, Liesack W. The ammonia monooxygenase structural geneas a functional marker: Molecular fine-scale analysis of natural ammonia- oxidizing populations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(12): 4704–4712.

[23] Kloos K, Mergel A, R?sch C, et al. Denitrification within the genusand other associative bacteria[J]. Functional Plant Biology, 2001, 28(9): 991.

[24] Guo G X, Deng H, Qiao M, et al. Effect ofon denitrification activity and abundance and composition of denitrifying community in an agricultural soil[J]. Environmental Pollution, 2011, 159(7): 1886–1895.

[25] Song X T, Ju X T, Topp C F E, et al. Oxygen regulates nitrous oxide production directly in agricultural soils[J]. Environmental Science & Technology, 2019, 53(21): 12539–12547.

[26] 章驍劼. 生物炭、水分和氮源對農(nóng)田土壤N2O排放和相關(guān)微生物的影響[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2017.

[27] Shi Y L, Liu X R, Zhang Q W. Effects of combined biochar and organic fertilizer on nitrous oxide fluxes and the related nitrifier and denitrifier communities in a saline- alkali soil[J]. Science of the Total Environment, 2019, 686: 199–211.

[28] 趙光昕, 劉杏認(rèn), 張晴雯, 等. 施用生物炭對農(nóng)田土壤N2O的減排效應(yīng)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 37(12): 2872–2880.

[29] Ambus P, Skiba U, Butterbach-Bahl K, et al. Reactive nitrogen and greenhouse gas flux interactions in terrestrial ecosystems[J]. Plant and Soil, 2011, 343(1/2): 1–3.

[30] 馮政君. 不同環(huán)境條件下生物炭對土壤N2O排放的影響及機(jī)制[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2017.

[31] Nelson N O, Agudelo S C, Yuan W Q, et al. Nitrogen and phosphorus availability in biochar-amended soils[J]. Soil Science, 2011, 176(5): 218–226.

[32] 高德才, 張蕾, 劉強(qiáng), 等. 旱地土壤施用生物炭減少土壤氮損失及提高氮素利用率[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 54–61.

[33] 蓋霞普, 劉宏斌, 翟麗梅, 等. 玉米秸稈生物炭對土壤無機(jī)氮素淋失風(fēng)險(xiǎn)的影響研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 34(2): 310–318.

[34] 董成, 陳智勇, 謝迎新, 等. 生物炭連續(xù)施用對農(nóng)田土壤氮轉(zhuǎn)化微生物及N2O排放的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 53(19): 4024–4034.

[35] Troy S M, Lawlor P G, O’ Flynn C J, et al. Impact of biochar addition to soil on greenhouse gas emissions following pig manure application[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 60: 173–181.

[36] Liao X, Liu D Y, Niu Y H, et al. Effect of field-aged biochar on fertilizer N retention and N2O emissions: A field microplot experiment with 15N-labeled urea[J]. Science of the Total Environment, 2021, 773: 145645.

[37] Cayuela M L, Sánchez-Monedero M A, Roig A, et al. Biochar and denitrification in soils: When, how much and why does biochar reduce N2O emissions? [J]. Scientific Reports, 2013, 3: 1732.

[38] 侯海軍, 秦紅靈, 陳春蘭, 等. 土壤氮循環(huán)微生物過程的分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究, 2014, 35(5): 588–594.

[39] Zhang X, Duan P P, Wu Z, et al. Aged biochar stimulated ammonia-oxidizing Archaea and bacteria-derived N2O and NO production in an acidic vegetable soil[J]. Science of the Total Environment, 2019, 687: 433–440.

[40] 李雙雙, 陳晨, 段鵬鵬, 等. 生物質(zhì)炭對酸性菜地土壤N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2018, 24(2): 414–423.

Effects of Biochar on N2O Emission and Nitrification-denitrification Gene Abundances Under Two Water Status in Black Soils

SU Xingyuan1, WU Shijie1, GAO Wei1,2, MA Junling1, XIE Hongtu3, BAO Xuelian3, WANG Lianfeng1*

(1 School of Environment and Chemical Engineering, Dalian Jiaotong University, Dalian, Liaoning 116028, China; 2 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 3 Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China)

In the laboratory incubation, the effects of different biochars (maize straw biochar, rice husk biochar) and application rates (0%, 1% and 4%,/) on N2O emissions and nitrification-denitrification functional gene abundances under different soil moistures (40%WHC and 100%WHC) were investigated by soil microcosm experiment in a typical black soil region in Lishu County, Jilin Province. The results show that soil N2O emissions tends to decrease with increasing straw biochar. 4% straw biochar addition results in only 33.9% of soil N2O emissions as compared to 1% biochar addition. Soil NO–3-N also shows a similar pattern, significantly lower at 4% biochar addition than at 1% biochar addition. Under 100%WHC, maize straw biochar significantly increases soil N2O emissions, while rice husk biochar significantly reduces soil N2O emissions. Real-time fluorescence quantitative PCR further confirms that high soil moisture promotes soil denitrification by increasinggene abundance, whilegene abundance is significantly higher under 4% rice husk biochar addition than maize straw biochar addition, showing greater N2O reduction capacity. Although the-AOA genes are insignificantly different at different biochar additions, the-AOB gene is significantly decreased at high maize straw biochar addition. Soil moisture content, biomass char species and their addition amount affect soil N2O emissions by affecting soil nitrification and denitrification microorganisms.

Northeast black soil; Soil moisture; Biochar; N2O emissions; Nitrification and denitrification genes

S19

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.05.008

蘇星源, 吳世杰, 高威, 等. 兩種水分含量下生物質(zhì)炭對黑土N2O排放及硝化反硝化基因豐度的影響. 土壤, 2022, 54(5): 928–935.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41471205，41977048)和遼寧省百千萬人才工程項(xiàng)目(2019B39)資助。

(wanglfdl@aliyun.com)

蘇星源(1999—)，男，遼寧鞍山人，碩士研究生，主要從事土壤溫室氣體產(chǎn)排機(jī)理研究。E-mail：t1223058966@qq.com