洪汝丹,劉思彤,賀琪楠,羅云燕,朱俊潔,艾志瓊,尹家祥

Q熱是一種由貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii, 簡(jiǎn)稱Cb)所引起的人獸共患病，在世界范圍內(nèi)廣為流行。Q熱所引起的持續(xù)性慢性感染尤為嚴(yán)重，其中心內(nèi)膜炎、血管持續(xù)感染和Q熱疲勞綜合征等感染癥狀備受關(guān)注[1]。反芻動(dòng)物牛羊被認(rèn)為是感染人類Q熱的主要來源[2]。嚙齒動(dòng)物是Cb重要的儲(chǔ)存宿主[3]。有研究顯示Cb在嚙齒動(dòng)物中的陽性率與反芻動(dòng)物的Cb感染率存在一定相關(guān)性[4-5]。目前，已在35種不同的嚙齒動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了Cb感染的證據(jù)，分屬26個(gè)不同的種屬[6]。有研究認(rèn)為，在疫源地受到Cb感染的嚙齒動(dòng)物會(huì)通過遷徙行為聚集在農(nóng)場(chǎng)附近，因?yàn)檗r(nóng)作物會(huì)作為它們度過秋冬季的食物來源，而此時(shí)正是反芻動(dòng)物繁殖的時(shí)期，Cb在孕獸體內(nèi)的感染機(jī)制會(huì)進(jìn)一步被激活，從而認(rèn)為嚙齒動(dòng)物是Cb感染反芻動(dòng)物的真正來源[7]。此外，物種特異性生態(tài)群落結(jié)構(gòu)和棲息地環(huán)境需求可以決定宿主和病媒接觸的概率，即使同一屬的物種之間Q熱感染狀況也會(huì)有所差異[8]。

滇西鼠疫疫源地鼠形動(dòng)物種類豐富，物種復(fù)雜多樣，適于各類人獸共患病宿主動(dòng)物、媒介昆蟲的生存繁殖和病原體的維持傳播，疫源地還存在著家鼠和野鼠不同類型的鼠疫疫源地，在進(jìn)化中形成特有的生物群落結(jié)構(gòu)[9]。在這種特殊的生物地理群落中鼠形動(dòng)物Q熱的流行分布如何未見報(bào)道，為此，本研究通過滇西鼠疫疫源地中捕獲的野外鼠形動(dòng)物采用巢式PCR對(duì)鼠形動(dòng)物肝/脾臟組織DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增的陽性DNA片段測(cè)序和序列分析，旨在調(diào)查此地區(qū)野外鼠形動(dòng)物Cb的感染情況，加強(qiáng)滇西鼠疫疫源地Q熱的防控，對(duì)降低Q熱等人獸共患病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2015年12月至2016年10月，以野鼠鼠疫疫源地云南省玉龍縣和劍川縣，家鼠鼠疫疫源地云南省梁河縣為采樣點(diǎn)，玉龍鼠疫疫源地以文筆山及周圍地區(qū)，劍川鼠疫疫源地以石龍、東山地區(qū)，梁河鼠疫疫源地以芒東、河西、囊宋等地區(qū)為采樣調(diào)查區(qū)域。在不同季節(jié)(春、夏、秋、冬)、不同海拔梯度(玉龍鼠疫疫源地以海拔2 800 m劃分；劍川鼠疫疫源地以海拔2 450 m劃分；梁河鼠疫疫源地以海拔1 000 m～、1 200 m～及海拔1 400～1 910 m劃分)、不同生境(耕地、林地、灌叢、耕地林地/耕地灌叢交界)，使用夾夜法進(jìn)行野外捕鼠，以花生為誘餌，沿一定地勢(shì)放置鼠夾，傍晚放置，晨起收集捕獲的鼠形動(dòng)物。

1.2 樣本處理及鼠種鑒定 捕獲的鼠形動(dòng)物帶回實(shí)驗(yàn)室后根據(jù)其外形進(jìn)行分類鑒定。用75%酒精擦拭鼠形動(dòng)物的體表，于生物安全柜內(nèi)無菌解剖，取肝臟和脾臟存于-40 ℃?zhèn)溆?。共獲取2 524份肝脾樣本，對(duì)采集的肝脾樣本進(jìn)行DNA提取時(shí)，優(yōu)先使用脾臟，若脾臟因在捕獲鼠形動(dòng)物過程中受損，則選擇肝臟進(jìn)行DNA提取。

1.3 DNA提取和巢式PCR擴(kuò)增 用無菌眼科剪將野外鼠形動(dòng)物的肝/脾樣本取5～10 mg組織，使用磁珠法微量細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒及全自動(dòng)核酸自動(dòng)提取儀(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行DNA提取。

采用巢氏PCR來擴(kuò)增目的CbCom1基因片段。通過兩輪擴(kuò)增，外引物為Com1 F1和Com1 R1，內(nèi)引物為Com1 F2和Com1 R2(見表1)[10]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所提供的Cb國際標(biāo)準(zhǔn)菌株序列RSA493為陽性對(duì)照物，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和表3。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳條件為電壓120 V、電流80 mA，電泳30 min，加樣量3 μL/孔。使用Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(美國Thermo Fisher Scientific 公司)和DNA MarkerI(北京 Biomed 公司)，三通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的測(cè)序送上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 Cb Com1基因巢氏PCR引物Tab.1 Nested PCR primers for Cb Com1

表2 Cb Com1基因巢氏PCR反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of nested PCR for Cb Com1

1.4 測(cè)序與統(tǒng)計(jì)分析 登錄(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，將測(cè)序成功的陽性序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，運(yùn)用軟件Megalign和MEGA7.0分析Cb的

表3 Cb Com1巢氏PCR反應(yīng)條件Tab.3 Reaction conditions of nested PCR for Cb Com1

同源性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探索其進(jìn)化來源。應(yīng)用Excel 2010和SPSS20.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析不同疫源地鼠種、性別、生境、海拔梯度、季節(jié)等因素Cb在野外鼠形動(dòng)物的流行分布情況(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物Cb感染情況 共檢測(cè)2 524份DNA樣本，Cb陽性樣本23份，陽性率為0.91%。有2目4科7屬8種野外鼠形動(dòng)物檢測(cè)出Cb陽性，分別是齊氏姬鼠0.64%(5/780)、中華姬鼠2.19%(6/274)、黃胸鼠0.54%(1/184)、社鼠3.64%(2/55)、錫金小鼠1.37%(1/73)、大絨鼠1.03%(5/485)、臭鼩鼱4.08%(2/49)、毛猬1.96%(1/51)，見表4。

表4 滇西鼠疫疫源地不同種類野外鼠形動(dòng)物Cb感染情況Tab.4 Cb infection in wild small mammals of different species in the natural plague foci of western Yunnan

2.2 不同疫源地、海拔梯度、生境、季節(jié)及性別間Cb感染情況 玉龍鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率為0.34%，劍川鼠疫疫源地為1.46%，梁河鼠疫疫源地為0.80%，3個(gè)疫源地野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率不同(χ2=6.575，P=0.037)，劍川鼠疫疫源地Cb陽性率高于玉龍鼠疫疫源地(P<0.017)，其余疫源地兩兩比較無差異。玉龍鼠疫疫源地海拔2 800 m以下和2 800 m以上野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率分別為0.51%和0.30%(P>0.05)。劍川鼠疫疫源地海拔2 450 m以下和2 450 m以上野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率分別為0.13%和4.64%，海拔梯度2 450 m以上Cb陽性率高于2 450 m以下(χ2=28.504，P<0.001)。梁河鼠疫疫源地海拔1 000～1 200 m、1 200～1 400 m和1 400～1 910 m野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率分別為0.56%、0.48%和1.27%(P>0.05)。不同生境野外鼠形動(dòng)物的Cb陽性率耕地、林地、灌叢、耕地林地/耕地灌叢交界分別為1.09%、0.61%、0%和1.94%，不同生境Cb感染無差異(P=0.071)。野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率春季為2.44%，夏季0.55%，秋季0.37%，冬季0.62%，不同季節(jié)Cb陽性率不同(χ2=17.730，P=0.001)，春季高于秋季(P<0.008)，其余季節(jié)兩兩比較無差異。Cb陽性率雄性為0.96%，雌性為0.86%，性別間Cb感染差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.076，P=0.782)。(見表5)。

表5 不同影響因素野外鼠形動(dòng)物Cb感染情況Tab.5 Cb infection in wild small mammals of different influencing factors

2.3 CbCom1基因同源性分析 滇西鼠疫疫源地樣本內(nèi)部的同源性為98.9%～100%。選取部分有代表性的參考序列與滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物樣本測(cè)序序列一同構(gòu)建同源性分析圖，結(jié)果顯示本次調(diào)查所得到的基因序列與來自伊朗單峰駱駝(MH373681)、韓國長(zhǎng)角血蜱類(AY342038)、美國安氏革蜱(Z11828)、保加利亞歐柳鶯(MH703039)、俄羅斯全溝硬蜱(MH703042)、中國云南YS-8菌株(AF318148)和中俄邊境黑瞎子島嚙齒動(dòng)物(JX522479)的Cb序列同源性都在99.0%以上。與美國海獅的胎盤中檢出的Cb序列GU797241的同源性為96.3%～96.8%，與澳大利亞淡水小龍蝦螯蝦立克次體序列EF413062的同源性為90.7%～91.2%(見圖1)。

圖1 Cb Com1基因片段同源性分析Fig.1 Homology analysis of the Com1 gene fragment of Cb

2.4 CbCom1基因系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)BLAST匹配對(duì)比分析，23份陽性樣本Com1基因序列和GenBank收錄的部分參考序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示所有樣本和參考序列都隸屬于一個(gè)大分支，和中俄邊境黑瞎子島嚙齒動(dòng)物(JX522479)、意大利囊形扇頭蜱類(KT071010)、中國云南YS-8菌株(AF318148)、俄羅斯全溝硬蜱(MH703042)、澳大利亞條紋袋鼠(HM804027)、澳大利亞淡水小龍蝦螯蝦(EF413062)、保加利亞歐柳鶯(MH703039)、印度荷斯坦牛黑白花奶牛(MK902739)、印度牛(MK902734)、美國安氏革蜱(Z11828)、韓國長(zhǎng)角血蜱類(AY342038)、伊朗單峰駱駝(MH373681、MH373682)構(gòu)成一個(gè)小分支。雖然美國海獅的胎盤中檢出的序列GU797241和HM237793與以上參考序列和樣本呈現(xiàn)出一定的差異性，但仍隸屬于相同小分支。另一小分支為伊朗鴿銳緣蜱檢出的類柯克斯體內(nèi)共生體MF359024，與上述分支里的意大利囊形扇頭蜱類(KT071010)和韓國長(zhǎng)角血蜱類(AY342038)相比，提示類柯克斯體內(nèi)共生體在不同地區(qū)不同蜱種之間存在一定的差異性；與外群俄羅斯Cb菌種質(zhì)粒QpDV的開放閱讀框架(ORF)的片段序列X84772為不同分支(見圖2)。

注：■玉龍鼠疫疫源地樣本 ▲劍川鼠疫疫源地樣本 ●梁河鼠疫疫源地樣本圖2 基于Cb Com1基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the Com1 gene fragment of Cb

3 討 論

Q熱在世界范圍內(nèi)是一種廣為流傳的人獸共患病，且宿主動(dòng)物眾多。至今發(fā)現(xiàn)野生動(dòng)物能自然感染Q熱者已達(dá)90種以上，其中以嚙齒類動(dòng)物最多[11]。國內(nèi)報(bào)道，在眾多嚙齒動(dòng)物中，喜馬拉雅旱獺、達(dá)烏利亞黃鼠、褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠、黑線姬鼠、大林姬鼠、灰倉鼠、社鼠等被檢測(cè)出Cb感染；國外報(bào)道感染Cb的嚙齒動(dòng)物多達(dá)26屬35種，遍布亞洲、非洲、歐洲和北美洲[12]。在本次滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物Cb感染的調(diào)查中，齊氏姬鼠、中華姬鼠、錫金小鼠、大絨鼠、臭鼩鼱、毛猬為首次檢測(cè)出Q熱病原體Cb，尤其是食蟲目中的臭鼩鼱和毛猬，提示存在Cb感染的鼠形動(dòng)物并不僅僅局限于嚙齒目動(dòng)物。在世界各國對(duì)嚙齒動(dòng)物Cb感染情況的調(diào)查分析中，褐家鼠的Cb陽性率最高[13]，但在本次實(shí)驗(yàn)中并未在褐家鼠中檢出陽性，這可能與被檢測(cè)的褐家鼠樣本較少有關(guān)。

滇西鼠疫疫源地不同生境(耕地、林地、灌叢、耕地林地/耕地灌叢交界)野外鼠形動(dòng)物Cb感染除灌叢外，其余3種生境里都檢出了野外鼠形動(dòng)物存在Cb感染。有血清學(xué)實(shí)驗(yàn)研究指出野生嚙齒動(dòng)物的Q熱感染情況和綿羊的Cb感染率相關(guān)，與家畜(牛羊等動(dòng)物)共享?xiàng)h(huán)境的野生嚙齒動(dòng)物有更高的Cb陽性率；但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)沒有與家畜接觸的生境中，嚙齒動(dòng)物也存在Cb感染的情況(如生活在灌木叢內(nèi))，但陽性率極低，說明嚙齒動(dòng)物在疫源地對(duì)維持Q熱在自然界的循環(huán)起到一定作用[12]。有研究顯示野外鼠形動(dòng)物的Cb帶菌狀態(tài)和它們所在的生存環(huán)境存在一定的關(guān)聯(lián)[14]。但針對(duì)野外鼠形動(dòng)物不同生境Cb感染狀況的研究極少，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也缺乏相關(guān)系統(tǒng)的研究報(bào)道做一些對(duì)比分析。劍川鼠疫疫源地的Cb陽性率高于玉龍鼠疫疫源地，玉龍和劍川鼠疫疫源地同屬于野鼠鼠疫疫源地，在地理環(huán)境特征，生態(tài)群落結(jié)構(gòu)方面都極其類似，但在野外鼠形動(dòng)物Q熱流行分布上卻不同，這可能與兩大疫源地之間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在一定的差異有關(guān)。滇西鼠疫疫源地春季野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率高于秋季。在以人為基礎(chǔ)的Q熱研究中，春季是Q熱的高發(fā)季節(jié)，其中的高危因素是與反芻動(dòng)物接觸，從而導(dǎo)致Cb感染率的季節(jié)性上升，這一結(jié)論與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致[15]，滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物春季Cb感染情況是否與反芻動(dòng)物的接觸有關(guān)，這一點(diǎn)還缺乏更為系統(tǒng)的調(diào)查。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)滇西鼠疫疫源地宿主動(dòng)物寄生蚤的季節(jié)消長(zhǎng)規(guī)律與此次野外鼠形動(dòng)物Cb感染情況存在一定的聯(lián)系，滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物的Cb感染情況可能與一些節(jié)肢動(dòng)物的生活史規(guī)律、季節(jié)消長(zhǎng)規(guī)律、宿主寄生嗜性和宿主生活狀態(tài)有一定關(guān)聯(lián)[16]。蜱通常被認(rèn)為是Cb感染反芻動(dòng)物和野生動(dòng)物的傳播媒介，也是維持其傳播的載體，甚至可以直接將Cb傳播給人類，有研究顯示，野生鼠形動(dòng)物→蜱→家畜的關(guān)系鏈存在于不同的地理環(huán)境中，使得Q熱在不同宿主動(dòng)物中的流行分布更加開放多元化[17]。因此，監(jiān)測(cè)宿主動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物之間的季節(jié)消長(zhǎng)情況有利于探索動(dòng)物群落的動(dòng)態(tài)變化與Q熱流行分布的內(nèi)在結(jié)構(gòu)規(guī)律。不同海拔梯度野外鼠形動(dòng)物Cb感染情況，劍川疫源地的高海拔地區(qū)野外鼠形動(dòng)物有較高的陽性率，這與章域震等[18]研究所得出的Q熱流行分布在云南省南部和西部相對(duì)低海拔地區(qū)和江河峽谷地區(qū)的結(jié)論有所不同，在云南以往的研究中，針對(duì)Q熱的研究對(duì)象，主要是一些大型的反芻動(dòng)物如牛羊等，且采樣地多聚集在低海拔地區(qū)，因此系統(tǒng)地調(diào)查Q熱在不同宿主動(dòng)物不同海拔梯度中的流行分布情況，將會(huì)使Q熱疫情動(dòng)態(tài)監(jiān)控更加全面具體。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果23份Cb陽性樣本Com1基因測(cè)定序列同源性分析顯示，除美國海獅的胎盤中檢出的Cb序列GU797241和澳大利亞淡水小龍蝦螯蝦立克次體序列EF413062外，其余參考序列與滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物樣本的同源性為98.9%～100%，說明在世界范圍內(nèi)CbCom1基因片段高度保守。進(jìn)化分析顯示所測(cè)序列與云南YS-8菌株序列[19]同屬一支，其同源性分析達(dá)100%，提示滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物存在的Cb感染狀況對(duì)人類存在一定的致病風(fēng)險(xiǎn)，但CbCom1基因因其進(jìn)化的高度保守性，還需一些更為系統(tǒng)的研究來闡述這個(gè)問題。

本研究通過Com1基因擴(kuò)增檢測(cè)滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物的Cb陽性情況，該基因?qū)儆趩慰截惢?，其序列高度保守，是分子系統(tǒng)學(xué)中的一種極有價(jià)值的分子標(biāo)記，在構(gòu)建生命樹的主干及主干和末梢之間的分枝中具有重要的作用。相對(duì)于多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)分析[20]、單核苷酸多態(tài)性分型[21]等高精度分型方法來說，使用單拷貝基因Com1檢測(cè)Cb相對(duì)單一。目前宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)在Cb感染檢測(cè)中逐漸興起，有研究通過mNGS對(duì)珠海市某醫(yī)院不明原因急性發(fā)熱患者的血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了mNGS是一種可靠、有效的實(shí)驗(yàn)室診斷Q熱的方法[22]。Jiao Jun等[23]使用mNGS對(duì)云南微小裂頭蚤的DNA樣本進(jìn)行快速評(píng)估，再使用PCR結(jié)合DNA測(cè)序分析來鑒定Cb在云南微小裂頭蚤中的感染。Cb分子檢測(cè)方法多樣，但也存在著方法造價(jià)昂貴，能否快速簡(jiǎn)便檢測(cè)等的問題。而Cb菌株分子特征對(duì)于比較不同動(dòng)物物種的基因型、追蹤疾病暴發(fā)和評(píng)估毒株基因型與毒力之間的關(guān)系至關(guān)重要，因此，尋求精確快速簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的Cb分型檢測(cè)方法也是未來需要繼續(xù)深入研究的問題。

綜上，滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物Cb陽性率較低，但野外鼠形動(dòng)物Cb感染廣泛，其中齊氏姬鼠、中華姬鼠、錫金小鼠、大絨鼠、臭鼩鼱、毛猬為首次檢測(cè)出Q熱病原體Cb。CbCom1基因片段在野外鼠形動(dòng)物中呈現(xiàn)出高度保守的流行與分布。鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物Cb感染的調(diào)查，對(duì)有效防控人群的Q熱感染有重要意義。

利益沖突：無

引用本文格式：洪汝丹,劉思彤,賀琪楠,等. 滇西鼠疫疫源地野外鼠形動(dòng)物感染貝氏柯克斯體的調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：1031-1038. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.146